Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

17.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57782

⸱

20 juni 2018

 ,  , 
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

In dit artikel

Samenvatting

Hier bespreken we een serie van protocollen voor de inductie en validatie van cellulaire senescentie in gekweekte cellen. Wij richten op verschillende senescentie-inducerende prikkels en de kwantificering van gemeenschappelijke senescentie-geassocieerde markers te beschrijven. Wij bieden technische details met behulp van fibroblasten als een model, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan verschillende cellulaire modellen.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is een staat van permanente celcyclus arrestatie geactiveerd in reactie op andere schadelijke stimuli. Activering van cellulaire senescentie is een kenmerk van verschillende pathofysiologische omstandigheden waaronder tumor onderdrukking, weefsel remodeling en veroudering. De inductoren van cellulaire senescentie in vivo worden nog steeds slecht gekenmerkt. Een aantal stimuli kan echter worden gebruikt ter bevordering van cellulaire senescentie ex vivo. Onder hen zijn de meest voorkomende senescentie-inductoren Dr. uitputting, ioniserende en niet-ioniserende straling, genotoxische drugs, oxidatieve stress, demethylating en acetylerend agenten. Hier, zullen we geen gedetailleerde instructies over het gebruik van deze prikkels voor het opwekken van fibroblasten in senescentie. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor verschillende soorten primaire cellen en cellijnen, met inbegrip van kankercellen. Ook beschrijven we de verschillende methoden voor de validatie van senescentie inductie. In het bijzonder richten we ons op het meten van de activiteit van de lysosomale enzym senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), het tempo van de DNA synthese met behulp van de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) opneming assay, de niveaus van meningsuiting van de celcyclus remmers p16 en p21, en de expressie en secretie van leden van de Senescence-Associated secretoire fenotype (SASP). Tot slot, wij bieden voorbeeld resultaten en toepassingen van deze protocollen verder te bespreken.

Inleiding

In 1961, Hayflick en Moorhead gemeld dat primaire fibroblasten in cultuur hun proliferatieve potentieel na opeenvolgende doorgangen1 verliezen. Dit proces wordt veroorzaakt door de sequentiële verkorting van telomeren na elke celdeling. Als telomeren een kritisch korte tijdsduur bereikt heeft, ze worden herkend door de reactie van DNA-schade (DDR) dat een onomkeerbare arrestatie van proliferatie activeert — ook gedefinieerd als Dr. senescentie. Dr. senescentie is momenteel een van de vele prikkels die bekend zijn voor het opwekken van een staat van permanente celcyclus arrestatie maakt cellen ongevoelig mitogenen zowel apoptotic signalen2,3. Het programma senescentie wordt normaal gesproken gekenmerkt door extra functies waaronder lysosomale hoogactieve, mitochondriale dysfunctie, nucleaire veranderingen, herschikkingen van de chromatine, endoplasmatisch reticulum-stress, DNA-schade en een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)3,4. Verouderend cellen hebben meerdere functies in het lichaam: ontwikkeling, wond genezing en tumor onderdrukking2. Ze zijn ook bekend te spelen een belangrijke rol in veroudering en, paradoxaal genoeg, tumor progressie5. De negatieve, en deels tegenstrijdige gevolgen van senescentie worden vaak toegeschreven aan de SASP6.

Onlangs, werd aangetoond dat afschaffing van verouderend cellen uit muizen tot verlenging van de levensduur en tot afschaffing van veel van de veroudering functies7,8,9,10,11, leidt 12. op dezelfde manier, meerdere geneesmiddelen zijn ontwikkeld om op te heffen ofwel verouderend cellen (senolytics) of te richten op de SASP13,14. De therapeutische mogelijkheden van anti-veroudert heeft onlangs trok meer aandacht aan het veld.

De studie van de mechanismen die zijn gekoppeld aan cellulaire senescentie en de screenings voor farmacologische interventies zwaar afhankelijk van ex vivo modellen, met name op de menselijke primaire fibroblasten. Hoewel er sommige gemeenschappelijke functies geactiveerd door uiteenlopende senescentie inductoren, is een grote variabiliteit in het fenotype senescentie waargenomen en afhankelijk van verschillende factoren, waaronder cel type, stimulans en punt3,15, 16,17. Het is noodzakelijk te overwegen de heterogeniteit voor studeren en targeting verouderend cellen. Daarom heeft dit protocol tot doel een aantal methoden die worden gebruikt voor het opwekken van senescentie in primaire fibroblasten met behulp van verschillende behandelingen. Zoals het zal worden verklaard, kunnen de methoden gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypes.

Afgezien van Dr. senescentie, beschrijven we de vijf andere senescentie-inducerende behandelingen: ioniserende straling en ultraviolette (UV) straling, Doxorubicine, oxidatieve stress, epigenetische veranderingen (namelijk bevordering van Histon acetylation of DNA demethylatie) . Zowel, ioniserende straling en UV-straling veroorzaken directe DNA-beschadiging en, in de juiste dosis, trigger senescentie18,19. Doxorubicine ook senescentie voornamelijk door middel van DNA-schade veroorzaakt door het intercalating in het DNA en verstoren topoisomerase II functie en dus stoppen DNA herstellen mechanismen20. De expressie van genen essentieel voor senescentie wordt normaal bestuurd door Histon acetylation en methylation van DNA. Dientengevolge, histone deacetylase remmers (bijvoorbeeldnatrium butyraat en SAHA) en DNA demethylating (bijvoorbeeld 5-aza) agenten leiden tot senescentie in anders normale cellen21,22.

Tot slot, vier van de meest voorkomende markeringen geassocieerd met verouderend cellen zal worden verklaard: activiteit van de senescentie verbonden-β-galactosidase (SA-β-gal), tarief voor DNA-synthese door EdU opneming assay, overexpressie van de celcyclus regelgevers en cycline-afhankelijk kinase remmers p16 en p21, overexpressie en secretie van leden van de SASP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. algemene voorbereiding

  1. D10 medium voor te bereiden. Aanvulling DMEM middellange-Glutamax met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine (eindconcentratie: 100 U/mL).
  2. Steriele PBS te bereiden. Los de tabletten in water volgens de instructies van de fabrikant. Steriliseren in autoclaaf.
  3. 1 x trypsine voor te bereiden. Verdun 5 mL trypsine-Versene EDTA/10 x 1:10 in 45 mL steriele PBS.
    Opmerking: In het gehele protocol, we gebruiksvoorwaarden cel cultuur die zich dichter bij de fysiologische voorwaarden voor primaire fibroblasten. Dit betekent dat we cellen bij 37 ° C en 5% CO2 broeden zoals normaal gedaan maar met 5% O2 in plaats van de "standaard" 20% O2.
  4. Alle monsters onder steriele omstandigheden verwerken met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.

2. de inductie van senescentie

  1. Dr. senescentie
    1. Tijdens het verwerken van cellen of enig materiaal dat met hen in contact worden zal (pipets, kolven, media, enz.), werken onder steriele condities, met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.
    2. Zaad 7 x 105 levensvatbare primaire fibroblasten in een lage populatieverdubbelingstijd (PD) in een maatkolf van T75 (~9.3 x 103 cellen/cm2) met 10 mL D10.
    3. De cellen in een cel incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2 groeien totdat ze 70 – 80% samenvloeiing (3-4 dagen voor delende culturen in een lage PD).
    4. Loskoppelen van de cellen met behulp van 3 mL 1 x trypsine en broeden voor ~ 5 – 7 min in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2. Regelmatig toezicht op de cellen met een cel cultuur Microscoop om te controleren het ontkoppelen proces.
    5. Wanneer cellen bolvormige zijn, stopt u de trypsine reactie door toevoeging van 9 mL D10. Incubeer niet langer dan 10 min.
    6. Draai de cellen bij 300 x g voor 5 min. cellen een pellet aan de onderkant van de buis, vormen terwijl puin en kleinere deeltjes in het supernatant blijven.
    7. Verwijder het supernatant en los de cel pellet in 1 mL D10 en uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een geautomatiseerde cel counter volgens de aanwijzingen van de fabrikant of een Neubauer-kamer voor het handmatig tellen. Terwijl tot nu toe, zijn onder andere een test om te controleren de levensvatbaarheid van de cellen (bijvoorbeeld, Trypan blauw uitsluiting23).
    8. Berekent de cumulatieve PD met behulp van deze formule:
      Nieuwe PD = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (celaantal ontpit)) + PDold
      Cel nummer totaal = alle cellen geteld: dood en levend.
      Cel nummer ontpit = aantal levensvatbare cellen zaadjes (8 x 105 cellen).
      Oude PD = populatieverdubbelingstijd op het moment van zaaien.
      Nieuwe PD = populatieverdubbelingstijd op het moment van tellen (na incubatie).
      Opmerking: Als 7 x 105 primaire fibroblasten (PD 35,2) werden zaadjes op een T-75 kolf en na 4 dagen ze 80% samenvloeiing bereiken en opnieuw worden gesplitst, tellen nu 1.3 x 106 totaal aantal cellen (dode + levend).
      Nieuwe PD = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      Nieuwe PD = 36,1
    9. Reseed 8 x 105 cellen in een nieuwe T75, herhalende stappen 2.1.2–2.1.8.
      Opmerking: Na meerdere opeenvolgende doorgangen, de cultuur zal langer duren om confluente totdat cellen stopt helemaal te verdelen. Eenmaal cellen stoppen verdelen, test voor senescentie markeringen en/of oogst voor downstream toepassingen.
    10. Overwegen dat de grotere omvang van verouderend cellen de cultuur te verschijnen volledige en nog een aantal laag cellen kan veroorzaken. Dus, senescentie kan worden aangenomen als de PD stabiel is en andere senescentie markeringen in de cultuur weergegeven (Zie protocollen 3.1-3.5).
      NB: Gebruik prolifererende primaire fibroblasten als besturingselement.
  2. Ioniserende straling veroorzaakte senescentie
    1. Tijdens het verwerken van cellen of enig materiaal dat zal worden in contact met hen (pipets, kolven, media, enz.), werken onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.
    2. Zaad 7 x 105 levensvatbare primaire fibroblasten in een lage PD in een maatkolf van T75 (~9.3 x 103 cellen/cm2) met 10 mL D10.
    3. Incubeer de cellen overnachting in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    4. Bloot de cellen 10 grijs van gamma bestraling volgens de instructies van de machine in gebruik.
    5. Het medium van de cellen gecombineerd en vervangen met 10 mL D10.
    6. Incubeer de cellen in 10 mL D10 in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2 voor een ander 10 dagen ter vervanging van het medium regelmatig, ongeveer om de 3 dagen.
    7. Na 10 dagen testen voor senescentie markeringen en/of de cellen gebruiken voor de downstream toepassingen.
      NB: Gebruik prolifererende primaire fibroblasten van de dezelfde PD (vóór bestraling) als besturingselement.
  3. Ultraviolet (UV) geïnduceerde straling senescentie
    1. Tijdens het verwerken van cellen of enig materiaal dat zal worden in contact met hen (pipets, kolven, media, enz.), werken onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.
    2. Zaad 1,5 – 2 x 105 levensvatbare primaire fibroblasten in een lage PD in een put van een 6-well plaat (1.5-2,0 x 104 cellen/cm2), voeg 2 mL van D10 medium.
    3. Plaats de cellen in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO,2 en 5% O2 en laat ze zich te houden aan het plastic voor ten minste 5 uur.
    4. Het medium opstijgen uit de cellen. Plaats de 6-well-plaat in het midden van de kamer van de UV-straling en de plastic deksel opstijgen. Bestralen met UVB, 20-30 mJ/cm2.
    5. Voeg toe 2 mL medium per putje.
    6. Incubeer de cellen in 2 mL zuiver D10 in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO,2 en 5% O2 andere 7 dagen vervanging van het medium regelmatig, ongeveer om de 3 dagen.
      Opmerking: Na 7 dagen, cellen kunnen worden getest voor senescentie markeringen en gebruikt voor downstream toepassingen. Delende primaire fibroblasten van de dezelfde PD (vóór bestraling) gebruiken als besturingselement.
  4. Doxorubicine-geïnduceerde senescentie
    1. 1000 x Doxorubicine stockoplossing bereiden: Maak een voorraad van 250 µM van Doxorubicine in 1 x PBS, filter-steriliseren de oplossing en aliquot in 500 µL per steriele buis. Winkel de Doxorubicine voorraad bij-80 ° C.
    2. Tijdens het verwerken van cellen of enig materiaal dat zal worden in contact met hen (pipets, kolven, media, enz.), werken onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.
    3. Zaad 7 x 105 levensvatbare primaire fibroblasten in een lage PD in een maatkolf van T75 (~9.3 x 103 cellen/cm2) met 10 mL D10.
    4. Incubeer de cellen overnachting in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    5. Verdun 11 µL van de 1.000 x Doxorubicine stockoplossing in 11 mL D10 om een eindconcentratie van 250 nM.
    6. Het medium van de cellen gecombineerd en vervangen met 10 mL D10 + Doxorubicine.
    7. Incubeer de cellen gedurende precies 24 uur in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    8. Het medium van de cellen gecombineerd en grondig eens te wassen met 10 mL D10.
    9. Incubeer de cellen in 10 mL D10 voor een ander 6 dagen ter vervanging van het medium regelmatig, ongeveer om de 3 dagen.
    10. Op dag 7, test voor senescentie markeringen en/of gebruiken voor downstream toepassingen.
      Opmerking: als besturingselement, gebruik prolifererende primaire fibroblasten van de dezelfde PD behandeld gedurende 24 uur met voertuig (PBS) 1:1,000 in D10.
  5. Oxidatieve Stress-geïnduceerde senescentie
    1. Tijdens het verwerken van cellen of enig materiaal dat met hen in contact worden zal (pipets, kolven, media, enz.), werken onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.
    2. Zaad 7 x 105 levensvatbare primaire fibroblasten in een lage PD in een maatkolf van T75 (~9.3 x 103 cellen/cm2) met 10 mL D10.
    3. Incubeer de cellen overnachting in een cel incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    4. Bereid een oplossing voor ~ 200 μM waterstofperoxide in D10 medium door 22.6 μL van 30% waterstofperoxide toe te voegen in 11 mL D10.
      Opmerking: Optimaliseren van de behandeling voor het celtype van belang door het maken van een dosis / respons-curve voor de evaluatie van de toxiciteit.
    5. Gecombineerd het medium van de cellen en voeg 10 mL van de vers bereide D10 middellange + waterstofperoxide. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C met 5% CO,2 en 5% O2.
    6. Gecombineerd het medium van de cellen en een keer wassen met verse D10 zonder waterstofperoxide.
    7. Voeg 10 mL D10 zonder waterstofperoxide.
    8. Incubeer gedurende 48 uur in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    9. Herhaal stappen 2.5.4–2.5.8 twee keer meer voor een totaal van drie behandelingen.
    10. Controleer op senescentie markeringen of oogst voor downstream toepassingen.
      Opmerking: Zoals controle, de delende cellen gebruik van de dezelfde PD behandeld met 22,6 µL van steriel water in D10 gedurende 2 uur.
  6. Epigenetically-geïnduceerde senescentie
    1. Voorraad en werkende oplossingen voor de kleine molecule(s) te gebruiken volgens tabel 1voorbereiden. Filter-steriliseren de oplossingen. ALIQUOT in steriele buizen. Winkel bij-20 ° C.
    2. Tijdens het verwerken van cellen of enig materiaal dat met hen in contact worden zal (pipets, kolven, media, enz.) werken onder steriele omstandigheden, bijvoorbeeld met behulp van een laminaire flow hood, laboratoriumjas en handschoenen. Houden cellen bij 20% O2 (kamer voorwaarden) alleen terwijl behandeld.
    3. Zaad 7 x 105 levensvatbare primaire fibroblasten in een lage PD in een maatkolf van T75 (~9.3 x 103 cellen/cm2) met 10 mL D10.
    4. Incubeer de cellen overnachting in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    5. 11 mL D10 medium + werkoplossing voorbereiden op de gewenste behandeling. De exacte verdunning per behandeling kan worden gezien in tabel 1.
      1. Voorbereiding 11 µL van 1 mM SAHA werkoplossing in 11 mL D10.
      2. Bereiden 44 µL van 1 M natrium butyraat werkoplossing in 11 mL D10.
      3. Voorbereiding 11 µL van 10 mM 5-aza werkoplossing in 11 mL D10.
        Opmerking: Optimaliseren de behandelingen voor het celtype van belang door, bijvoorbeeld, waardoor een dosis / respons-curve voor de evaluatie van de toxiciteit.
    6. Voeg D10 medium + werkende oplossing voor de gewenste behandeling aan de cultuur.
    7. Incubeer gedurende 24 uur in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    8. Herhaal stappen 2.6.4–2.6.6 twee keer meer, voor een totaal van drie behandelingen.
    9. Verandering medium voor eenvoudige D10 zonder drugs.
    10. Na 3 dagen meer worden cellen verouderend en klaar voor het testen van senescentie markeringen en downstream toepassingen.
      Opmerking: als besturingselement, gebruik prolifererende primaire fibroblasten van de dezelfde PD voor drie dagen met D10 middellange + voertuig behandeld. De D10 middellange + voertuig moet worden vernieuwd elke 24 h gedurende deze drie dagen. Het voertuig hangt af van de behandeling gebruikt: 1:1,000 DMSO voor SAHA en 5-aza en 1:250 steriel water voor natrium butyraat.

3. markeringen van senescentie

  1. Voorbereiding
    1. 20 mg/mL X-gal bereiden: Los 20 mg X-gal in 1 mL dimethylformamide of DMSO. Bewaren bij-20 ° C beschermd tegen licht.
    2. 0,1 M citroenzuuroplossing bereiden: los 2.1 g zuiver citroenzuurmonohydraat op in 100 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    3. Bereiden van 0,2 M natriumfosfaat-oplossing: los 2,84 g natriumfosfaat dibasische of 3,56 g natriumfosfaat dibasische uitdrogen in 100 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    4. 0,2 M citroenzuur/natrium fosfaat pH 6.0 bereiden: Los 36.85 mL van de citroenzuuroplossing 0,1 M en 63.15 mL 0,2 M natriumfosfaat. Verkleinen/vergroten precies tot pH 6.0. Bewaren bij kamertemperatuur.
    5. 100 mM kaliumferrocyanide bereiden: los 2.1 g kaliumferrocyanide in 50 mL water. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht.
    6. 100 mM kalium Hexacyanoferraat bereiden: Los 1,7 g kalium Hexacyanoferraat in 50 mL water. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht.
    7. 5 M natriumchloride bereiden: Los 14.6 g natriumchloride in 50 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    8. 1 M magnesiumchloride bereiden: Los 4,8 g magnesiumchloride in 50 mL water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    9. Bereiden van 2% formaldehyde + 0,2% Glutaaraldehyde in PBS: ontbinden 800 µL van 25% Glutaaraldehyde en 12,5 µL van 16% formaldehyde in 100 μl van PBS. Bewaren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
    10. Bereiden kleurstofoplossing vers volgens tabel 2.
  2. Senescentie-geassocieerde β-galactosidase kleuring
    1. Beënt voor elk monster, 1 x 104 cellen in minstens één putje van een 24-well plaat (5.2 x 103 cellen/cm2) met 500 µL van D10, zodat de cellen schaars zijn. Behandelingen (indien van toepassing) rechtstreeks op deze plaat kunnen worden uitgevoerd of, als alternatief, cellen al behandeld kunnen opnieuw geplaatste in een 24-well-plaat.
    2. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    3. Wassen cellen tweemaal met 500 μL van PBS.
    4. 3-5 min op kamertemperatuur 500 μl per putje van 2% formaldehyde + 0,2% Glutaaraldehyde met PBS vaststellen.
    5. Wassen cellen tweemaal met 500 μL van PBS.
    6. Bereiden verse kleurstofoplossing, volgens het aantal monsters om vlek.
    7. Voeg kleurstofoplossing (500 µL per putje) en afdichting van de plaat met parafilm om verdamping.
      Opmerking: Verdamping kan leiden tot kristallen te vormen en een belemmering vormen voor de observatie onder de Microscoop.
    8. Cellen in het donker (bijvoorbeeld bedekt met aluminiumfolie) incuberen bij 37 ° C in een droge incubator (zonder CO2) voor 12-16 h.
      Opmerking: CO2 kan gevolgen hebben voor de pH en daarom de resultaten wijzigen. Sommige celtypen mogelijk kortere incubatietijd tijden.
    9. Twee keer wassen met 500 μL van PBS.
    10. De resultaten evalueren. Positieve cellen presenteren een blauw (meestal) perinuclear kleuring onder een normale lichte Microscoop (figuur 1A).
    11. Voor kwantificering, ten minste 100 cellen per monster observeren en tellen van het aantal positieve cellen. Sinds verouderend cellen vorm wijzigen, is het vaak moeilijk om de celgrenzen te definiëren en te tellen van de cellen. Counterstain met DAPI visualisatie en kwantificering van afzonderlijke cellen (figuur 1B) te vergemakkelijken. Kwantificeren van de monsters (percentage positieve cellen ten opzichte van de totale hoeveelheid cellen) met behulp van een fluorescente microscoop (Figuur 1 c). Neem meerdere foto's van hetzelfde monster zodat eind kunt u ten minste 100 single-cellen tellen en evalueren van het percentage positieve cellen van de SA-β-gal in hen.
    12. Vergelijken van resultaten van verouderend cellen ten opzichte van hun passende controlemaatregelen voor de behandeling gebruikt.
      Opmerking: Een mede kleuring met EdU op hetzelfde monster is mogelijk. Overwegen dat de cellen vervolgens moeten worden ontpit op coverslips.
  3. EdU opneming Assay
    1. Zet een dekglaasje aan per putje in een 24-well plaat volgens het aantal monsters te beoordelen.
    2. Zaad 1 x 104 cellen in minstens één putje van een 24-well-plate (5.2 x 103 cellen/cm2) per voorwaarde met 500 µL van D10, zodat de cellen schaars zijn. Behandelingen (indien van toepassing) rechtstreeks op deze plaat kunnen worden uitgevoerd of, als alternatief, reeds behandelde cellen kunnen opnieuw geplaatste in een 24-well-plaat.
    3. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2.
    4. Maak een oplossing van 20 µM van EdU in D10 (1:250) volgens het aantal monsters te behandelen (250 μL per monster).
    5. De helft van het medium (250 μL) te verwijderen van elk putje te behandelen en te vervangen met de D10 + EdU oplossing die slechts bereid was. EdU eindconcentratie is 10 µM.
    6. Incubeer 18 – 24 h in een cel cultuur incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2. Gebruik de dezelfde incubatietijd in controle en verouderend cellen.
    7. Wassen 2 x met 500 μL van PBS.
    8. Het herstellen van de cellen gedurende 10 minuten met de 500 μL van 4% formaldehyde in PBS.
    9. Incubeer 5 min in 500 μL van 100 mM Tris (pH 7,6).
    10. De cellen gedurende 10 minuten in 500 μL van 0,1% permeabilize Triton X-100 in PBS.
    11. Wassen 3 x met PBS.
    12. 50 μl van label mix voorbereiden op elke dekglaasje aan, toe te voegen de onderdelen in de volgende volgorde: 44,45 µL van PBS, 0,5 µL van Cu (II) SO4, 0,05 µL van sulfo-Cy3-azide, 5 µL van natrium-ascorbaat.
    13. 50 μl van de label mix zetten een stuk parafilm. Til het dekglaasje aan met behulp van een paar pincet en een naald en laat het rusten op de top van de label mix, met het oppervlak met de cellen die beneden zijn gericht. Zorgen ervoor dat er geen luchtbellen en dat het hele oppervlak van het dekglaasje aan de label mix raakt. Incubeer gedurende 30 min. in het donker.
    14. Zet de cellen terug in de putjes van de plaat 24-well en spoel ze driemaal met PBS.
    15. Monteren met montage media (met inbegrip van de DAPI om te visualiseren kernen) in glas dia's en laat ze drogen overnachting.
    16. Visualiseer de opneming van de EdU met behulp van een fluorescente microscoop. Gebruik een filter geschikt voor Cy3 (excitatie/emissie: 552/570 nm).
    17. Neem meerdere foto's van de cellen voor latere kwantificering van ten minste 100 cellen per voorwaarde (Cy3 en DAPI).
    18. Kwantificeren van het percentage cellen dat EdU is opgenomen met behulp van de volgende formule:
      EdU positieve cellen (%) = (EdU positieve cel tellen (Cy3) / totaal aantal cellen (DAPI)) * 100
    19. Vergelijken van resultaten van verouderend cellen ten opzichte van hun passende controlemaatregelen voor de behandeling gebruikt.
      Opmerking: Een mede kleuring met SA-β-gal op hetzelfde monster is mogelijk. Overwegen dat de cellen nog steeds moeten worden ontpit op coverslips.
  4. Genexpressie p16, p21 en SASP
    1. Bereiden primer-sets van genen van belang (50 µM elke primer).
      Opmerking: Een qPCR van p16, p21 en enkele relevante SASP factoren is informatief voor de senescentie status. Het protocol beschreven hier maakt gebruik van het systeem van universele Probe Library (UPL) voor relatieve kwantificering met behulp van een real time-PCR. Tabel 3 geeft een overzicht van de inleidingen gebruikt voor de detectie van de CDK remmers p16 en p21 en van de meest relevante SASP leden, maar ook voor tubuline en actine, die dienen als referentie voor de assay genen. De laatste kolom van tabel 3 roept de bijzondere UPL sonde worden gebruikt voor elke assay.
    2. Aparte qPCR reactie mix voorbereiden op de gewenste testen. Vermeld altijd de referentie-gen ook volgens tabel 4.
    3. Alle voorbeelden in dubbele of drievoud uitvoeren.
    4. Laden van 7,5 µL per putje van de mix van qPCR reactie op een 384-well-plaat.
    5. Voeg ~ 5 ng van cDNA opgelost in 2.5 µL van RNase-gratis water.
      Opmerking: Het is beter om vergelijkbare bedragen van cDNA voor alle monsters worden vergeleken. Dit kan worden bereikt met behulp van gelijke hoeveelheden van RNA voor de omgekeerde transcriptie.
    6. De afdekplaat met een zegel en ervoor te zorgen dat het stokken correct die gelijkmatig alle putjes van de plaat.
    7. Draai de plaat bij 2.000 x g gedurende 1 minuut.
    8. Voer de plaat in de Lightcycler voor 40 cycli met gebruik van de onderstaande voorschriften:
      95 ° C gedurende 7 min
      40 cycli van 95 ° C voor 5 s tot 60 ° C gedurende 30 s
      37 ° C gedurende 1 min
    9. Voor de analyse van de resultaten, door de methode voorgesteld voor Livak en collega's te gebruiken voor het analyseren van qPCR gegevens24. Tubuline of actine gebruiken als referentie genen voor het berekenen van de ΔCt waarde en gebruik van het juiste besturingselement voor het berekenen van de voor de ΔΔCt-waarde voor de specifieke senescentie-inducerende behandeling.
  5. Eiwit expressie en secretie van IL6
    1. Zaad 5 – 10 x 104 cellen in minstens één putje van een 6-well plaat (5.2 – 10.5 x 103 cellen/cm2) per voorwaarde met 2 mL D10. Behandelingen (indien van toepassing) rechtstreeks op deze plaat kunnen worden uitgevoerd of, als alternatief, cellen al behandeld kunnen opnieuw geplaatste in een 24-well-plaat. Laat het staan 's nachts na het zaaien.
    2. Verwijder het medium en vervang voor 2 DMEM medium zonder FBSmL. Incubeer onder normale omstandigheden gedurende 24 uur.
    3. Het verzamelen van het medium in een tube van 15 mL.
    4. Centrifugeer het monster bij 300 x g gedurende 5 min. Medium kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot verwerkt.
    5. Volg de instructies van de fabrikant de uit te voeren van de ELISA.
    6. Vergelijken van de resultaten van verouderend cellen ten opzichte van het juiste besturingselement voor het specifieke senescentie-inducerende behandeling

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Verrijking van de SA-β-gal kleuring in verouderend fibroblasten

Β-galactosidase (β-gal) is een lysosomale enzym dat wordt uitgedrukt in alle cellen en dat heeft een optimale pH van 4,025,-26. Echter tijdens senescentie, lysosomen in omvang toenemen en, bijgevolg, verouderend cellen accumuleren β-gal. De verhoogde bedragen van dit enzym maken het mogelijk om op te sporen haa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De protocollen die hier uitgelegd werden geoptimaliseerd voor menselijke primaire fibroblasten, met name de cellen BJ en WI-38. De protocollen voor Dr. senescentie, ioniserende straling en Doxorubicine, zijn met succes toegepast op andere types van fibroblasten (HCA2 en IMR90) en in andere celtypen (namelijk neonatale melanocyten en keratinocyten of iPSC afkomstige cardiomyocytes) in ons laboratorium. Aanpassingen voor extra celtypes kunnen echter worden geoptimaliseerd door enkele details zoals het aantal geplaatste cel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Wij danken de leden van de lab Demaria voor vruchtbare discussies, en Thijmen van Vliet voor het delen van gegevens en het protocol betreffende de UV-geïnduceerde senescentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
Fetal Bovine SerumHycloneSV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml)LonzaDE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)AmbionAM9937
T75 flaskSarstedt833911002
Trypsin/EDTA SolutionLonzaCC-5012
PBS tabletsGibco18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubesSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubesSigma-AldrichCLS430791
6-well plateSarstedt83.3920
24-well plateSarstedt83.3922
13mm round coverslipsSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
Cesium137-sourceIBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamberOpsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidineSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Sodium Butyrate Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)Fisher Scientific7240-90-6
Citric acid monohydrateSigma-Aldrich5949-29-1
Sodium dibasic phosphateAcros organics7782-85-6
Potassium ferrocyanide Fisher Scientific14459-95-1
Potassium ferricyanideFisher Scientific13746-66-2
Sodium ChlorideMerck Millipore7647-14-5
Magnesium ChlorideFisher Chemicals7791-18-6
25% glutaraldehydeFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)Lumiprobe10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
Sodium ascorbateSigma-AldrichA4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
TRIS baseRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white Roche4729749001
Lightcycler 480 sealing foil Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit BiolineBIO-84020
UPL Probe LibrarySigma-AldrichVarious
Human IL-6 DuoSet ELISAR&DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Counting slidesBio-Rad145-0017
Dry incubatorThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' laboratory filmBemis #PM992
Tweezers
Needles

Referenties

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997(2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34(2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188(2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Inductie van senescentieSA-beta-gal-kleuringEdU-incorporatie-assayp16 p21-expressieSASP-analyseprimaire fibroblastenbehandeling met doxorubicinepopulatieverdubbelingfluorescentiemicroscopie
Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.