Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Summary

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Abstract

Primaire menselijke keratinocyten van frisse huid weefsels en hun expansie in vitro geïsoleerd hebben wijd gebruikt voor laboratoriumonderzoek en klinische toepassingen. De isolatie van de conventionele methode van menselijke keratinocyten impliceert een sequentiële enzymatische spijsvertering-procedure in twee fasen, die heeft bewezen bij het genereren van primaire cellen van volwassen weefsels als gevolg van de lage cel terugvinding en de verminderde cel inefficiënt te zijn levensvatbaarheid. Onlangs meldden wij een geavanceerde methode om te isoleren van de menselijke primaire epidermale voorlopercellen van huid weefsels die gebruikmaakt van de Rho kinase inhibitor Y-27632 in het medium. Vergeleken met de traditionele protocol, deze nieuwe methode is eenvoudiger, makkelijker en minder tijdrovend, en verhoogt de cel van de stam van de epitheliale opbrengst en verbetert hun kenmerken van de cel van de stam. Bovendien, de nieuwe methodologie hoeft niet de scheiding van de epidermis van de dermis, en is daarom geschikt voor het isoleren van de cellen van verschillende types van volwassen weefsels. Deze nieuwe methode van de isolatie overwint de grote tekortkomingen van conventionele methoden en is meer geschikt voor de productie van grote aantallen epidermale cellen met hoge potentie zowel voor laboratorium klinische toepassingen. Hier beschrijven we de nieuwe methode in detail.

Introduction

Het doel was het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte protocol om te isoleren van de primaire mens keratinocyten (HKCs) uit volwassen weefsel, met name voor klinische toepassingen. Huid epidermal stamcellen, gelokaliseerd in de basale laag van de huid, bezitten een groot potentieel om te vermenigvuldigen en te onderscheiden en te voorzien van keratinocyten om de functies van de huid^{1,2,3, 4}. HKCs geïsoleerd uit de huid weefsels veel voor huid weefsel engineering en regeneratie doeleinden, vooral in het herstel van beschadigde huid e....

Protocol

Menselijke weefsels gebruikt in dit protocol hebben behandeld volgens de richtlijnen van de instelling menselijke onderzoek ethische Commissie (NO.2015120401, datum: 12 mei 2015).

1. voorbereiding

1. Verzamel verse volwassen buikhuid weefsels verwijderd van plastische chirurgie in het ziekenhuis in een tube van 50 mL met 10 mL ijskoud Dulbecco gewijzigd van Eagle medium (DMEM). Het model kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 72 uur zonder aanzienlijke invloed zijn op de levensvatbaarheid van de cellen.
2. De reagentia en voedingsbodem voorbereiden zoals hieronder beschreven.
   1. Voeg 1 mL penicilline (100 U/mL) en str....

Results

Schema's van de nieuwe methode (figuur 1A) en de conventionele methode (figuur 1B) worden weergegeven in Figuur 1. De conventionele methode is een tweestaps spijsvertering, waarvoor de procedure van een 2-daagse. De nieuwe methode is daarentegen een one-step spijsvertering, die ongeveer 3 uur duurt uit te voeren. Nog belangrijker is, kunt de nieuwe methode van one-step verkrijgen twee populaties (epi.......

Discussion

Gekweekte primaire HKCs hebben grote schaal gebruikt voor de behandeling van wonden in klinieken voor meer dan drie decennia, en sinds die tijd, het is altijd belangrijk geweest voor efficiënt voldoende aantallen cellen voor klinische toepassingen te verkrijgen in een tijdige wijze. Daarom, in de praktijk, de conventionele isolatie-methode, waarbij de scheiding van de epidermis van de dermis, maakt het moeilijk om te voldoen aan deze eisen, als gevolg van de lage opbrengst van de cellen en het lage vermogen om de passage.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatisch tellen van cellen
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	Voor cel incubatie
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Celcentrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	Voor waterbad
Elektronische weegschaal	Harbin Zhonghui	1171193	Voor weegschaal van weefsel
Celcultuurschaal	Eppendorf	30702115	Voor celcultuur
50ml Centrifugeerbuis	KIRGEN	171003	Voor celcentrifuge
Celzeef	Corning incorporated	431792	Celfiltratie
Fosfaat gebufferde oplossing	Solarbio Life Science	P1020-500	Wasoplossing
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Onderdeel van neutralisatiemedium
Gedefinieerd K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermale celcultuurmedium
Penicilline Streptomycine	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotica
Fetaal bovien serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Onderdeel van neutralisatiemedium
0,05% Trypsine	Life Technologies	25300-062	Voor HKC dissociatie
0,25% Trypsine	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	Voor HKC dissociatie
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	Voor coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	Voor HKC isolatie
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	Voor HKC isolatie
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	Voor HKC isolatie
F12 voedingsmix, Hams	Life Technologies	31765035	Onderdeel van G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Groeifactor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Groeifactor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK-remmer
Fungizone	Gibco	15290026	Voorbereiding voor G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Groeifactor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	Celproliferatie en cytotoxiciteitstesten
Muis Anti-Menselijke Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HKC's te controleren
Konijn Anti-Menselijke Loricrin	Covance	PRB-145p	Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HKC's te controleren
Muis anti-menselijke Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	Voor immunofluorescentiekleuring van dermale fibroblasten
Integrine α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	Flow cytometrie analyse van HKC's
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	Negatieve controle antilichaam van α6-integrine  in flow cytometrie analyse