Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Summary

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Abstract

Primaire menselijke keratinocyten van frisse huid weefsels en hun expansie in vitro geïsoleerd hebben wijd gebruikt voor laboratoriumonderzoek en klinische toepassingen. De isolatie van de conventionele methode van menselijke keratinocyten impliceert een sequentiële enzymatische spijsvertering-procedure in twee fasen, die heeft bewezen bij het genereren van primaire cellen van volwassen weefsels als gevolg van de lage cel terugvinding en de verminderde cel inefficiënt te zijn levensvatbaarheid. Onlangs meldden wij een geavanceerde methode om te isoleren van de menselijke primaire epidermale voorlopercellen van huid weefsels die gebruikmaakt van de Rho kinase inhibitor Y-27632 in het medium. Vergeleken met de traditionele protocol, deze nieuwe methode is eenvoudiger, makkelijker en minder tijdrovend, en verhoogt de cel van de stam van de epitheliale opbrengst en verbetert hun kenmerken van de cel van de stam. Bovendien, de nieuwe methodologie hoeft niet de scheiding van de epidermis van de dermis, en is daarom geschikt voor het isoleren van de cellen van verschillende types van volwassen weefsels. Deze nieuwe methode van de isolatie overwint de grote tekortkomingen van conventionele methoden en is meer geschikt voor de productie van grote aantallen epidermale cellen met hoge potentie zowel voor laboratorium klinische toepassingen. Hier beschrijven we de nieuwe methode in detail.

Introduction

Het doel was het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte protocol om te isoleren van de primaire mens keratinocyten (HKCs) uit volwassen weefsel, met name voor klinische toepassingen. Huid epidermal stamcellen, gelokaliseerd in de basale laag van de huid, bezitten een groot potentieel om te vermenigvuldigen en te onderscheiden en te voorzien van keratinocyten om de functies van de huid^{1,2,3, 4}. HKCs geïsoleerd uit de huid weefsels veel voor huid weefsel engineering en regeneratie doeleinden, vooral in het herstel van beschadigde huid en in de therapie van het gen voor klinische toepassingen^{5,6 gebruikt worden}. Het hoofdthema voor HKC gebaseerde toepassingen is efficiënt isoleren en uitbreiden van grote aantallen HKCs met hoge potentiële in vitro^7,8. Hoewel verschillende onderzoeksgroepen hebben methodes voor de productie van culturen van stam-achtige HKCs ontwikkeld, zijn deze methoden soms tijdrovend en ingewikkeld uit te voeren en hebben andere beperkingen, zoals lage cel opbrengsten en wordt beperkt door het type van huid specimen ⁹gebruikt. Bijvoorbeeld, impliceert de traditionele methode om te isoleren van de HKCs van de huid weefsels een tweestaps enzymatische spijsvertering met een scheiding van de epidermis van de dermis⁶. Deze methode werkt meestal goed voor neonatale weefsels, maar het zeer moeilijk zijn wanneer gebruikt voor het isoleren van cellen uit volwassen weefsel wordt.

Y-27632, een inhibitor van de omwenteling van Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK), is gemeld aan het aanzienlijk verbeteren van de efficiëntie van de cel van de stam van de epidermale isolatie en kolonie groei^10,11,12. In een eerdere studie ontdekten we dat Y-27632 de klonale groei van epidermale cellen vergemakkelijkt, maar het rendement van dermale cellen vermindert door het differentieel beheersen van de expressie van hechting moleculen¹³. Wij ook vastgesteld een nieuw geconditioneerde inoculatie medium, G-medium, ter ondersteuning van de groei en rendement van primaire epidermale cellen genoemd. Door het combineren van G-medium met Y-27632, kan deze nieuwe methode spontaan epidermale en dermale cellen scheiden na enzym spijsvertering, waardoor de stap van^13,14van de scheiding van de epidermis-dermis. Op basis van eerdere verslagen, beschrijven we nu de gedetailleerde procedure voor deze nieuwe methode om te isoleren van de HKCs van volwassen huidweefsel.

Protocol

Menselijke weefsels gebruikt in dit protocol hebben behandeld volgens de richtlijnen van de instelling menselijke onderzoek ethische Commissie (NO.2015120401, datum: 12 mei 2015).

1. voorbereiding

1. Verzamel verse volwassen buikhuid weefsels verwijderd van plastische chirurgie in het ziekenhuis in een tube van 50 mL met 10 mL ijskoud Dulbecco gewijzigd van Eagle medium (DMEM). Het model kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 72 uur zonder aanzienlijke invloed zijn op de levensvatbaarheid van de cellen.
2. De reagentia en voedingsbodem voorbereiden zoals hieronder beschreven.
   1. Voeg 1 mL penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 mg/L) aan 50 mL fosfaatgebufferde oplossing (PBS) ter voorbereiding van de Supermarket-oplossing.
   2. Twee sets van enzym spijsvertering oplossingen voor te bereiden: (1) bereiden 50 mL dispase (2,5 mg/mL in DMEM) en 50 mL typ ik collagenase (2,5 mg/mL in DMEM) apart voor de conventionele methode; en (2) bereiden 50 mL van een mengsel van dispase en typ ik collagenase (Los 125 mg dispase poeder en 125 mg type ik collagenase poeder in 50 mL DMEM) voor de nieuwe methode.
      Opmerking: Alle enzym oplossingen moeten worden gefilterd met een zeef 0.22-µm en gehouden at4 ° C.
   3. Bereiden van spijsvertering oplossingen voor beide methoden: trypsine van 0,05% en 0,25% trypsine commercieel werden aangekocht. Bereiden van een 10 mg/mL DNase ik oplossing door ontbinding van 50 mg DNase ik poeder in 5 mL PBS, filteren met een zeef 0.22-µm, en opgeslagen bij-20 ° C.
   4. Bereiden van 500 mL medium te neutraliseren de enzymatische spijsvertering: DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
   5. Bereiden van 500 mL van inoculatie medium (groei-factor-bevattende medium, genaamd G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium dat 1% penicilline/streptomycine, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast groeifactor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), en 2% B27 supplement.
   6. Voorbehandeling van 100 mm celkweek gerechten met 2 mL van coating matrix met type I collageen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

2. de conventionele methode

1. Huid weefsel voorbehandeling
   1. Neem 1.5 cm,² van huidweefsel en wassen het 1 x met 10 mL PBS; Spoel het daarna met 10 mL 70% ethanol voor 30 s en Incubeer het 2 x met 10 mL oplossing (PBS met 2% penicilline en streptomycine), 5 minuten elk te wassen.
      Opmerking: Alle wast zijn uitgevoerd in 100-mm cel cultuur gerechten binnen een laminaire flow-kap.
   2. Trim het weefsel met een steriele schaar verwijderen van de subcutane vetlaag in een schaal van 100-mm cel cultuur en, vervolgens, weeg het huidweefsel (het gewicht is 1 g in dit protocol).
      Opmerking: Voldoende trimmen is zeer cruciaal voor de efficiënte scheiding van de epidermis van de dermis. De gelige vetlaag kan visueel gemakkelijk worden onderscheiden.
   3. Het weefsel overbrengen in een andere 100-mm steriele schotel met de dermis zijde naar beneden, en snijd vervolgens het huidweefsel in 3 - tot 4-mm brede stroken met behulp van een scalpel blad.
      Opmerking: De dermis kant met de vetlaag is visueel gemakkelijk herkend.
   4. Voeg 10 mL van 2,5 mg/mL dispase oplossing naar de huid weefsels in een schaal van 100-mm cultuur en, vervolgens, Incubeer de schotel 's nachts bij 4 ° C (niet meer dan 20 h).
      Nota: Het bedrag van de dispase oplossing kan worden berekend met behulp van 10 mL dispase oplossing voor de vertering van elke gram weefsel.
2. Scheiding van de epidermis van de huidweefsel
   1. Op de tweede dag, afschilferen de opperhuid van de dermis, met behulp van fijne pincet.
      Opmerking: Als het is moeilijk om het afschilferen van de epidermis, de dispase spijsvertering was niet voldoende, die is meestal te wijten aan onvoldoende trimmen van het weefsel. Het weefsel moet in dit geval een langere incubatietijd.
   2. Mince de gepelde epidermis met 500 µL cultuurmedium van de cellen in een weefsel drijfmest met scalpel messen; vervolgens het resuspendeer met 10 mL van 0,25% trypsine in een tube van 50 mL en Incubeer het 20 min in een waterbad bij 37 ° C, met schudden.
3. Verzamelen en kweken van primaire cellen
   1. Neutraliseer de trypsine-activiteit door een gelijk volume neutralisatie oplossing (10 mL in dit protocol) toe te voegen.
   2. Distantiëren van de epidermale cellen door de oplossing op en neer 20 x pipetteren met een serologische pipet 10 mL en laat de oplossing van de cel door een 100-µm cel zeef te verwijderen van alle resterende weefsel puin.
   3. Centrifugeer het cell-oplossing bij 200 x g gedurende 5 min na filtratie; resuspendeer de pellet cel in neutralisatie medium voor wassen en Centrifugeer het vervolgens weer bij 200 x g te verkrijgen van de cel-pellet.
   4. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van lage-calcium, serumvrij Keratinocyt medium (SFM). Neem 10 µL van deze oplossing naar de cel Totaal aantal tellen en, vervolgens, ongeveer 2 x 10⁶ cellen plaat met 10 mL SFM tot 100 mm cel cultuur gerechten voorbehandeld met coating matrix (bevattende type I collageen).
      Opmerking: Coating is een noodzakelijke stap voor de conventionele methode.
   5. Wijzig het kweekmedium elke 2 d.
      Opmerking: Controleer de cel adhesie onder een Microscoop vóór en na het wijzigen van het kweekmedium.
   6. Passage van de cellen wanneer ze ongeveer 80 bereiken % samenvloeiing.
      Opmerking: Alle cultuur gerechten zijn voorbehandeld met de coating-matrix.

3. de nieuwe methode

1. Huid weefsel voorbehandeling
   1. Het verzamelen van het weefsel zoals beschreven hierboven (stap 2.1) voor de conventionele methode.
   2. Wassen van de huidweefsel 1 x met 10 mL PBS en weeg het vervolgens in een steriele plastic container door een elektronische schaal (het gewicht is ongeveer 1 g in dit protocol).
      Opmerking: Het minimum gewicht van weefsel die nodig zijn voor dit protocol is 0.1 g, omdat het moeilijk te verkrijgen van een voldoende aantal cellen als het weefsel model gebruikt te klein is. Er is geen maximumgewicht van weefsel voor dit protocol, die uiteindelijk afhankelijk van de capaciteit van de behandeling van de exploitant.
   3. Pincet gebruiken om te spoelen het huidweefsel met 70% ethanol voor 30 10 mL s.
   4. Incubeer het weefsel 2 x met 10 mL van oplossing (bereid in stap 2.1.1), gedurende 5 minuten wassen elke keer.
      Opmerking: Alle wassen stappen hierboven zijn uitgevoerd in 100-mm cel cultuur gerechten binnen in een laminar flow hood (een weefselkweek kap).
   5. Het weefsel overbrengen in een andere 100-mm cel cultuur steriele schotel.
   6. Met scalpel messen, blad voor het weefsel grondig in een weefsel drijfmest.
   7. Voeg 200 µL van PBS elke 5 min om te houden van de natte weefsels.
      Opmerking: Duren ongeveer 15 min. voor stappen 3.1.5 - 3.1.7. Alle bovenstaande stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
2. Vertering van huidweefsel
   1. Breng de oplossing van de gehomogeniseerde weefsel in een 50 mL-buis. Voeg 10 mL van enzym mengsel voor elke 1 g van huidweefsel. Meng de enzymen met het gehomogeniseerde weefsels.
   2. Incubeer het mengsel met schudden in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur.
   3. Voeg een 1/5-volume van 0,25% trypsine (2,5 mL in dit protocol) aan de spijsvertering-mengsel voor een ander 30 minuten in een waterbad bij 37 ° C.
   4. Toevoegen van DNase ik oplossing aan het enzym mengsel bij een verhouding van 1:100 (v/v) (250 µL in dit protocol) en laat het 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
3. Verzamelen en kweken van primaire cellen
   1. Stop het spijsverteringsproces door toevoeging van 12,5 mL van neutralisatie medium in een 1:1 verhouding. Pipetteer op en neer de oplossing voor ongeveer 20 x, met behulp van serologische Pipetteer 10 mL te distantiëren van de cellen.
   2. Filtreer de gedissocieerde cellen door een 100-µm cel zeef te verwijderen van het puin van het weefsel. Centrifugeer het supernatant bij 200 x g gedurende 5 min. Let op de pellet aan de onderkant van de buis.
   3. Verwijder het supernatant en wassen van de cel pellet met 10 mL van neutralisatie medium, en centrifuge weer bij 200 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de cellen.
   4. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van inoculatie medium (G-medium uit stap 1.2.5) met 10 µM van Y-27632.
   5. Neem 10 µL van de oplossing voor de cel Totaal aantal tellen en, vervolgens, ongeveer 2 x 10⁶ cellen plaat met 10 mL voor G-medium in een schotel van 100 mm cel cultuur.
      Opmerking: De precoating stap is niet nodig voor de nieuwe methode, en geen verwijdering van de dermale laag is niet vereist.
   6. Na de 3 d, vervangt u het medium inoculatie met lage-calcium SFM medium. Wijzig het kweekmedium elke 2 d.
      Opmerking: Controleer de cel adhesie vóór en na het wijzigen van het medium.
   7. Passage van de cellen wanneer ze ongeveer 80 bereiken % samenvloeiing.
      Opmerking: Indien nodig, voorbehandeling van de cellen met 0,05% trypsine gedurende 2 minuten en wassen van de cellen met PBS te verwijderen dermale cellen besmetten voordat de trypsinizing van de epidermale cellen.

4. de cel Passaging

1. Verwijder het medium, wassen van de cellen met PBS en, dan, voeg 2 mL 0,05% trypsine (per elke 100 mm schotel).
2. Incubeer de cellen in een incubator (37 ° C met 5% CO₂) gedurende 5 minuten.
3. Controleer de cellen met behulp van een microscoop om ervoor te zorgen dat alle cellen hebben losgemaakt van de cultuur-schotel.
4. Voeg 8 mL DMEM met 10% FBS te neutraliseren van de enzymatische reactie, vervolgens verzamelen de cellen in een buis 15 mL.
5. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min te verkrijgen van de cel-pellet.
6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof langzaam en vervolgens resuspendeer de pellet cel met 10 mL van SFM medium en het aantal cellen tellen.
7. 1 x 10 bord⁶ cellen met 10 mL SFM in elke cel van de 100-mm schotel.
8. Het medium elke 2 d te wijzigen.

Results

Schema's van de nieuwe methode (figuur 1A) en de conventionele methode (figuur 1B) worden weergegeven in Figuur 1. De conventionele methode is een tweestaps spijsvertering, waarvoor de procedure van een 2-daagse. De nieuwe methode is daarentegen een one-step spijsvertering, die ongeveer 3 uur duurt uit te voeren. Nog belangrijker is, kunt de nieuwe methode van one-step verkrijgen twee populaties (epi...

Discussion

Gekweekte primaire HKCs hebben grote schaal gebruikt voor de behandeling van wonden in klinieken voor meer dan drie decennia, en sinds die tijd, het is altijd belangrijk geweest voor efficiënt voldoende aantallen cellen voor klinische toepassingen te verkrijgen in een tijdige wijze. Daarom, in de praktijk, de conventionele isolatie-methode, waarbij de scheiding van de epidermis van de dermis, maakt het moeilijk om te voldoen aan deze eisen, als gevolg van de lage opbrengst van de cellen en het lage vermogen om de passage...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatisch tellen van cellen
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	Voor cel incubatie
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Celcentrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	Voor waterbad
Elektronische weegschaal	Harbin Zhonghui	1171193	Voor weegschaal van weefsel
Celcultuurschaal	Eppendorf	30702115	Voor celcultuur
50ml Centrifugeerbuis	KIRGEN	171003	Voor celcentrifuge
Celzeef	Corning incorporated	431792	Celfiltratie
Fosfaat gebufferde oplossing	Solarbio Life Science	P1020-500	Wasoplossing
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Onderdeel van neutralisatiemedium
Gedefinieerd K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermale celcultuurmedium
Penicilline Streptomycine	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotica
Fetaal bovien serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Onderdeel van neutralisatiemedium
0,05% Trypsine	Life Technologies	25300-062	Voor HKC dissociatie
0,25% Trypsine	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	Voor HKC dissociatie
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	Voor coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	Voor HKC isolatie
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	Voor HKC isolatie
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	Voor HKC isolatie
F12 voedingsmix, Hams	Life Technologies	31765035	Onderdeel van G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Groeifactor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Groeifactor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK-remmer
Fungizone	Gibco	15290026	Voorbereiding voor G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Groeifactor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	Celproliferatie en cytotoxiciteitstesten
Muis Anti-Menselijke Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HKC's te controleren
Konijn Anti-Menselijke Loricrin	Covance	PRB-145p	Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HKC's te controleren
Muis anti-menselijke Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	Voor immunofluorescentiekleuring van dermale fibroblasten
Integrine α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	Flow cytometrie analyse van HKC's
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	Negatieve controle antilichaam van α6-integrine  in flow cytometrie analyse