Method Article

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) vormen een klasse van kleine noncoding RNAs die post-transcriptionally cellulaire genexpressie regelen. MiRNAs binden aan de 3' niet-vertaalde regio (UTR) van target mRNA te remmen eiwit vertaling of in sommige gevallen leiden tot aantasting van het mRNA. De binding van de miRNA aan de 3-' UTR van het streefcijfer dat mRNA wordt gemedieerd door een 2 – 8 nucleotide zaad reeks eind 5' miRNA. Terwijl de rol van miRNAs als cellulaire regelgevende moleculen goed ingeburgerd is, blijft identificatie van de target mRNAs met functionele relevantie een uitdaging. Bioinformatic hulpmiddelen zijn tewerkgesteld te voorspellen van reeksen binnen de 3-' UTR van mRNAs als doelwit voor miRNA bindend. Deze hulpprogramma's zijn ook gebruikt om te bepalen van de evolutionaire instandhouding van dergelijke sequenties onder Verwante soorten in een poging om te voorspellen van functionele rol. Echter deze rekenmethoden vaak vals-positieve resultaten genereren en zijn beperkt tot het voorspellen van de canonieke interactie tussen miRNA en mRNA. Experimentele procedures die meten van directe binding van miRNA aan haar doelstelling van mRNA zijn daarom noodzakelijk vast te stellen functionele interactie. In dit verslag beschrijven we een gevoelige methode voor de validatie van de directe interactie tussen de cellulaire miRNA miR-125 ter en de 3' UTR van PARP-1 mRNA. Wij werken een protocol waarin synthetische biotinyleerd-miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen en de miRNA-mRNA-complex in de cellulaire lysate werd gesloopt met streptavidine beklede magnetische kralen. Tot slot, het doel dat mRNA in de trok-down nucleic acid complex werd gekwantificeerd aan de hand van een qPCR gebaseerde strategie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) zijn klein niet-coderende RNAs die eiwit expressie1negatief te regelen. Precursoren van miRNA bevinden zich in clusters door vele regio's van het genoom, vaakst binnen de intergenic regio's en de introns van eiwit-codeert genen2,3. Biogenese van miRNAs betrekken transcriptie van de pri-miRNAs van miRNA-encoding genen4. De pri-miRNAs ondergaan sequentiële verwerking, eerst in de kern, en vervolgens in het cytoplasma voor het genereren van één gestrande volwassen miRNAs4,5. Daarna de volwassen miRNAs zijn opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC): een multimeric eiwit-RNA complex waarin een lid van de familie van de Argonaute van eiwitten voor de doelgroep erkenning4,5, 6,7. Volwassen miRNAs in de RISC complexe overwegend binden aan de 3-' UTR van doel mRNAs8,9,10 , maar ook af en toe kunt binden in de codering en de 5' UTR regio van de mRNA10,11 . De binding van miRNA naar het mRNA sequenties resultaten in translationeel silencing12,13,14 en in sommige gevallen mRNA destabilisatie15. Aangezien een enkele miRNA veel mRNAs richten kunt, deze regelgevende moleculen zijn betrokken bij bijna alle cellulaire processen en zijn betrokken bij verschillende ziekte voorwaarden16,17,18.

Gedetailleerd begrip van hoe miRNAs cellulaire routes reguleren vereist identificatie van de target mRNAs. Meerdere bioinformatics platforms zijn beschikbaar voor het voorspellen van de vermeende miRNA:mRNA interacties19,20. Deze voorspellingen, is afhankelijk van de perfecte Watson-Crick basis koppeling tussen de 2 – 8 nucleotide zaad opeenvolging van de miRNA en een bijkomende opeenvolging binnen de doelgroep mRNA4,21. Bovendien, deze tools genereren van de secundaire structuur van de miRNA:mRNA duplex, berekenen thermodynamische parameters van deze moleculaire interactie en Toon van instandhouding van de bandplaatsen over soorten te vergroten van functionele relevantie van het doel voorspelling. Helaas hebben deze hulpprogramma's ook de beperking van het voorspellen van valse positieve doelstellingen op een zeer hoog percentage (~ 27 – 70%)15,22. Bovenal deze platforms in silico niet herkennen van de niet-canonieke interactie van miRNAs met hun doelstellingen23. Deze voorspellende analyses zijn daarom vaak gecombineerd met experimentele methoden voor het valideren van functioneel relevante doelstellingen.

Meerdere benaderingen zijn ontwikkeld voor het proefondervindelijk valideren van miRNA:mRNA interactie. Genetische experimenten met behulp van miRNA nabootsers, bieden sponzen en remmers die veranderen van de niveaus van miRNAs in de cel aanknopingspunten voor het regulerende effect daarvan op de doelgroep gen expressie24,25,26. Bovendien, verslaggever gebaseerd testen via co transfectie van een kloon met de UTR regio 3' van de target mRNA en miRNA nabootsers of remmers in cellen bewijs te leveren van de regulerende functie van miRNAs26. Terwijl deze methoden cruciaal zijn voor het bestuderen van post-transcriptional regulering van de genexpressie door miRNAs, zijn transfectie efficiëntie en pleotropic gevolgen van wijzigingen in de cellulaire miRNA niveaus belangrijke beperkingen van deze genetische benaderingen23, 26. Daarom zijn complementaire biochemische methoden die peilen naar directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling werkzaam om beter te begrijpen de cellulaire functie van miRNAs.

Een veel gebruikte methode om te studeren van directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling is immunoprecipitation van de RISC complexe gevolgd door de detectie van mRNA doel binnen de complexe27,28,29,30 . Onlangs, een verbeterde RISC val methode werd ook gebruikt om te identificeren van miRNA doelstellingen; het paren stabilisatie van doelen binnen de RISC-miRNA-mRNA tussenproducten met de zuivering van mRNA doelen. Echter, deze methodsface de inherente uitdagingen van niet-specifieke interacties tussen RNA en RNA-bindende eiwitten, die meestal worden gescheiden door cellulaire compartimenten31,32. Bovendien, zijn deze tests afhankelijk van de aanwezigheid van AGO2 eiwitten voor immunoprecipitation van RISC complexe33. Gezien het feit dat AGO2 niet de enige argonaute te bemiddelen efficiënte miRNA:mRNA interacties, kan uitsluiting van andere argonautes leiden tot vooringenomen resultaten34. Daarom, alternatieve strategieën nodig zijn om te studeren van directe binding van miRNA aan mRNA.

In dit verslag, werken we een one-step-aanpak voor directe interactie tussen een miRNA en haar doelstelling indringende mRNA. Eerst, 3' biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur (LNA) miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen. Vervolgens is het complex in de cellulaire lysate miRNA:mRNA gevangen met behulp van magnetische kralen daar bekleed. Het doel van de mRNA gebonden aan haar complementaire miRNA is gekwantificeerd aan de hand van qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de transfectie van 3'-biotinyleerd miRNA

Opmerking: Voer de volgende stappen binnen een steriele laminar flow hood.

  1. Zaad 4 x 105–5 x 105 HEK-293T cellen per putje in 2 mL zuiver voltooien Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) [DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x Pen-strep antibioticum]. Cultuur van de cellen in een incubator ingesteld bij 37 ° C, 5% CO2 's nachts.
  2. De volgende dag, Controleer de gezondheid en de hechting van de vergulde cellen onder een lichte Microscoop.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen hebben gehandeld en bereikt de juiste morfologie voordat u verdergaat met de volgende stap. De HEK-293T cellen zijn meestal klaar voor Transfectie 18 – 24 h post beplating.
  3. Verdund in een steriele 1,7 mL microfuge buis, 75 picomoles van biotinyleerd miRNA in 200 µL van minimale essentiële media. Deze mix overbrengen in een andere 1,7 mL microfuge buis met liposoom gebaseerde transfectiereagens (8 µL per putje) verdund in 200 µL van minimale essentiële media. Meng grondig, maar voorzichtig, door pipetteren en incubeer gedurende 20-25 minuten bij kamertemperatuur te staan van de vorming van de transfectie complexen.
  4. Verwijder de oude media uit de plaat 6 goed cultuur door zachte pipetteren en vullen elk putje met 1.6 mL vers bereide volledige DMEM (zonder 1 x Pen-strep antibiotica).
  5. De transfectie complexen (uit 1.3) drop-wise toevoegen aan de cellen in de 6-well plaat met behulp van een goed geijkte pipet. Swirl de plaat zachtjes terwijl het toevoegen van de complexen om ervoor te zorgen hun uniforme verdeling over de plaat.
    Opmerking: Deze stap is zeer kritisch is voor het bereiken van hoogrenderende transfectie en moet worden uitgevoerd met zorg en geduld.
  6. Cultuur van de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 voor ten minste 36 uur.

2. bereiding van streptavidine bekleed magnetische kralen — Ik

  1. Resuspendeer de magnetische kralen van daar grondig door vortexing. 30 µL van schorsing van de kraal (per monster) overbrengen in een 2 mL nuclease-vrije microfuge buis.
  2. Plaats de buis met de opschorting van de kraal op de magnetische kraal scheidingsteken stand ("magneet" hierna) gedurende 2 minuten. Als u zeker bent dat de kralen worden getrokken naar de kant van de buis in contact met de magneet, verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met behulp van een micropipet.
  3. Voeg 100 µL van parel was buffer (10 mM Tris-Cl pH 7.5, van 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl) aan de kralen. Verwijder de buis van de magneet. Vortex voor 15 s bij kamertemperatuur te wassen van de kralen.
  4. Plaats de buis met parels op de magneet gedurende 2 minuten, en zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
  5. Herhaal stap 2.3 en 2.4 voor een totaal van drie wast. Na de laatste wasbeurt stap, de buis van de magneet te verwijderen.
  6. Voeg 100 µL van RNase vrijmaken van oplossing (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) naar de kralen, meng goed door de vortexing voor 15 s, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaats de buis met parels op de magneet gedurende 2 minuten, en zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
  7. Herhaal stap 2.6 voor een totaal van drie keer.
  8. Kraal resuspensie oplossing (0.5 M NaCl) toevoegen aan de kralen, vortex 15 s, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. plaatst de geresuspendeerde kralen op de magneet gedurende 2 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant.
  9. Voeg toe 200 µL van Parel blokkeert oplossing (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL gist tRNA) aan de kralen. Meng door zachte vortexing voor 15 s bij kamertemperatuur. Incubeer bij 4 ° C voor 16 h (overmatige nacht) op een multi buis rotator.

3. voorbereiding van de cel Lysates

  1. Oogst de transfected cellen van HEK-293T door zachte schrapen met behulp van een steriele cel schraper binnen de laminaire kap, dan breng elk monster in een steriele 2 mL microfuge buis.
  2. Pellet de geschraapt cellen door centrifugeren op 1.500 x g voor 5 min. resuspendeer de pellet in 1 x steriel PBS (Phosphate Buffer Saline), pH 7,2. Centrifuge weer bij 1.500 x g gedurende 5 min te verkrijgen van een pellet vrij van residuele media. Duik onmiddellijk de buis met pellet in ijs.
  3. Bereiden van verse volledige cellysis-buffermengsel (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x proteaseinhibitor).
    Opmerking: Een voorraad van lysis van de cel buffer ontbreekt IGEPAL, Superase en Protease inhibitor cocktail kan worden voorbereid en opgeslagen bij kamertemperatuur. Bereiden een verse partij van volledige cellysis-buffermengsel door toevoeging van de bovenstaande supplementen bij de aanbevolen definitieve concentraties aan de voorraad cellysis buffer en op ijs op te slaan.
  4. 260 µL van ijskoude volledige cellysis-buffermengsel toevoegen aan elk monster in de microfuge buis (dat wil zeggen, elke microfuge buis cellen geoogst van één putje van de plaat 6-well bevat) en resuspendeer de pellet cel in een homogene suspensie door pipetteren.
  5. Lyse de cellen met behulp van de methode bevriezen-ontdooien: Incubeer de buizen bij-80 ° C gedurende 10 à 15 min. Vervolgens kunnen de cellen om te ontdooien op ijs.
  6. Centrifugeren van de resulterende cel lysate bij 16.000 x g gedurende 5 minuten in een gekoelde benchtop centrifuge ingesteld bij 4 ° C.
  7. De gewiste cel lysate overbrengen in een steriele 1,7 mL microfuge buis op ijs. Gooi de pellet.
    Opmerking: Het eindvolume van gewist lysate moet ~ 240-250 µL.
  8. 5 M NaCl aan de gewiste lysate toevoegen om een eindconcentratie van 1M en onderhouden van de monsters op ijs.

4. voorbereiding van de magnetische kralen daar — II

  1. Bereiden van verse volledige pull-down-was buffer (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase en 1 x proteaseinhibitor cocktail)
    Opmerking: Een voorraad van pull-down was buffer ontbreekt IGEPAL, Superase en Protease inhibitor cocktail kan worden voorbereid en opgeslagen bij kamertemperatuur. Bereiden een verse partij van volledige cellysis-buffermengsel door toevoeging van de bovenstaande supplementen bij de aanbevolen definitieve concentraties aan de voorraad cellysis buffer en op ijs op te slaan.
  2. Plaats de buis met de bereid kralen (uit stap 2.9) aan de magneet voor 2 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
  3. Voeg 150 µL van ijskoude volledige pull-down-was buffer aan de kralen. Vortex voor 15 s en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 s. plaats de buizen op de magneet voor 2 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
  4. Herhaal stap 4.3 voor een totaal van 3 keer.
  5. Resuspendeer de kralen in 300 µL van volledige pull-down-was buffer.

5. pull-down van Target mRNA-miRNA complexen

  1. Breng 300 µL van de cel lysate (uit stap 3.8) aan de microfuge buis met 300 µL van parels (uit stap 4.5).
  2. Laat het mengsel op een nutating mixer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken.
  3. Plaats de buis op de magneet voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
  4. Voeg 300 µL van ijskoude volledige pull-down-was buffer naar de kralen. Vortex voor 15 s bij kamertemperatuur en plaats de buis op de magneet voor 5 min. zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
  5. Herhaal stap 5.4 twee meer tijden.
  6. Resuspendeer de kralen in 100 µL van nuclease-gratis water en uit te broeden op ijs.

6. totale extractie van RNA, cDNA synthese en qPCR

  1. Uittreksel totaal RNA van de geresuspendeerde kralen (uit stap 5.6) met behulp van een geschikte methode (Zie Tabel van materialen). Resuspendeer de uitgepakte totaal RNA in 25 µL nuclease-gratis water. Bepaal de concentratie van RNA en de kwaliteit met behulp van een spectrofotometer (absorptie bij 260/280). Een voorraad van de werken van RNA bij 50 ng/µL voor te bereiden.
  2. Uitvoeren van cDNA synthese, in triplicates, met behulp van 50 ng van totale RNA (uit stap 6.1) met behulp van een passende cDNA synthese kit (Zie Tabel van materialen) met behulp van oligo dT inleidingen in een eindvolume van 20 µL (tabel 1). Dan laden PCR buizen in de qPCR instrument voor het uitvoeren van de temperatuurcycli volgens de voorwaarden beschreven in tabel 2.
  3. QPCR op de CDNA (uit stap 6.2) uitvoeren met behulp van SYBR groene chemie (zie tabel van materialen):
    1. Alle reacties van de qPCR in triplicates in een 96 geschiedenisboeken bodemplaat onder steriele omstandigheden uitvoeren.
    2. Aliquot 9 µL van het reactiemengsel van de meester qPCR mix (Zie tabel 3) in elk putje van de plaat. Dan, voeg 1 µL van het cDNA aan elk putje tot een eindvolume van 10 µL. zegel de PCR-plaat met behulp van de hittebestendige PCR plaat sealer en laden in het qPCR-instrument
    3. Temperatuurcycli volgens de voorwaarden beschreven in tabel 4uitvoeren
    4. Normaliseren van de niveaus van de expressie (Ct-waarden) van elk monster voor de expressie van het gecodeerde besturingselement. Gebruik deze waarden voor het berekenen van de vouw wijzigingen in expressie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAs regelen cellulaire processen door binding aan target mRNAs. Identificeren mRNA doelstellingen zijn dus een sleutel tot het begrijpen van miRNA functie. Hier werken we een methode voor het identificeren van mRNA doelwit van cellulaire miRNA. Dit protocol is aangepast van Wani et al. 35 met de wijziging van het gebruik van biotinyleerd LNA gebaseerde miRNA nabootsers aan pulldown target mRNA. Het gebruik van oligonucleotide LNA gebaseerde nabootsers v...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificatie van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs is belangrijk voor het begrijpen van hun regulerende functie. Verschillende computerhulpmiddelen werkzaam zijn te voorspellen van doelstellingen op basis van zaad reeks complementariteit en de instandhouding van doel sequenties19,20. Hoewel deze hulpprogramma's waardevol zijn, kunnen ze genereren hoge niveaus van zowel valse positieven en valse negatieven. Deze voorspellingen zijn dus gekoppeld aan exper...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële en niet-financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies DA037779 (naar J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 en MD007586 (tot C.D.). Het werk werd ook ondersteund door de RCMI Grant G12MD007586, de Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, verlenen de Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 van NCRR/NIH, de U54 Grant MD007593 van NIMHD/NIH en de Tennessee-centrum voor AIDS Onderzoek (P30 AI110527).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line- HEK293T cellenATCCCRL-3216
Heat-inactivated foetaal bovien serum (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco’s aangepast Eagle’s medium (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Trypsine-EDTA (0,25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Penicilline-Streptomycine oplossing (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM Medium met verminderd serumGIBCO/Thermofisher3198-088
Lipofectamine 2000 Transfectie reagensInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Biotinyleren hsa-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
Biotinyleren willekeurige controleExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptavidine magnetische kralenPierce88816
Gist tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA2153
Kaliumchloride (KCl) oplossingSigma-Aldrich60142
Magnesiumchloride (MgCl2) oplossingSigma-AldrichM1028
Natriumhydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Ethyleendiamine tetraazijnzuur, dinatriumzout (EDTA) oplossing, 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340
RNAse/DNAse vrije waterGIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy extractie kitQiagen74104
iScript-Select cDNA synthese kitBiorad170-8897
qPCR Primers Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagneetInvitrogen/Thermofisher12320D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340(2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotin based Pulldown AssaymiRNA Target ValidationStreptavidin coated Magnetic BeadsBiotinylated miRNA MimicsLocked Nucleic Acid MimicsqPCR based QuantificationCellular Lysate PreparationmiR 125b PARP 1 InteractionNucleic Acid Pull downRNA Isolation Protocol

Related Articles