Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gezonde hersenen-hypofyse segmenten voor elektrofysiologische onderzoek van hypofyse cellen in Teleost vis

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

16 augustus 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het artikel beschrijft een geoptimaliseerde protocol voor het maken van goed functionerende hersenen-hypofyse weefsel segmenten, met behulp van de teleost vis medaka (Oryzias latipes), gevolgd door elektrofysiologische opnames van hypofyse cellen met behulp van de patch-clamp techniek met de geperforeerde patch configuratie.

Samenvatting

Elektrofysiologische onderzoeken van hypofyse cellen zijn uitgevoerd in talrijke gewervelde dieren, maar zeer weinigen in teleost vis. Onder deze, zijn de duidelijke meerderheid uitgevoerd op gedissocieerde primaire cellen. Verbetering van ons inzicht in hoe teleost hypofyse cellen, gedragen in een meer biologisch relevante omgeving, dit protocol laat zien hoe voor te bereiden van levensvatbare hersenen-hypofyse segmenten met behulp van de kleine zoetwatervis medaka (Oryzias latipes). Het maken van de hersenen-hypofyse segmenten, werden pH en de osmolaliteit van alle oplossingen aangepast aan de waarden gevonden in de lichaamsvloeistoffen van zoetwatervissen wonen bij 25 tot 28 ° C. Na de bereiding segment, het protocol geeft aan hoe voeren elektrofysiologische opnamen met behulp van de geperforeerde geheel-cel patch-clamp techniek. De patch-clamp techniek is een krachtig hulpmiddel met ongekende temporele resolutie en gevoeligheid, waardoor onderzoek van de elektrische eigenschappen van intact hele cellen tot één ionenkanalen. Geperforeerde patch is uniek in die zin dat het houdt het intracellulaire milieu intact regelgevende elementen in het cytosol verhindert wordt verdund door de patch Pipetteer elektrode oplossing. In tegenstelling, bij het uitvoeren van traditionele geheel-cel opnamen, werd naar voren gebracht dat medaka hypofyse cellen snel hun vermogen verliezen om het vuur van de actie potentieel. Onder de verschillende perforatie technieken beschikbaar, dit protocol laat zien hoe om perforatie van het herstelde membraan met behulp van het fungicide amfotericine-B.

Inleiding

De hypofyse is een belangrijke endocriene orgaan in gewervelden gelegen onder de hypothalamus en posterieure aan de optiek opticum. Het produceert en scheidt van zes tot acht hormonen uit de specifieke celtypen. Hypofyse hormonen vormen een intermediair tussen de hersenen en perifere organen en rijden een breed scala van essentiële fysiologische processen, met inbegrip van de groei, de voortplanting, en de verordening van homeostase. Vergelijkbaar met neuronen, endocriene cellen van de hypofyse zijn elektrisch prikkelbaar met de mogelijkheid om de actie potentieel spontaan brand 1. De rol van het potentieel van deze actie is cel afhankelijk. In verschillende celtypen van de zoogdieren hypofyse, kan actie potentieel verheffen de intracellulaire Ca2 + voldoende voor een duurzame release van hormoon 2. Daarnaast ontvangt de hypofyse zowel stimulerende en inhiberende informatie van de hersenen dat invloed op de membraanpotentiaal van de cellen 3,4,5,6. Meestal stimulerend input verhoogt de prikkelbaarheid en vaak gaat om de vrijlating van Ca2 + van intracellulaire winkels evenals toegenomen frequentie 7afvuren. Begrijpen hoe de cel maakt gebruik van de ion kanaal samenstelling en past zich aan deze input signalen van de hersenen is de sleutel tot begrip hormoon synthese en release.

De patch-clamp techniek werd ontwikkeld in de late jaren 1970 door Sakmann en Neher 8,9,10 en verder verbeterd door Hamill 11, en maakt het mogelijk gedetailleerd onderzoek van elektrofysiologische eigenschappen van cellen tot één ionenkanalen. Bovendien, de techniek kan worden gebruikt voor de bestudering van zowel de huidige als de spanning. Vandaag, is patch-klemmen de gouden standaard voor het meten van elektrofysiologische eigenschappen van de cel. Vier grote configuraties van de goede afdichting patch-clamp techniek geweest ontwikkelde 11; de cel-ingeschrevenen, de binnenstebuiten, de buiten-out en de patch geheel-cel. De drie eerste configuraties worden doorgaans gebruikt voor één ion kanaal onderzoeken. Voor het vierde, volgens de configuratie van cel-ingeschreven, is een gat in de celmembraan gemaakt met behulp van sub atmosferische druk. Deze configuratie kan ook onderzoeken van de ion kanaal samenstelling van de gehele cel 12. Een beperking van deze techniek is echter dat de cytoplasmatische moleculen door de patch Pipetteer oplossing 13 (Figuur 1A), dus op het gebied van de elektrische en fysiologische reacties van de bestudeerde cellen worden verdund. Sommige van deze moleculen kunnen inderdaad, een belangrijke rol spelen in de transductie van het signaal of in de regulatie van verschillende ionenkanalen. Om dit te vermijden, ontwikkelde Lindau en Fernandez 14 een methode waar een porie-vormende compound is toegevoegd aan de patch pipet. Na de configuratie van de cel-ingeschrevenen zal de compound integreren in het plasma-membraan onder de patch en langzaam perforate het membraan elektrisch contact maken met het cytosol (Figuur 1B). Verscheidene verschillende antischimmelmiddelen zoals nystatine 15 en amfotericine B 16, of oppervlakteactieve stoffen zoals de saponine bèta-escin 17,18 , kunnen worden gebruikt. Deze verbindingen maken poriën groot genoeg is om te laten monovalent kation en Cl- verspreiding tussen het cytosol en de patch pipet met behoud van de cytosolische niveaus van macromoleculen en grotere ionen zoals Ca2 + 15, 16.

De uitdaging van het gebruik van geperforeerde patch is de weerstand van de potentieel hoge serie. Serie weerstand (Rs) of toegang weerstand is de gecombineerde weerstand over de patch pipet ten opzichte van de grond. Tijdens de opnames van de patch-clamp, zullen de Rs parallel met membraan weerstand (Rm). Rm en R,s in parallelle werk als een divider spanning. Met de hoge Rs, zakt de spanning over de Rs geven fouten in de opnames. De fout zal worden groter met grotere stromen opgenomen. Daarnaast is de spanning divider ook frequentie afhankelijk maken van een low-pass filter, dus op het gebied van de temporele resolutie. In feite kan de geperforeerde patch niet altijd toestaan opnames van grote en snelle stromingen zoals de spanning gated nb+ stromingen (voor gedetailleerde lezingen Zie referentie 19). Rs kan ook variëren tijdens opnames in patch-clamp, opnieuw leiden tot veranderingen in de opgenomen stroom. Valse positieven kunnen dus optreden in situaties waar Rs tijdens de toepassing van de drug verandert.

De electrofysiologie over de gesneden weefsel is geïntroduceerd door het Andersen-lab te bestuderen elektrofysiologische kenmerken van de neuronen in de hersenen- 20. De techniek geëffend voor gedetailleerde onderzoeken van afzonderlijke cellen, alsmede cel-cel communicatie en cel circuits in een omgeving met meer intact. Een soortgelijke techniek voor het maken van de hypofyse segmenten werd in 1998 geïntroduceerd door Guérineau et al. 21. het was echter niet vóór 2005, dat de bereiding van hersenen-hypofyse segment was met succes gebruikt voor patch-clamp studies in teleost 22. In deze studie de auteurs ook gemeld het gebruik van geperforeerde patch-clamp opnames. Echter verreweg hebben de meeste van de elektrofysiologische onderzoeken van hypofyse cellen plaatsgevonden in zoogdieren, en slechts een handvol andere gewervelde dieren, met inbegrip van teleost vis 1,2,22,23 . In teleosts, werden bijna alle studies uitgevoerd op primaire gedissocieerde cellen 24,25,26,27,28,29,30 .

In het huidige document, duidelijk naar voren komt een geoptimaliseerde protocol voor de voorbereiding van de gezonde hersenen-hypofyse segmenten van het model vis medaka. De aanpak vertegenwoordigt verschillende voordelen ten opzichte van primaire gedissocieerde celculturen. Ten eerste, de cellen worden opgenomen in een relatief bewaarde omgeving ten opzichte van cel kweekomstandigheden losgekoppeld. Ten tweede laten segment preparaten te bestuderen van indirecte trajecten gemedieerd door cel-cel communicatie 22, die is niet mogelijk in de kweekomstandigheden gedissocieerde cel. Bovendien laten we zien hoe te voeren elektrofysiologische opnames op het verkregen weefsel segmenten met behulp van de geperforeerde geheel-cel patch-clamp techniek met amfotericine B als de porie-vormende agent.

Medaka is een kleine zoetwatervis Azië, voornamelijk gevonden in Japan. De fysiologie, embryologie en genetica van medaka zijn uitvoerig bestudeerd voor meer dan 100 jaar 31, en het is een veelgebruikte onderzoeksmodel in veel laboratoria. Voor dit papier van bijzonder belang is de verschillende morfologische organisatie van de hypothalamus-hypofyse-complex in teleost vis: Overwegende dat in zoogdieren en vogels vrij de hypothalamische neuronen hun neuro-hormonen reguleren van hypofyse endocriene cellen in de portal system van de mediane eminentie is er een directe nerveus projectie van hypothalame neuronen op de endocriene cellen van de hypofyse in teleost vis 32. Dus is zorgvuldig uitgevoerde hersenen-hypofyse snijden van bijzonder belang in vis, waardoor wij onderzoeken elektrofysiologische kenmerken van de hypofyse cellen in een goed bewaarde hersenen-hypofyse-netwerk, en met name hoe hypofyse cellen controle van hun prikkelbaarheid en daarmee Ca2 + homeostase.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dier behandeling werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor de zorg en het welzijn van dieren die onderzoek in de Noors-Universiteit van biowetenschappen, en onder toezicht van gemachtigde onderzoekers.

1. voorbereiding van instrumenten en oplossingen

Opmerking: Alle oplossingen moet steriel zijn. Zorgvuldige aandacht moet uitgaan naar de pH en de osmolaliteit (osmol/kg water) van alle oplossingen, die zorgvuldig moet worden aangepast aan de extracellulaire omgeving bestudeerde soorten. pH en de osmolaliteit moeten worden aangepast met nauwkeurige elektronische apparatuur zoals pH-meter en vriespunt osmometer respectievelijk.

  1. Maken van de extra-cellulaire oplossing zonder Ca2 + 500 mL (Ca2 + gratis EG): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glucose, 10 mM Hepes.
    1. Los 4.38 g NaCl, 186.37 mg KCl, 61.89 mg van MgCl2, 360.32 mg van Glucose en 1.19 g HEPES in 450 mL ultrazuiver (0.055 uS / cm op 25 ° C, de soortelijke weerstand van 18.2 MOhm) H2O in een bekerglas van glas met een magnetische roerder.
    2. Breng de pH op 7,75 met NaOH.
    3. Breng de oplossing kwantitatief over in een volumetrische maatkolf van 500 mL. Vul de maatkolf met ultrazuiver H2O tot 500 mL.
    4. Meng de oplossing goed voor het meten van de osmolaliteit. Aanpassen aan 290-300 mOsm met mannitol. Filter steriliseren de oplossing met water vacuümsysteem en 0,2 µm filter.
  2. Maken van de extra-cellulaire oplossing (EG) 500 mL: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glucose, 10 mM Hepes.
    1. Los 4.38 g NaCl, KCl 186.37 mg, 147.01 mg CaCl2, 61.89 mg MgCl2, 360.32 mg van Glucose en 1.19 g HEPES in 450 mL ultrazuiver H2O in een bekerglas van glas met een magnetische roerder.
    2. Breng de pH op 7,75 met NaOH.
    3. Breng de oplossing kwantitatief over in een volumetrische maatkolf van 500 mL. Vul de maatkolf met ultrazuiver H2O tot 500 mL.
    4. Meng de oplossing goed voor het meten van de osmolaliteit. Aanpassen aan 290-300 mOsm met mannitol. Filter steriliseren de oplossing met water vacuümsysteem en 0,2 µm filter.
  3. Breng 500 mL oplossing van de extra-cellulaire met 0,1% bovien serumalbumine (EG met BSA): 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, 4 mM glucose, 10 mM Hepes.
    1. Los 4.38 g NaCl, KCl 186.37 mg, 147.01 mg CaCl2, 61.89 mg MgCl2, 360.32 mg van Glucose en 1.19 g HEPES in 450 mL ultrazuiver H2O in een bekerglas van glas met een magnetische roerder.
    2. Breng de pH op 7,75 met NaOH.
    3. Breng de oplossing kwantitatief over in een volumetrische maatkolf van 500 mL. Vul de maatkolf met ultrazuiver H2O tot 500 mL.
    4. Meng de oplossing goed voor het meten van de osmolaliteit. Aanpassen aan 290-300 mOsm met mannitol. Filter steriliseren de oplossing met water vacuümsysteem en 0,2 µm filter. Voeg 50 mg BSA.
  4. Maken van intracellulaire (IC) 250 mL: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM sacharose.
    1. Los 1,54 g KOH, 327.75 mg van KCl, 595.75 mg HEPES en 1.712 g van sacharose in 450 mL ultrazuiver H2O in een bekerglas van glas met een magnetische roerder.
    2. Breng de pH op 7,2 met (N-morfolino) ethaan Sulfonzure (MES) zuur.
    3. Breng de oplossing kwantitatief over in een volumetrische maatkolf van 250 mL. Vul de maatkolf met ultrazuiver H2O tot 250 mL.
    4. Meng de oplossing goed voor het meten van de osmolaliteit. Aanpassen aan 280-290 mOsm (10 lager dan EG mOsm) met sacharose. Filter steriliseren de oplossing met water vacuümsysteem en 0,2 µm filter.
  5. Maken van 100 mL 2% lage smeltende agarose oplossing in Ca2 + en BSA gratis EG (lage smeltende agarose in 100 mL Ca2 + 2 g gratis EG). Los met behulp van een magnetron en de gesmolten agarose plaats in een waterbad bij 40 ° C. Laat het afkoelen totdat zij 40 ° C vóór gebruik op de weefsels tot.
    Opmerking: EG, Ca2 + gratis EG kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor enkele weken als steriel en IC solutions bij-20 ° C, voor enkele maanden. Agarose kan worden opgeslagen voor een week bij 4 ° C en 3-5 keer kan worden hergebruikt door alle kort magnetron. Buitensporige hergebruik zal leiden tot verdamping en wijziging van agarose en zoute concentratie en kwaliteit.
  6. Agar brug maken:
    1. Warmte van 7.5 mm lange borosilicaatglas haarvaten met buiten diameter (OD) 2 mm en binnendiameter (I.D.) 1.16 mm met behulp van een bunsenbrander op een centraal punt u ongeveer 1/3 van het ene einde tot het glas begint te buigen. Verwijderen van het glas van de vlam en laat het glas te buigen met een hoek van ongeveer 120 graden(Figuur 2).
    2. Smelt 2% agar in normale EG zonder glucose met behulp van een magnetron, en terwijl de agarose is vloeibare vulling de pre-en-klare glazen capillaire met behulp van capillariteit krachten door één van de uiteinden van het glas in de vloeistof en enkele minuten te wachten. Bruggen bewaren tot gebruik bij 4 ° C in de EG zonder glucose.
  7. Bereiden borosilicaatglas met gloeidraad patch pipetten met behulp van een geschikte Pipetteer trekker. Raadpleeg de handleiding van de trekker pipet te verkrijgen van de gewenste elektrode weerstand.
    Opmerking: De conus van de pipet moet zo kort mogelijk. Korte Pipetteer taper wordt bereikt met behulp van 4 – 6 trekken stappen. De weerstand van de elektrode moet tussen 2 en 6 MΩ afhankelijk van de celgrootte van de.
  8. Om te vermijden verkeer van weefsel tijdens de experimenten van de patch-clamp coat het oppervlak van de opname-kamer met 0,1% van het polyethylenimine (PEI) in boraat buffer.
    1. 500 mL boraat buffer (25 mM) voor te bereiden:
      1. Los 4.768 g nb2B4O710 H2O in 450 mL ultrazuiver H2O in een bekerglas van glas met een magnetische roerder.
      2. Breng de pH op 8.4 met HCl.
      3. Breng de oplossing kwantitatief over in een volumetrische maatkolf van 500 mL. Vul de maatkolf met ultrazuiver H2O tot 500 mL en 0,2 µm filter steriliseren de oplossing om met water vacuümsysteem.
    2. Bereid een 1%-stockoplossing van PEI (1 mL 50% PEI aan 49 mL 25 mM boraat buffer) en een 0,1% PEI verdunning door verdunning 10 µL van 1% stockoplossing in 100 µL van boraat buffer voor eindgebruik.
    3. Voeg 2 mL 0,1% PEI op het glas van de houder van het segment en laat de coating Incubeer gedurende 1 minuut. Vervolgens kort wassen het glas tweemaal met 5 mL van ultrazuiver H2O en laat lucht drogen tot gebruik.
  9. Amfotericine B oplossingen voor te bereiden.
    1. Maak 60 mg/mL voorraadoplossing door ontbinding van 3 mg amfotericine B poeder in 50 µL dimethylsulfoxide (DMSO), in een tube van de 1 mL beschermd tegen licht. Vortex bij de maximumsnelheid voor 30 s en bewerk ultrasone trillingen ten voor 15 min te homogeniseren. Aliquots opslaan in 3 – 5 buizen bij-20 ° C en één aliquot per dag gebruiken.
      Opmerking: Als de stockoplossing van amfotericine-B niet duidelijk en gele is kleur maar melkachtig (nog steeds geel) na 15-20 min ultrasoonapparaat moet een nieuwe stamoplossing.
    2. Maak IC oplossing met amfotericine B door pipetting 2 mL van de IC in een bekerglas schoon glas met meer dan 10 mL capaciteit. Voeg 8 µL van de stockoplossing amfotericine B in de pipet oplossing en meng door pipetteren. Wikkel het bekerglas af met aluminiumfolie en plaats op het ijs tot gebruik en vernieuwen het elke 3 h.

2. dissectie en snijden met Vibratome

  1. Bereid de dissectie tools voor ontleden, waarvan één scherpe en één sterke pincet met een schaar. Reinig de tools (weefsel houder, borstel, verlostang) met ethanol en ervoor te zorgen dat zij alleen met het oog op dissectie en nooit in contact met vaste weefsels worden gebruikt. Houd ze in een afzonderlijk vak om verontreiniging te voorkomen.
  2. De vis in het koude ijs water voor 1 min euthanaseren.
  3. Volg de volgende stappen om snel ontleden de medaka hersenen en hypofyse met scherpe pincet (gebruik niet meer dan 3 min).
    1. Terwijl houden de vis met de sterke verlostang ernstige de twee optische zenuwen achter de ogen met een schaar of pincet scherp.
    2. Open het dorsale deel van de schedel van de posterior aan de voorste kant door het breken van de botten van de schedel stap voor stap met een sterke Tang.
    3. Afschilferen van de schedel aan de ene kant met een sterke Tang.
    4. Ernstig het ruggenmerg met schaar of scherp pincet.
    5. Zacht, pak van het ruggenmerg met de Tang, spiegelen van de hersenen van posterieure aan anterior en plaats deze in een schotel met de ijskoude Ca2 + gratis EG.
  4. Een 1,5-2 cm3 metalen mal vullen met vloeibare agarose en plaats deze op het ijs.
  5. Net voordat de agarose stolt (bij ongeveer 25-30 ° C), zachtjes de hersenen door het ruggenmerg Grijp met de Tang, de Tang met een stukje fijn papier droog en zet het weefsel in de agarose. Snel Meng de agarose te verdunnen van de sporen van EG liet rond het weefsel en oriënteren van het weefsel en laat de mal op ijs voor een paar seconden ingedrukt totdat de agarose verhardt.
    Opmerking: Het is essentieel voor deze stap te snel. De agarose stolt snel als de metalen mal is afgekoeld door het ijs.
  6. Een vierkant blok van agarose met het weefsel met een scalpel mes trim en lijm deze op het vibratome monsterhouder met behulp van chirurgie (niet-toxisch) lijm.
  7. Vul de meetcel van de vibratome ontvangen van de monsterhouder (hersenen-hypofyse) met ijskoude Ca2 + gratis EG.
  8. Plaats van de monsterhouder in de vibratome en snijd het agarose blok zodat parasagittal secties van 150 µm, met behulp van hoge frequentie en de lage snelheid voor het segmenteren. Verzamelen van de geselecteerde secties en plaats ze in de patch-clamp opname kamer met 3 mL van ijskoude Ca2 + gratis EG.
  9. Plaats het raster harp (Figuur 2B) op de weefselsectie.
    Opmerking: De harp zal samen met de coating het weefsel te stabiliseren en te voorkomen dat het tijdens de opnames van de patch-clamp.
  10. Nadat de harp op zijn plaats is, omzetten in het Ca2 + gratis EG medium de normale EG met Ca2 + en BSA. Laat de rest van de weefsel gedurende 10 minuten.

3. geperforeerd Patch-clamp en elektrofysiologische opnames

  1. Voordat u het experiment start, chloride zilver draad elektroden door de volgende stappen: eerst met behulp van een fijn schuurpapier (p180) de elektroden van zilver draad schoon te maken. Ten tweede spoel met 2 mL, 70% ethanol. Ten derde, dompel de draden in 2 mL, 2-5% chloor gedurende 10 minuten. Ten slotte spoel met 2 mL, ultrazuiver H2O.
  2. Plaats van de kamer van de opname met de hersenen-hypofyse-schijfje in het stadium van de Microscoop en zoek het doelgebied (hypofyse) 10 X streven naar betere coördinatie en inspecteren van de cellen met behulp van 40 X doelstelling.
    Opmerking: Als de voorbereiding succesvol is, zeer weinig ronde cellen zichtbaar moeten zijn. Deze ronde cellen zijn meestal beschadigde cellen die zijn loskoppelen van het weefsel.
  3. De elektrode van de aarding door middel van de 2% agar-brug in de EG-Bad plaatsen.
  4. Zoek een gezonde cel met behulp van de 40 X doelstelling.
    Opmerking: Een gezonde cel moet worden stevig gekoppeld aan het weefsel segment en niet naar boven afgerond en losgekoppeld van het segment.
  5. Instellen van de versterker in spanning-clamp (VC; Figuur 4A punt 1) modus. Open het zegel test venster en druk op het bad configuratie (figuur 4B punt 1 en 2. Gebruik een 5-mV-puls om te controleren Pipetteer weerstand (figuur 4B punt 3).
  6. Aanvulling van het uiteinde van de Pipet van de patch met de antischimmel gratis IC oplossing voordat u de IC-oplossing toevoegt met amfotericine B met behulp van een micro-filler spuit funderingsput (Zie Figuur 3).
  7. Voeg een licht positief luchtdruk in de patch Pipetteer met behulp van de 1 mL spuit.
    Opmerking: Dit maakt een kleine vloeibare stroom van de patch-pipet dat voorkoming van verontreiniging van de tip.
  8. Eenmaal in het bad, de patch Pipetteer weerstand te beoordelen en ervoor te zorgen dat geen deeltjes zijn gekoppeld aan het uiteinde van de Pipet (figuur 4C).
    Opmerking: Een klein stukje tape is aangesloten op de monitor weer te geven van de video-opname-vorm het gezichtsveld. Dit maakt de positionering van de patch pipet ten opzichte van cel gemakkelijker wanneer de doelstelling niet op de cel gericht is.
  9. Begeleiden van de patch pipet naar de cel met behulp van micromanipulators.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de pipet schoon is door te kijken naar kleine deeltjes die deze mogelijk gekoppeld aan het uiteinde van de pipet. Plotselinge veranderingen in de weerstand kunnen ook een gevolg zijn van deeltjes vastzitten in het uiteinde van de pipet.
  10. De pipet wanneer een paar passen micron boven de cel zodat het uiteinde van de Pipet de cel 1/3 vanaf het midden van de cel, raken zal zoals afgebeeld in Figuur 5. Bij het aanraken van de cel, laat de druk en de zachte afzuigen zodat een zegel.
    Opmerking: De tijd van de patch pipet treedt het bad tot een succesvolle zegel moet zo kort mogelijk worden gehouden. Niet meer dan 1 – 1,5 min teneinde amfotericine B in de uiteinde van de pipet en de lek in het bad te bereiken.
  11. Onmiddellijk overschakelen naar het venster van de patch in de patch-clamp software (Figuur 4 D , punt 1) en hebben een bedrijf potentieel tussen-50 en -60 mV (Figuur 4 d , punt 2). Nul uit de snelle capaciteit opgebouwd door de glazen pipet (Figuur 4 d , punt 3).
  12. Overschakelen naar het venster van de cel in patch-clamp software (figuur 4E punt 1 en 2) en beginnen met de monitoring van toegang weerstand, Ra, weergegeven in het venster. Nul uit de capaciteit van de membraan in de versterker software (figuur 4E punt 3) na voldoende toegangsrechten.
    Opmerking: Voldoende toegang kan duren 10 tot 30 min (figuur 4E punt 2). Een goede toegang voor huidige klem opnamen moet minder dan 20 M.
  13. Schakel over naar de huidige klem, IC, in versterker software venster (figuur 4F punt 1). Aanpassen van de snel-capacitieve stromen in het ik-clamp- venster van de software van de versterker (figuur 4F punt 2 en 3) op dezelfde waarde als in 3.12. Controleer de membraanpotentiaal (figuur 4F punt 1).
    Opmerking: Belangrijker, als de membraanpotentiaal ondiep is (typisch boven-35 mV) de cel mogelijk beschadigd. De opname annuleren en een nieuwe cel vinden.
  14. Na het vinden van een gezonde cel (stevig bevestigd aan het weefsel met de membraanpotentiaal onder -40 mV), de experimentele opnames starten zoals beschreven in de fabrikant protocol 33,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol toont een stap voor stap-protocol over het bereiken van betrouwbare elektrofysiologische opnames uit de hypofyse (gonadotrope) cellen, de opdrachtregel medaka transgene [GS (lhb- hrGfpII)] waar de doel cellen (Lh-producerende gonadotropes) worden aangeduid met de groen fluorescente proteïne (GFP).

In eerste instantie werden het elektrofysiologische onderzoeken uitgevoerd met de configuratie van de gehele-ce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Elektrofysiologische opnamen met behulp van de patch-clamp techniek op segmenten van de hersenen-hypofyse vereisen zorgvuldige optimalisatie. Goed geoptimaliseerde protocollen voor live-cel onderzoek specifiek in de teleosts zijn beperkt, met de meerderheid van de publicaties met behulp van protocollen die zijn gebaseerd op zoogdieren systemen. In dit verband is het belangrijk dat u zich bewust van het feit dat verschillende fysiologische parameters als pH en de osmolaliteit zijn niet alleen soorten afhankelijk, maar ook...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

Wij danken mevrouw LourdesCarreon G Tan voor haar te helpen handhaven van de medaka faciliteit en Anthony Peltier voor de illustratieve figuren. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad onderzoek van Noorwegen, subsidie nummers 244461 (aquacultuur programma) en 248828 (digitaal leven Noorwegen programma).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
VibratomeLeicaVT1000 S
Chirurgical glueWPIVETBOND3M Vetbond Tissue Adhesive
Stainless steel bladesCampden Instruments752-1-SS
metal moldsSAKURA4122
steel harpWarner instruments64-1417
PBSSIGMAD8537
Ultrapure LMP agaroseinvitrogen166520-100
patch pipettesSutter InstrumentBF150-110-10HPBorosilicate met filament O.D.:1,5 mm, I.D.:1,10 mm
Microscope SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Molecular Devices#1-2500-0180sofware
Digitizer Digidata 1550A1Molecular DevicesDD1550
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoracetaat zout 
pipette pullerSutter InstrumentP-1000
amphotericin BSIGMAA9528pore-vormend antibioticum
polyethylenimine SIGMAP314350% PEI-oplossing
microfiler syringeWPIMF28/g67-5
glass for the agar bridgeSutter InstrumentBF200-116-15Borosilicate met filament O.D.:2,0 mm, I.D.:1,16 mm Vuur gepolijst
Micro-Manager softwareOpen Source Microscopie Software
optiMOS sCMOS cameraQimaging 01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicatorElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-GlucoseSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl2SiGMAC8106
SucroseSiGMA84097
D-mannitolSiGMA63565
MES-acidSIGMAM0895
BSASIGMAA2153

Referenties

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Elektrofysiologische registratiesgeperforeerde patch clampamfotericine B perforatiehypofyse van teleoste nsvissenMedaka Oryzias latipesvibratoomsnijdenwhole cell patch clampactiepotentiaalregistratiecalciumvrije oplossing
Gezonde hersenen-hypofyse segmenten voor elektrofysiologische onderzoek van hypofyse cellen in Teleost vis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.