Het artikel beschrijft een geoptimaliseerde protocol voor het maken van goed functionerende hersenen-hypofyse weefsel segmenten, met behulp van de teleost vis medaka (Oryzias latipes), gevolgd door elektrofysiologische opnames van hypofyse cellen met behulp van de patch-clamp techniek met de geperforeerde patch configuratie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gezonde hersenen-hypofyse segmenten voor elektrofysiologische onderzoek van hypofyse cellen in Teleost vis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Elektrofysiologische onderzoeken van hypofyse cellen zijn uitgevoerd in talrijke gewervelde dieren, maar zeer weinigen in teleost vis. Onder deze, zijn de duidelijke meerderheid uitgevoerd op gedissocieerde primaire cellen. Verbetering van ons inzicht in hoe teleost hypofyse cellen, gedragen in een meer biologisch relevante omgeving, dit protocol laat zien hoe voor te bereiden van levensvatbare hersenen-hypofyse segmenten met behulp van de kleine zoetwatervis medaka (Oryzias latipes). Het maken van de hersenen-hypofyse segmenten, werden pH en de osmolaliteit van alle oplossingen aangepast aan de waarden gevonden in de lichaamsvloeistoffen van zoetwatervissen wonen bij 25 tot 28 ° C. Na de bereiding segment, het protocol geeft aan hoe voeren elektrofysiologische opnamen met behulp van de geperforeerde geheel-cel patch-clamp techniek. De patch-clamp techniek is een krachtig hulpmiddel met ongekende temporele resolutie en gevoeligheid, waardoor onderzoek van de elektrische eigenschappen van intact hele cellen tot één ionenkanalen. Geperforeerde patch is uniek in die zin dat het houdt het intracellulaire milieu intact regelgevende elementen in het cytosol verhindert wordt verdund door de patch Pipetteer elektrode oplossing. In tegenstelling, bij het uitvoeren van traditionele geheel-cel opnamen, werd naar voren gebracht dat medaka hypofyse cellen snel hun vermogen verliezen om het vuur van de actie potentieel. Onder de verschillende perforatie technieken beschikbaar, dit protocol laat zien hoe om perforatie van het herstelde membraan met behulp van het fungicide amfotericine-B.
Inleiding
De hypofyse is een belangrijke endocriene orgaan in gewervelden gelegen onder de hypothalamus en posterieure aan de optiek opticum. Het produceert en scheidt van zes tot acht hormonen uit de specifieke celtypen. Hypofyse hormonen vormen een intermediair tussen de hersenen en perifere organen en rijden een breed scala van essentiële fysiologische processen, met inbegrip van de groei, de voortplanting, en de verordening van homeostase. Vergelijkbaar met neuronen, endocriene cellen van de hypofyse zijn elektrisch prikkelbaar met de mogelijkheid om de actie potentieel spontaan brand 1. De rol van het potentieel van deze actie is cel afhankelijk. In....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dier behandeling werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor de zorg en het welzijn van dieren die onderzoek in de Noors-Universiteit van biowetenschappen, en onder toezicht van gemachtigde onderzoekers.
1. voorbereiding van instrumenten en oplossingen
Opmerking: Alle oplossingen moet steriel zijn. Zorgvuldige aandacht moet uitgaan naar de pH en de osmolaliteit (osmol/kg water) van alle oplossingen, die zorgvuldig moet worden aangepast aan de extracellulaire omgeving bestudeerde soorten. pH en de osmolaliteit moeten worden aangepast met nauwkeurige elektronische apparatuur zoals pH-meter en vriespunt osmomet....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol toont een stap voor stap-protocol over het bereiken van betrouwbare elektrofysiologische opnames uit de hypofyse (gonadotrope) cellen, de opdrachtregel medaka transgene [GS (lhb- hrGfpII)] waar de doel cellen (Lh-producerende gonadotropes) worden aangeduid met de groen fluorescente proteïne (GFP).
In eerste instantie werden het elektrofysiologische onderzoeken uitgevoerd met de configuratie van de gehele-ce.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Elektrofysiologische opnamen met behulp van de patch-clamp techniek op segmenten van de hersenen-hypofyse vereisen zorgvuldige optimalisatie. Goed geoptimaliseerde protocollen voor live-cel onderzoek specifiek in de teleosts zijn beperkt, met de meerderheid van de publicaties met behulp van protocollen die zijn gebaseerd op zoogdieren systemen. In dit verband is het belangrijk dat u zich bewust van het feit dat verschillende fysiologische parameters als pH en de osmolaliteit zijn niet alleen soorten afhankelijk, maar ook.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Wij danken mevrouw LourdesCarreon G Tan voor haar te helpen handhaven van de medaka faciliteit en Anthony Peltier voor de illustratieve figuren. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad onderzoek van Noorwegen, subsidie nummers 244461 (aquacultuur programma) en 248828 (digitaal leven Noorwegen programma).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
| Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| metal molds | SAKURA | 4122 | |
| steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate met filament O.D.:1,5 mm, I.D.:1,10 mm |
| Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
| Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoracetaat zout |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-vormend antibioticum |
| polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI-oplossing |
| microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
| glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate met filament O.D.:2,0 mm, I.D.:1,16 mm Vuur gepolijst |
| Micro-Manager software | Open Source Microscopie Software | ||
| optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicator | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
| Sucrose | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-acid | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
Referenties
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trend....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
