Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zachte weefsels in het menselijk lichaam hebben meestal stijfheid in het bereik kilopascal (kPa). Dienovereenkomstig, siliconen en hydrogel flexibele substraten hebben bewezen nuttig substraten voor het kweken van cellen in een fysieke communicatie dat gedeeltelijk in vivo voorwaarden nabootst. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het karakteriseren van de Youngs moduli isotrope lineaire elastische ondergronden meestal gebruikt voor mechanobiology studies. Het protocol bestaat uit voorbereiding van een zacht siliconen substraat in een petrischaal of stijve siliconen coating van de oppervlaktelaag van de siliconen coating met fluorescerende kralen, met behulp van een millimeter-schaal bol laten inspringen van de oppervlaktelaag (door zwaartekracht), de TL imaging kralen op de ingesprongen siliconen oppervlak met behulp van een fluorescentie Microscoop, en het analyseren van de resulterende afbeeldingen als u wilt berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Koppeling van de oppervlaktelaag van het substraat met een moduli extracellulaire matrix eiwitten (naast de fluorescerende kralen) kan het siliconen substraat te gemakkelijk worden gebruikt voor de cel plating en latere studies met behulp van tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve silicone, in plaats van een petrischaaltje, als basis voor de zachte siliconen, maakt het gebruik van mechanobiology studies waarbij externe stretch. Een specifieke voordeel van dit protocol is dat een widefield fluorescentie Microscoop, die gewoonlijk beschikbaar in vele labs is, belangrijke uitrusting die nodig is voor deze procedure. We laten zien van dit protocol door het meten van de Youngs modulus van zachte siliconen substraten voor verschillende elastische moduli.
Inleiding
Cellen in zachte weefsels bevinden zich in een micro-omgeving waarvan stijfheid is in kilopascal bereik1, in tegenstelling tot weefselkweek gerechten waarvan stijfheid verschillende ordes van grootte hoger is. Vroege experimenten met cellen in de extracellulaire matrix eiwitten-bedekt zachte ondergronden toonde aan dat de stijfheid van het substraat beïnvloedt hoe cellen verplaatsen op, alsmede voldoen aan de extracellulaire matrix onder2,3. In feite, beïnvloedt de stijfheid van het substraat fundamenteel de cel functie4 op een wijze vergelijkbaar met doordringende biochemische signalen. Polyacrylamide gels (bekleed met extracellulaire matrix eiwitten) zijn (water-doordringt) hydrogels die intensief zijn gebruikt als cel cultuur substraten voor mechanobiology5 bestudeert. Polydimethylsiloxaan (PDMS), de meest voorkomende silicone (polysiloxaan), wijd gebruikt als een stijve siliconen met megapascal gasgroep stijfheid voor micron-schaal fabricage6. Meer recentelijk, zachte siliconen substraten met stijfheid in het meer fysiologisch relevante kilopascal bereik hebben gewerkt als cel cultuur substraten voor mechanobiology studies7,8.
Verschillende methoden zijn gebruikt voor het meten van de stijfheid van flexibele substraten, met inbegrip van atomaire kracht microscopie, macroscopische vervorming van hele monsters op zich het uitrekken, reologie en inspringen met behulp van bollen en sferisch getipt microindentors9 . Terwijl elke techniek zijn eigen voor- en nadelen heeft, is inspringen met een bol een bijzonder eenvoudige nog vrij nauwkeurige methode waarvoor alleen de toegang tot een widefield fluorescentie Microscoop. Inspringen met een metalen bol is gebruikt voor het meten van de stijfheid van de hydrogels in eerder werk3,9,10. Vroege werk dat het belang van substraat stijfheid aan cel beweging aangetoond gebruikt deze methode om te bepalen van hydrogel substraat stijfheid3. Confocale microscopie is recenter, ook gebruikt voor een elegante karakterisering10.
Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor het voorbereiden van een zacht siliconen substraat, koppeling van fluorescerende kralen (en een extracellulaire matrix eiwitten zoals collageen ik) gewoon aan de bovenste oppervlakte, imaging een inspringen sfeer en de bovenste oppervlakte met behulp van fase en fluorescentie imaging, respectievelijk, en ten slotte analyseren van de beelden om te berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Het zachte silicone substraat voorbereid op deze wijze kan gemakkelijk worden gebruikt voor tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve siliconen (in plaats van een petrischaal) als basis voor de zachte siliconen kan ook mechanobiology studies met een externe stretch. Gerechtvaardigde klachten zijn ook praktische overwegingen nodig voor het vermijden van mogelijke complicaties aangegeven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. fabricage van zachte siliconen coating
- Weeg 1.75 g van de een-component en 1,75 g van de B-component (A:B = 1:1) uit de zachte silicone-elastomeer kit met behulp van (polystyreen) met een gewicht van trays.
- De een-component toevoegen aan de B-component in de wegen lade en meng ze samen voor 5 min met behulp van een passende applicator stick.
- Het bovenstaande mengsel toevoegen aan een 35 mm petrischaal. Laat het mengsel gelijkmatig verspreid over de petrischaal voor een paar minuten.
Opmerking: De keuze van de diameter van de petrischaal en de hoeveelheid zachte siliconen bepaalt de dikte van de siliconen. Hier zullen de dikte ongeveer 3,5 mm; meer over het kiezen van de elastomeer-dikte in de sectie discussie . - Plaats de petrischaal met de siliconen mengsel, met het deksel af, in een vacuuemcel gedurende 15 minuten luchtbellen te verwijderen. Gedurende deze tijd, Verwarm een warmhoudplaat tot 70 ° C.
- Zodra de verwarmingsplaat 70 ° C bereikt, plaats een glasplaatje op en plaats vervolgens de petrischaal met de siliconen mengsel op het glasplaatje. Laat het silicone uitharding bij 70 ° C gedurende 30 minuten. Plaats de polystyreen schotel niet rechtstreeks op de hete plaat, zoals de petrischaal kan smelten.
2. koppelen van fluorescerende Microbeads aan het zachte Silicone
- Plaats de uitgeharde siliconen (in de onbedekte petrischaal) in een diepe UV-zaal (een ruimte met een diepe UV-lamp van licht golflengten van 185 en 254 nm). Het zachte silicone monster (~ 5-10 cm afstand van de UV-lamp) bloot aan diepe UV licht voor 5 min.
- Terwijl het silicone is blootgesteld aan diepe UV-licht, gaat u verder met stappen 2.2-2.6 hieronder. Na de diepe UV-blootstelling, ontgas de diepe UV kamer gedurende ten minste 5 minuten voordat het monster worden opgehaald.
- In de tussentijd, weeg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge 19 mg en 500 μL van gedeïoniseerd water (DI) water aan toevoegen. Los de EDC door zachtjes schudden van de buis.
- In een aparte 1,5 mL microcentrifuge buis, weeg 11 mg N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), 500 μL van DI water aan toevoegen en de sulfo-NHS ontbinden door zachtjes schudden van de buis. Vervolgens, combineren de EDG en sulfo-NHS oplossingen in een enkele microcentrifuge buis.
- Toevoegen aan de oplossing van deze EDC/sulfo-NHS, 30 μL van 0,44 μm diameter rood (of een andere fluorescentie-kleur gebaseerd op de filter kubussen beschikbaar in de fluorescentie Microscoop) carboxylaat bewerkt fluorescerende microbeads (met een 1% w/v voorraad concentratie).
- Voeg aan het mengsel van EDC/sulfo-NHS/kraal, 0,02 mg collageen I (van een staart van de rat, voorraad concentratie van 4 mg/mL in 0,02 M azijnzuur) te verkrijgen van een concentratie van ongeveer 0,02 mg/mL.
- Vortex de EDC/NHS/kraal/collageen ik mengsel kort om ervoor te zorgen dat de kralen zijn gelijkmatig verspreid over, voordat de koppeling.
- Pipetteer 1 mL van de EDC/NHS/kraal/collageen ik mengsel op een stuk parafilm geplaatst bovenop een andere ondiep, plat deksel (van kleinere diameter). De petrischaal met zachte silicone op dit mengsel omkeren zodat het zachte siliconen oppervlak contact op met het mengsel, maar niet rechtstreeks het oppervlak van de kleinere petrischaal deksel hieronder raakt. Dia's onder aan weerszijden van de omgekeerde petrischaal spacers om te trekken de omgekeerde petrischaal, gebruiken één of twee glazen.
Opmerking: Raadpleeg Figuur 1 te zien hoe stap 2.7 wordt uitgevoerd. - Dekking van het monster met aluminiumfolie en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Verwijder de petrischaal met zachte siliconen en zet het rechtop (siliconen-kant naar boven).
- Wassen van de zachte siliconen oppervlak met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door toevoeging van 2 mL PBS (pH 7.4) aan de schotel. Laat het zitten voor een paar minuten. Gecombineerd uit de PBS en wassen het silicone weer met 2 mL PBS. Laat de silicone remedie verder voor ongeveer een dag. Om die reden leg het zachte silicone monster in PBS bij 37 ° C's nachts.
3. meting van de siliconen stijfheid met bol inspringen met behulp van een Widefield fluorescentie Microscoop
- Ophalen van de petrischaal met zachte siliconen en ervoor te zorgen dat er ten minste 1 mL PBS hebben het siliconen oppervlak verschillende mm onder het vloeistofoppervlak.
- Met puntige pincetten, vijf 1 mm zirkonium bol indentors op het zachte silicone neerzet. De bollen in de vloeistof te dompelen en laat vallen hen, uit de buurt van de randen van de siliconen laag en ten minste 5 diameters van de indentor uit de buurt van de locatie van de andere indentors.
Opmerking: Toen liet boven het vloeistofoppervlak, de bollen kunnen mislukken om de vloeistof (float) als gevolg van oppervlaktespanning van de vloeistof. - Plaats de petrischaal met zachte siliconen in het werkgebied van de Microscoop zodat is het mogelijk om beeld via de petrischaal basis.
- Fase imaging met een 10 X doelstelling (zoals een droge 10 X objectieve na 0,30), zoekt en brengen een indentor bol in beeld.
- Neem een beeld van de fase van een deel of het geheel van de indentor en deze afbeelding opslaan. Gebruik een tegel scan indien beschikbaar. De indentor heeft geen zichtbare gebreken, verwijderen en vervangen door een andere indentor.
- Onder levende fase imaging, pan links van de indentor de rand zodat de linkerrand van het frame ten minste een afstand van ~1.5 R vanuit het midden van de indentor is. Ervoor zorgen dat het midden van de indentor aan de rechterkant, dicht bij de rechterrand van het frame van de afbeelding zichtbaar blijft. Neem een fase afbeelding en opslaan.
- De Microscoop lichtbron naar de verlichting voor de rode fluorescerende kanaal schakelen Met de x- en y-coördinaten ongewijzigd (de x-y positie van het middelpunt van de indentor binnen, maar in de buurt van de rechterrand van het frame), focus omlaag (afname Z) tot het rode fluorescerende microbeads onder de bol indentor het center Ga enkel onscherp.
- Neem een z-stack met een afbeelding voor elke z-waarde van 0,5 µm tot de microbeads in de bovenste laag van het silicone ver van de indentor (in de buurt van de linkerrand van het imaging frame) Ga onscherp.
- Herhaal stap 3.4-3.8 met de andere indentors van de steekproef.
4. berekening van het Silicone stijfheid (Youngs Modulus)
- Open de afbeelding van de fase van de indentor met behulp van ImageJ, klik op het lijngereedschap, en meet de diameter van de indentor in pixels. Klik en houd op een punt op de rand van de indentor, verplaats de cursor naar een diametraal tegenovergestelde punt op de rand en noteer de lengte in pixels weergegeven op de statusbalk van het hoofdvenster ImageJ voor het vrijgeven van de cursor.
- Controleer of de lengte-eenheid is ingesteld op pixels door te klikken op analyseren | Stel schaal en controle van de eenheid van lengte.
- De indentor de straal in pixels omzetten in μm door rekening houdend met de objectieve vergroting en de pixelgrootte van de CCD-camera (R in micrometer = R in pixels x de CCD camera pixelgrootte in micrometer / de objectieve vergroting).
- Open de rode kanaal z-stack van microbead beelden (als de microbeads rood fluorescerende) in ImageJ door te klikken op bestand | Import | Beeld van de reeks en selecteer een afbeelding in de stack en klik op OK om te openen de stack.
Opmerking: F1 is het framenummer waartegen de microbeads onder het indentor center in de best mogelijke focus en F2 is het framenummer waartegen de microbeads (op een gebied van ~1.5 R van de kraal centrum) in de buurt van de linkerrand van het frame in de best mogelijke focus zijn. De z-verschil tussen de twee frames is de manier van inspringen diepte δ.- Met het lijngereedschap in ImageJ aanzuigen en een lijn een welomschreven microbead in de afbeelding. Klik op analyseren | Plot profiel en klik op de knop Live te verkrijgen van de intensiteit van de scan bijgewerkte lijn over de kraal terwijl het selecteren van de verschillende frames. Het frame de hoogste waarde van de maximale intensiteit geeft kan worden gekozen als het frame in focus.
- Omdat de z-toename tussen de frames in de z-stack 0,5 μm is, berekenen de diepte van de inspringing in μm als δ = (F2-F1) x 0,5.
- Bereken de kracht die uitgeoefend wordt op de gel door de indentor door zijn gewicht (minus de uitbundige tegenkracht), dat wil zeggen, de inspringing kracht F, als het volume van de indentor x (de dichtheid van de indentor - de dichtheid van de vloeistof) x de versnelling als gevolg van de zwaartekracht. Gebruik de vergelijking F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρmedium) x g waar R de straal van de indentor is, ρindentor is de dichtheid van de indentor, ρmedium is de dichtheid van de vloeistof en g de versnelling als gevolg van de zwaartekracht (9.81 m/s2). Express alle hoeveelheden aan de rechterkant in SI-eenheden te verkrijgen van F (in N).
- Bereken de Youngs modulus (E) van het silicone met behulp van een gemodificeerde11 Hertz model12 vergelijking:
Waar:
c = een correctiefactor die wijzigt de Hertz model expressie die erop volgt;
v = Poisson de verhouding van de siliconen-gel (genomen als 0,5 wat betreft niet-samendrukbaar materiaal7);
F = de inspringing kracht;
R = de straal van de indentor; en
Δ = diepte van de inspringing.
Alle hoeveelheden Express aan de rechterkant in SI-eenheden te verkrijgen E in Pa.- Bereken de correctie factor c als volgt3:
Waar:
; en
.
Opgemerkt moet worden dat deze correctiefactor heeft specifiek betrekking op alleen worden gebruikt wanneer het zachte silicone ook aan de petrischaal (of stijve siliconen) eronder voldoet (dat is hier het geval). - Bereken de hoogte h van de zachte siliconen laag op basis van de hoeveelheid siliconen toegevoegd en de diameter van de petrischaal. Als alternatief, h direct verkrijgen bepalen van de z-coördinaat van de boven- en onderkant oppervlakken van de siliconen laag door fase imaging (kleine onzuiverheden komen in beeld aan beide oppervlak). Merk op dat voor een grote h (h2 > Rδ), de correctie factor c is dicht bij 1.
- Bereken de correctie factor c als volgt3:
- Herhaal stap 4.1-4.4 voor elke indentor. Het gemiddelde van de Youngs modulus elke indentor te verkrijgen van de gemiddelde Youngs modulus voor het silicone monster verkregen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het protocol die hierboven is uiteengezet, wij bereid siliconen in een 35 mm petrischaal, uitharden kan het oppervlak bij 70 ° C gedurende 30 minuten en combinatie van fluorescent microbeads (en collageen ik) naar de bovenste oppervlakte als schematisch afgebeeld in figuur 1. Diepe UV nog eerder is gebruikt voor de uiteindelijke proteïne koppelen aan substraten13. Opmerking (I) de uithardende voorwaarden die hier ge...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Terwijl de bol inspringing methode eenvoudig is te implementeren, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de keuze van de indentor en de dikte van het monster van de siliconen. De vergelijking voor de berekening van de Youngs modulus is geldig onder een aantal voorwaarden11en deze meestal wordt voldaan wanneer de dikte van het monster silicone > 10% van de indentor-straal is en < ~ 13 x de straal van de indentor. We vonden dat een siliconen dikte van 5-10 x de straal van de indentor een goede ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken Margaret Gardel voor royaal waardoor het gebruik van de rheometer. Wij erkennen de steun van de NIH (1R15GM116082), die dit werk ingeschakeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Bewaar bij kamertemperatuur |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Bewaar bij -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Bewaar bij 4°C |
| Carboxyl fluorescent roze deeltjes, 0,4-0,6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Bewaar bij 4°C, niet invriezen |
| 1,0 mm Zuur gewassen Zirconium kralen | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV kamer met ozon evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Breedveld fluorescentie microscoop | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collageen I, uit rattenstaart | Corning | 354236 | Voorraadconcentratie = 4 mg/ml; bewaar bij 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | opensource software |
Referenties
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
