Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Samenvatting

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Samenvatting

Screening voor eiwit-eiwitinteractie met behulp van de gist 2-hybrid test is al lang een effectief instrument, maar het gebruik ervan grotendeels beperkt gebleven tot de ontdekking van hoge-affiniteit interactors die in de bibliotheek van interagerende kandidaten zijn hoogverrijkt. In een traditionele indeling, kan de gist 2-hybrid assay opleveren teveel kolonies om te analyseren wanneer uitgevoerd bij lage striktheid waar lage affiniteit interactors kunnen worden gevonden. Bovendien, zonder een uitgebreide en volledige ondervraging van dezelfde bibliotheek tegen verschillende aas plasmiden, een vergelijkende analyse niet worden bereikt. Hoewel sommige van deze problemen kunnen worden opgelost met behulp van gekleed prooi Bibliotheken, kunnen de kosten en de infrastructuur die nodig is om dergelijke schermen onbetaalbaar. Als alternatief hebben we aangepast de gist 2-hybrid bepaling om tegelijkertijd tientallen van voorbijgaande aard bloot te leggen en statische eiwitinteractie binnen één scherm met behulp van een strategie genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de proteïne), die omvat high-throughput DNA sequencing en berekening de ontwikkeling van een populatie van plasmiden, die coderen van interagerende partners te volgen. Hier beschrijven we aangepaste reagentia en protocollen waarmee een DEEPN scherm op eenvoudige en lonende wijze worden uitgevoerd.

Inleiding

Een volledig inzicht in biologische processen van de cel is afhankelijk van het vinden van de Eiwit-interactienetwerken die ten grondslag liggen aan hun moleculaire mechanismen. Een benadering te identificeren eiwitinteractie is de gist 2-hybrid assay (Y2H), die werkt door het monteren van een goed functionerende chimeer transcriptiefactor zodra twee domeinen van de proteïne van belang aan elkaar^{1 binden}. Een typische Y2H scherm wordt uitgevoerd door het creëren van een bevolking van gist dat huizen van beide een bibliotheek van plasmiden, interacterende eiwitten, gesmolten tot een transcriptionele activator codering (bv., 'prooi' fusi....

Protocol

1. voorbereiding van de Media en platen

Opmerking: Alle platen moeten minimaal 2 dagen voor het begin van het protocol worden gemaakt. De media kan worden gemaakt op elk gewenst moment. De gebufferde gist extract pepton dextrose adenine (bYPDA) moet echter geschieden op de dag die zal worden gebruikt. Sommige media wordt gemaakt met behulp van een supplement mix, met een level van adenine dat groter is dan wat wordt meestal gebruikt. Meeste minimale media supplementen geven 10 mg/L adenine. Supplementen met het label '+ 40Ade' opgeven van een totaal van 40 mg/L adenine.

1. Voorbereiden van de Glucose-oplossing (50% g/v). Voor....

Resultaten

De Y2H bepaling is wijd verbeid gebruikt voor het vinden van eiwit: eiwitinteractie en diverse aanpassingen en systemen zijn ontwikkeld. Voor het grootste deel, zijn dezelfde overwegingen die helpen zorgen voor succes met deze vorige benaderingen belangrijk voor DEEPN. Enkele van de belangrijke ijkpunten zijn: zorgen voor expressie van DNA-bindende domein fusie-eiwitten, zorgen voor een lage achtergrond van vals zijn + groei in de ze met het aas van belang met een lege prooi plasmide, een.......

Discussie

Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van de Y2H tests in batch met behulp van geoptimaliseerde methoden. Er zijn een paar kritische stappen in de procedure om ervoor te zorgen dat de bevolking van gist die zou worden geplaatst onder selectie representatief voor de startende bibliotheek is en dat genoeg van de startende gist bevolking wordt gebruikt voor het ondergaan van de selectie te beperken variabiliteit . Nog belangrijker is, is deze benchmarks zijn relatief gemakkelijk te bereiken naast de aanpassing van de m.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
P