Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Samenvatting

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Samenvatting

Obesitas gaat vergezeld van een uitgebreide verbouwing van vetweefsel voornamelijk via adipocyte hypertrofie. Extreme adipocyte groei resulteert in een slechte reactie op insuline, lokale hypoxie en ontsteking. Door het stimuleren van de differentiatie van functionele witte adipocytes van voorlopercellen, radicale hypertrofie van de adipocyte bevolking kan worden voorkomen en, bijgevolg, de metabole gezondheid van vetweefsel verbeterd kan worden samen met een vermindering van ontsteking. Ook, door het stimuleren van een differentiatie van beige/bruin adipocytes, de totale lichaam energie-uitgaven kan worden verhoogd, wat resulteert in gewichtsverlies. Deze aanpak kan voorkomen dat de ontwikkeling van obesitas co morbiditeit zoals type 2 diabetes en hart-en vaatziekten.

Deze paper beschrijft de isolatie, uitbreiding en differentiatie van wit en beige adipocytes uit een subset van menselijk vetweefsel endotheliale cellen die mede het uitdrukken van de markeringen van CD31 en CD34. De methode is relatief goedkoop en kan niet arbeidsintensief. Het vereist toegang tot menselijke adipeus weefsel en de subcutane depot is geschikt voor monsternemingen. Voor dit protocol, verse adipeus weefsel monsters van morbide obesitas onderwerpen [index van de lichaamsmassa (BMI) > 35] worden verzameld tijdens procedures voor Bariatrische chirurgie. Met behulp van een sequentiële immunoseparation uit de stromale vasculaire afvalfractie, worden voldoende cellen geproduceerd van zo weinig zoals 2 – 3 g vet. Deze cellen kunnen worden uitgebreid in cultuur gedurende 10-14 dagen, kunnen worden cryopreserved, en behouden hun eigenschappen van de adipogenic met passaging tot de passage 5 – 6. De cellen worden gedurende 14 dagen met een cocktail met behulp van een combinatie van menselijke insuline en de PPARγ agonist-rosiglitazone adipogenic behandeld.

Deze methode kan worden gebruikt voor het verkrijgen van bewijs van concept experimenten op moleculaire mechanismen die adipogenic reacties in obesitas endotheliale cellen rijden, of voor het screenen van de nieuwe drugs die de adipogenic verbeteren kunnen reactie geleid ofwel naar wit of beige/bruin adipocyte differentiatie. Met behulp van kleine onderhuidse biopsieën, kan deze methode worden gebruikt om het scherm uit non-responder onderwerpen voor klinische tests gericht op het stimuleren van beige/bruin en wit adipocytes voor de behandeling van obesitas en co-morbiditeit.

Inleiding

Recente gegevens blijkt dat zowel bij muizen en bij de mens, een subset van cellen die woonachtig zijn in het vetweefsel therapieën kan worden gedifferentieerd in ofwel wit of beige/bruin adipocytes^1,2,3. Het fenotype van dergelijke cellen is een onderwerp van controverse, met bewijs ter ondersteuning van endotheliale cellen, vlotte spier/pericyte of een spectrum van intermediaire fenotypen^4,,^5,,^6,7. De werkingssfeer van de ontwikkeling van deze methode was voor het testen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van verschillende vet depots van zwaarlijvige mensen geïsoleerd. Andere studies in de literatuur zijn gericht op het potentieel van de totale stromale vasculaire fractie of van de bekende adipocyte progenitoren^2,8,9adipogenic. Aangezien momenteel bestaande technologieën specifiek adipeus weefsel endotheliale cellen voor drug delivery^{10 richten kunnen}, het begrip van het potentieel van dergelijke cellen ondergaan adipogenic-inductie naar wit of beige adipocytes is belangrijk voor toekomst gerichte therapieën.

Verschillende groepen gemeld de combinatie van CD31 en CD34-markeringen als surrogaten endotheliale cellen van menselijke adipeus weefsel^11,12,13te isoleren. Doorgaans is de isolatie wordt uitgevoerd met behulp van twee opeenvolgende stappen en een positieve selectie met behulp van magnetische kralen. In dit verslag werd immunoseparation gebruikt CD34 + magnetische kralen gecombineerd met CD31 Kunststof kralen gebruikt. We vonden deze techniek superieur aan de sequentiële magnetische immunoseparation met betrekking tot het behoud van de typische geplaveide endothelial morfologie. Ook konden we genereren genoeg cellen die nodig zijn voor de uitbreiding en adipogenic inductie vanaf zo weinig als 1-2 g vet. De biopsie van een kleine steekproef van onderhuids vet is genoeg om de vereiste hoeveelheid cellen voor downstream toepassingen te produceren. Dit aspect is potentieel belangrijk, vooral als deze methode zal worden gebruikt voor de screening voor een alertheid op adipogenic inductie in menselijke proefpersonen.

In tegenstelling tot andere systemen gemeld in de literatuur, deze methode maakt gebruik van slechts twee ingrediënten voor de inductie van de adipogenic van de CD34 + CD31 + cellen: een agonist PPARγ — Rosiglitazon — en menselijke insuline. Nog belangrijker is, valt de hoeveelheid insuline gebruikt binnen het bereik van de normale/hoge van de circulerende post-absorptive insuline in mensen¹⁴. De mate van alertheid op insuline van de cellen in vitro, gemeten door Akt fosforylatie, doet niet correleren met hun vermogen om te reageren op de inductie cocktail. Interessant, deze inductie cocktail en experimentele voorwaarden gebruiken, een mix van witte en beige/bruin cellen werden verkregen zoals bepaald door de grootte en het aantal intracellulaire lipide druppels en de uitdrukking van moleculaire merkers. Dit eenvoudige en kosteneffectieve inductie protocol samen met de kwantitatieve beoordeling van het fenotype van de responder cellen (witte vs. beige) zorgt voor een screening van agenten die het saldo van gedifferentieerde beige potentieel kan veranderen : wit adipocytes.

Deze methode biedt ook een translationeel aanpak voor het begrip van de onderliggende mechanismen van adipogenesis van vasculaire endotheliale voorlopercellen in menselijke adipeus weefsel. Met behulp van deze specifieke isolatie/differentiatie techniek, kunnen onderzoekers verschillende trajecten verantwoordelijk voor adipogenesis in een subset van vasculaire endotheliale cellen van verschillende vet depots in mager en zwaarlijvige mensen ondervragen.

Protocol

De institutionele Commissie bestuur ter beoordeling aan Oost-Virginia Medical School goedgekeurd het onderzoek en het verzamelen van monsters van menselijke adipeus weefsel gebruikt in de studie. Geïnformeerde schriftelijke toestemming was verkregen van de patiënten.

1. bereiding van Buffers, Media en instrumenten

1. Bereiden van een oplossing van Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM natriumchloride, kaliumchloride van 5 mM, 1 mM magnesium-sulfaat, 0,4 mM kalium fosfaat dibasische, 5.5 mM glucose, 1 mM adenosine, 0,01% antibioticum/antimycotic mix (50 µg/mL penicilline, 50 µg/mL streptomycine, 30 µg/mL gentamicine, 15 ng/mL Amfotericine) en 10 mM HEPES (pH = 7.4). Deze oplossing is telkens voor het weefsel verzamelen en spijsvertering vers bereid.
2. Bereid een verse collagenase-oplossing: 1 mg/mL collagenase, type 1, in KRBSS; 3 mL/g vet maken Vooraf warm de collagenase oplossing bij 37 ° C in een waterbad voorafgaand aan de vertering van het weefsel.
3. Voorbereiden van een CD34 isolatie van de cel Buffer: 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM EDTA in steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
4. Het bereiden van Adipogenesis Media: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL penicilline/streptomycine, 1,25 µL/mL van menselijke insuline (5 µg/mL of 144 mU/mL) en 0,36 µL/mL van 2,8 mM Rosiglitazon (1 µM).
5. Bereid een stamoplossing 0,3% olie Red O (ORO) (gewicht/volume) door ontbinding van 0,3 g Oro in 100 mL isopropanol.

2. obesitas stromale vasculaire breuk isolatie

Opmerking: De studie omvatte een transversale cohort van morbide obesitas type 2-diabetes (T2D) en niet-diabetische onderwerpen, leeftijd 18-65 jaar, een bariatrische operatie ondergaan op de Sentara Metabolic en Weight Loss Surgery Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Uitsluitingscriteria opgenomen een auto-immune ziekte, met inbegrip van type 1 diabetes mellitus, aandoeningen waarvoor chronische immunosuppressieve therapie, anti-inflammatoire geneesmiddelen, thiazolinendiones, actieve tabaksgebruik, chronische of acute infecties of een geschiedenis van maligniteit behandeld binnen de afgelopen 12 maanden. T2D werd gedefinieerd als een plasma glucosegehalte van 126 mg/dL of hoger, een glucose van 200 mg/dL of groter nadat een 2 h glucosetolerantie test, of het gebruik van antidiabetica medicijnen.

1. Menselijke omental (OM) en onderhuidse (SC) adipeus weefsel (AT) ophalen door proefpersonen een bariatrische operatie ondergaan.
2. Houd de OM en SC AT in aparte flesjes met Henks gebufferde zoutoplossing met 50 µg/mL penicilline/streptomycine bij kamertemperatuur onmiddellijk na extractie van het weefsel.
3. Zorgvuldig reinigen en verwijderen van fibrotische en dichtgeschroeid secties van het weefsel met 70% ethanol afgestreken schaar en pincet, wanneer het monster in het lab na de extractie weefsel arriveert.
4. Weeg het vetweefsel en partitioneren van it in 5 g (of minder) aliquots voor de vertering van collagenase.
5. Fijn blad voor 5 g van het AT in 5 mL van de oplossing van een collagenase in een flesje Scintillatie bij kamertemperatuur, met behulp van twee paar van schaar.
6. Voeg een extra 10 mL van collagenase oplossing aan het gehakt weefsel voor 15 mL totaal.
7. Verteren de monsters gedurende 1 uur, bij 37 ° C, in een waterbad met continue schudden.
8. Snijd het puntje uit een 20 mL spuit om een botte uiteinde.
9. Knip een 9 x 9 cm vierkant van een 250 µm mesh en duw het halverwege in een conische tube van 50 mL, met het botte uiteinde spuit.
10. Giet de monsters in de spuit van 20 mL botte uiteinde en filter via de 250 µm nylon gaas in de conische buis van 50 mL te scheiden van adipocytes en stromale vasculaire cellen van onverteerd weefsel.
    Opmerking: Gebruik niet meer dan 5 g AT per conische tube van 50 mL, zoals de Maas raken als gevolg van overtollig fibrotische onverteerd materiaal verstopt zal.
11. De Scintillatie flacon met 10 mL van KRBBS wassen en giet het door het filter voor het verzamelen van de resterende cellen.
12. Incubeer de gefilterde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk met het oog op de adipocytes te zweven op de top van de buis en een aantal vasculaire stromale cellen te vestigen op de onderkant van de buis.
13. Gebruik maken van een 20 mL spuit en een 20 G x 6 in pipetting naald te verwijderen van de laag stromale vasculaire breuk en overbrengen naar een schone 50 mL conische buis.
14. Voeg 10 mL van de KRBBS en laat van de monsters te zitten op de Bank voor 5 min, bij kamertemperatuur.
15. Herhaal stap 2.12-2.14 tweemaal.
    Opmerking: Deze stappen zullen ervoor zorgen dat er geen besmetting van de stromale vasculaire cellen met de zwevende adipocytes.
16. Houd de stromale vasculaire breuken van beide depots op ijs voor verdere verwerking, zoals beschreven in de onderstaande stappen.
    Opmerking: Laat de cellen niet op het ijs voor meer dan 1 h, zoals dit een effect op de levensvatbaarheid van de cellen hebben kan. De adipocytes kunnen flash-bevroren in vloeibare stikstof voor langdurige opslag of vers gebruikt voor experimenten.

3. isolatie van vetweefsel endotheliale cellen

1. Draai de stromale vasculaire breuken (SVF) bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
2. Verwijder de monsters uit de centrifuge en zorgvuldig giet af het supernatant; Houd de pellet met de FØROYA-cellen.
3. Resuspendeer de cel-pellets voorzichtig in 5 mL PBS.
   Opmerking: Als er meer dan 5 g van een AT-depot werd verwerkt tot meerdere aliquots (zie stap 2.4), zwembad de cel pellets samen.
4. Draaien van de monsters bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS cellen tellen.
   Opmerking: Hier, een automatische cel teller werd gebruikt voor het tellen van de cel. De levensvatbaarheid van de cellen werd verkregen door menging van 12 µL celsuspensie met 12 µL van een oplossing van acridine oranje/propidium jodide (AO/HD-PI) (Zie Tabel van materialen). Het gemiddeld aantal cellen per gram AT voor elke depot is: (a) OM Depot: 1.69 x 10⁵ ± 4,51 x 10-⁴; (b) SC-Depot: 1,24 x 10⁵ ± 6.45 x 10-⁴. De levensvatbaarheid van de cellen van beide depots was > 90%.
6. Pellet van de monsters bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
   Opmerking: Een CD34 protocol voor de selectie van de immunomagnetic (Zie Tabel van materialen) werd aangepast voor stappen 3.7-3.15.
7. Resuspendeer de pellet in 100 µL CD34 isolatie buffer.
   Opmerking: De cel totaal graven vereisen de volgende resuspensie volumes: (a) < 2 x 10⁷ cellen: resuspendeer de pellet in 100 µL; (b) 2 x 10⁸–5 x 10⁸ cellen: resuspendeer de pellet in 1 mL. In stappen 3.9 – 3.16, het volume van de gebruikte reagentia werden verlaagd voor < 2 x 10⁷ cellen.
8. Voeg 10 µL van CD34 cocktail en Incubeer het monster gedurende 15 minuten, bij kamertemperatuur.
9. Voeg 5 µL van magnetische kralen en Incubeer het monster gedurende 10 minuten, bij kamertemperatuur.
10. 2,5 mL CD34 isolatie buffer toevoegen aan elk monster en plaats de monsters in de magneet, voor 5 min, bij kamertemperatuur.
11. Omkeren van de magneet voor 5 s tot giet af de isolatie-buffer.
12. Verwijder de monsters uit de magneet en herhaal stap 3,10 en 3.11 4 x.
13. Verwijderen van de buis van de magneet en voeg 2 mL CD34 isolatie buffer.
14. Pellet de cellen bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
15. Resuspendeer de cel pellets in 1 mL CD34 isolatie buffer en de cellen tellen.
    Nota: Hier, het gemiddeld aantal cellen per gram AT is: (a) OM Depot: 4,75 x 10⁴ ± 3.36 x 10-⁴; (b) SC-Depot: 1,06 x 10⁴ ± 9,53 x 10-³. Een CD31 plastic immunobead protocol werd aangepast voor stappen 3.16 – 3,34 (Zie Tabel van materialen).
16. Pellet cellen bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 250 µL van Buffer B en 250 µL van was buffer.
17. Grondig resuspendeer de kralen CD31 door vortexing de buis.
18. Voeg 20 µL van CD31 kralen.
    Opmerking: Als gevolg van de cel totaal telt > 1 x 10⁶, het volume was verlaagd volgens de fabrikant input.
19. Incubeer het monster met rockende gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur.
20. Een zeef hechten aan een steriele 50 mL conische buis.
    Opmerking: De grotere opening van de zeef moeten op de top.
21. Voorafgaand aan de scheiding van de cel, voeg 1 mL was buffer naar de zeef equilibreer. Breng het mengsel die zijn verkregen onder stap 3.16 naar de zeef.
22. Het wassen van de zeef met 5 mL was buffer in een cirkelvormige beweging voor een totaal volume van 20 mL. De verbindingslijn koppelt aan een steriele 50 mL conische buis en sluit de luer-lock.
23. Bevestigt de zeef op de connector. Voeg 1 mL was buffer langs de muur van de zeef. Voeg vervolgens 1 mL van geactiveerde buffer D langs de muur van de zeef. Swirl van het monster zachtjes en laat het 10 min, bij kamertemperatuur inwerken.
24. Voeg 1 mL was buffer. De cellen van de kralen door pipetteren op en neer 10 x scheiden.
    Opmerking: Vermijd het genereren van luchtbellen.
25. Open de luer-lock en laat de vrijstaande cellen te stromen in de conische buis van 50 mL. Wassen van de zeef 10 x met 1 mL was buffer telkens.
26. Negeren van de connector en zeef en centrifugeren van de monsters bij 300 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver volledige BAVA-2 Media voor cultuur.
    Opmerking: Het gemiddeld aantal cellen per gram AT op dit punt is: (a) OM Depot: 5.92 x 10³ ± 4.27 x 10-³; (b) SC-Depot: 4.12 x 10³ ± 2.1 x 10-³. De levensvatbaarheid van cellen van beide depots was meer dan 90%.

4. de inductie van Adipogenesis in geïsoleerde endotheliale cellen

1. Het groeien van de cellen in 6-Wells-platen Weefselkweek behandeld met volledige BAVA-2 media in een 37 ° C, 5% CO₂ incubator. Vervang de media elke 3-4 dagen totdat de cellen samenvloeiing van 80-90%.
   Opmerking: De verdubbeling van de bevolking is tussen 2-3 dagen.
2. Vouw de cellen door hen op 100 mm petrischalen plating en Splits de cellen 1:3 keer. In dit stadium zijn de cellen op passage 2.
3. Graaf de cellen met behulp van een automatische cel counter (Zie Tabel van materialen).
4. Zaad ongeveer 100 – 200.000 cellen 6-Wells-platen zorgen voor dubbele putten voor elke depot en de cultuur die hen voltooien in BAVA-2 media voor 2 dagen.
5. Gecombineerd uit alle media groei en 2 mL DMEM/F12 met 5% te vervangen FBS en 50 µg/mL penicilline/streptomycine voor het besturingselement cellen en 2 mL Adipogenesis media (zie stap 1.4) voor de behandeling cellen te vervangen.
6. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO₂ incubator voor 13 dagen, ter vervanging van de respectieve media elke 3 tot 4 dagen.
   Opmerking: Cellen zal beginnen te accumuleren lipiden na 4 dagen behandeling.
7. ORO en Nile rode kleuring volgens gepubliceerde methoden^15-17verrichten.
8. U kunt cellen voor een RNA extractie isoleren, verwijder het medium van de 6-well inductie platen en wassen met 1 mL steriele PBS.
9. Voeg 350 µL van een guanidium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing (Zie Tabel van materialen) elk goed en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
10. De cellen uit de plaat met behulp van een cel schraper Schraap en de cellen overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
    Opmerking: De monsters kunnen worden opgeslagen in de vriezer-80 ° C voor RNA extractie en verdere verwerking op een later tijdstip.
11. Uittreksel van mRNA uit de monsters met behulp van een aangepast RNA extractie protocol (Zie Tabel van materialen).
12. Uitvoeren van een real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) te beoordelen van de genexpressie met behulp van de volgende sondes: adiponectin, UCP-1 en CIDEA (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Hier, RT-PCR procedures werden uitgevoerd met behulp van de volgende standaard protocol: denaturatie (95 ° C; 15 s), gloeien en uitbreiding (60 ° C; 1 min) voor 40 cycli. De monsters die genen met C_T -waarden uitgedrukt > 35 werden beschouwd als niet detecteerbaar.

Resultaten

Ons protocol is bedoeld om een in vitro -aanpak om te bepalen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + vasculaire cellen uit verschillende magazijnen van menselijke adipeus weefsel. Een vereenvoudigd stroomdiagram wordt weergegeven in figuur 1A. De eerste stap met behulp van een positief aantal CD34 cellen uiten resulteert in > 95% CD34 + cellen in de bevolking van de vers geïsoleerde cellen (figuur 1A). Nog belan...

Discussie

De focus van dit document is bedoeld als een methode voor de isolatie, de uitbreiding en de adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van viscerale en onderhuidse magazijnen van menselijke adipeus weefsel.

Methoden zijn gemeld voor de isolatie van endotheliale cellen van de verschillende vasculaire bedden van knaagdieren of mensen waarbij voornamelijk technieken met behulp van CD31 antilichamen fluorescently label of gekoppeld aan magnetische kralen¹⁸

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Grote apparatuur
Bioveiligheidskabinet	Nuaire	nu-425-400
Celcultuur incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Waterbad	Forma Scientific	2568	Reciproke schudder
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Elektroforesebox	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Elektroforese voeding	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Gekoelde centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge voor op tafel	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescente microscoop	Olympus	BX50
Omgekeerde microscoop	Nikon	TMS
KRBSS-buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	792519
Calciumchloridedihydraat	Sigma-Aldrich	C7902
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M2643
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	746398
Natriumfosfaat monobasisch monohydraat	Sigma-Aldrich	S9638
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Rundserumalbumine	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Weefsel vertering
20 mL spuit	Global Medical	67-2020
Nylon gaas, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetterspuitjes	Popper	7934
Fijne schaar	Fine Science Tools	14058-11
Weefseltang	George Tiemann & Co	160-20
Collageenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petrischalen, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC behandeld
Eppendorfbuisjes, 1,5 mL	USA Scientific	1615-5500
Kegelbuisjes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Kegelbuisjes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillatiebuisjes	Kimble