Methodenartikel

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

DOI:

10.3791/57806

⸱

7 juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levende organismen moeten regelmatig omgaan met wisselende omgevingen tijdens hun levenscyclus, met inbegrip van veranderingen in de temperatuur, pH, de accumulatie van reactieve zuurstof soorten en meer. Deze schommelingen kunnen leiden tot een wijdverbreid eiwit ontplooiing, aggregatie, en cel dood. Cellen zijn dus een dynamische en stress-specifieke netwerk van moleculaire chaperones, die een "gezond" Proteoom tijdens stress voorwaarden handhaven geëvolueerd. ATP-onafhankelijke chaperones vormen een belangrijke klasse van moleculaire chaperones, die als moleculen van de eerstelijns defensie, bescherming tegen aggregatie van eiwitten in een stress-afhankelijke manier dienen. Een functie die deze chaperones gemeen hebben is hun vermogen om structurele plasticiteit voor hun stress-specifieke activatie, de erkenning, en de versie van de misfolded-client gebruiken.

In dit artikel focussen we op de functionele en structurele analyse van een dergelijke intrinsiek ongeordende chaperon, de bacteriële redox-gereglementeerde Hsp33, die tegen aggregatie tijdens oxidatieve stress eiwitten beschermt. Hier presenteren wij een toolbox van diverse technieken voor de studie van de Chaperon redox-gereglementeerde activiteit, evenals voor het toewijzen van conformationele wijzigingen van de Chaperon, ten grondslag liggen aan de activiteit. Specifiek, beschrijven we een werkstroom waarin de voorbereiding van volledig verminderde en volledig Geoxideerde proteïnen, gevolgd door een analyse van de Chaperon anti-aggregatie-activiteit in vitro met behulp van licht-verstrooiing, gericht op de mate van de anti-aggregatie activiteit en haar kinetiek. Om te overwinnen frequente uitschieters verzameld gedurende aggregatie testen, beschrijven we het gebruik van Kfits, een nieuwe grafische tool waarmee gemakkelijk verwerking van kinetische metingen. Dit hulpmiddel kan gemakkelijk worden toegepast op andere soorten kinetische metingen voor het verwijderen van uitschieters en passend kinetische parameters. Om de functie correleren met de eiwitstructuur, beschrijven we de installatie en de workflow van een structurele massaspectrometrie techniek, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie, waarmee de toewijzing van conformationele wijzigingen op de Chaperon en substraat tijdens verschillende stadia van de activiteit van de Hsp33. Dezelfde methode kan worden toegepast op andere eiwit-eiwit en eiwit-ligand interacties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen tegenkomen vaak een opeenstapeling van reactieve zuurstof soorten (ROS) geproduceerd als bijproduct van de ademhaling1,2, eiwit en lipide oxidatie3,4en extra processen5, 6,7. Ondanks ROS gunstig rol in verschillende biologische processen zoals mobiele signalering van8,9 en immuunrespons10, kan een gebrek aan evenwicht tussen ROS productie en de ontgifting optreden, toonaangevende aan oxidatieve 7benadrukken. De biologische doelstellingen van ROS zijn eiwitten en lipiden, nucleïnezuren, de oxidatie van die invloed hebben op hun structuur en functie. Daarom is de accumulatie van cellulaire oxidanten sterk gekoppeld aan een breed scala aan ziektebeelden zoals kanker9,11, ontsteking12,13en veroudering14, 15, en hebben gevonden te worden betrokken bij het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Alzheimer, Parkinson van, en de ALS ziekte16,17,18.

Zowel nieuw samengestelde en volwassen eiwitten zijn zeer gevoelig voor oxidatie als gevolg van de potentieel schadelijke wijzigingen van hun zijketens, die vorm van eiwit structuur en functie19,20. Daarom leidt oxidatieve stress meestal tot een wijdverbreide eiwit geïnactiveerd, de misfolding en de aggregatie, uiteindelijk zal leiden tot celdood. Een van de elegante cellulaire strategieën om te gaan met de potentiële schade van eiwit oxidatie is te gebruiken van redox-afhankelijke chaperones, die de wijdverbreide eiwit aggregatie remmen, in plaats van het vormt stabiele complexen met misfolded client eiwitten21 ,22,23. Deze eerstelijns defensie chaperones worden snel geactiveerd door een sitespecifieke oxidatie (meestal op cysteïne residuen) dat in krachtige anti-aggregatie moleculen24 omgezet. Aangezien oxidatieve stress in de remming van de ademhaling en dalingen in de cellulaire ATP niveaus25 leidt, zijn canonieke ATP-afhankelijke chaperones minder effectief tijdens oxidatieve stress voorwaarden25,26 ,27. Daarom, redox-geactiveerde ATP-onafhankelijke chaperones spelen een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van het eiwit op de accumulatie van oxidanten in bacteriën en eukaryoten (b.v., Hsp3328 en RidA29 bij bacteriën, Get330 in gist, peroxiredoxins31 in eukaryoten). De activiteit van deze chaperones is sterk afhankelijk van omkeerbare structurele conformationele veranderingen geïnduceerd door een sitespecifieke oxidatie die hydrofobe regio's die betrokken zijn bij de erkenning van misfolded client eiwitten onthult.

Onderzoek van de anti-aggregatie-mechanisme en de beginselen inzake de erkenning van de client-eiwitten door chaperones is niet eenvoudig als gevolg van het dynamische en heterogenic karakter van de Chaperon-substraat interacties32,33, 34,35,,36,,37. Stress-gereglementeerde chaperones hebben echter een kans om ons begrip van de anti-aggregatie functie vanwege hun vermogen om: 1) verkrijgen van twee verschillende vormen van de Chaperon, actief (bijvoorbeeldgeoxideerd) en inactief (b.v. verminderd), met de invoering of de verwijdering van een aandoening van de stress gemakkelijk schakelen tussen hen (bv, oxidator en reducerende agent), 2) hebben een breed scala van substraten, 3) zeer stabiele complexen vormen met de client-eiwitten die kunnen worden geëvalueerd door verschillende structurele methodologieën, en 4) uitsluitend richten op het substraat erkenning en introductie, gemedieerd door redox-afhankelijke conformationele veranderingen, zoals de meerderheid van deze chaperones het vouwen vermogen ontbreekt.

Here, analyseren we de bacteriële redox-gereglementeerde chaperone Hsp33 van anti-aggregatie activiteit, een essentieel onderdeel van het bacteriële verdedigingssysteem tegen oxidatie-geïnduceerde proteïne aggregatie28. Wanneer verlaagd, is Hsp33 een strak gevouwen zink-bindend-proteïne met geen chaperone activiteit; echter wanneer blootgesteld aan oxidatieve stress, ondergaat Hsp33 uitgebreide conformationele veranderingen die haar substraat bindende regio's38,39blootstellen. Op oxidatie is het zink ion dat sterk aan vier zeer geconserveerde cysteïne residuen van het C-terminal domein gebonden is vrijgegeven40. Dit resulteert in de vorming van twee disulfide bindingen, een ontplooiing van de C-terminal domein, en een destabilisering van de aangrenzende linker regio41. De C-terminal en linker regio's zijn zeer flexibel en worden gedefinieerd als intrinsiek of gedeeltelijk ontregelde. Bij terugkeer naar niet-stress voorwaarden, de cysteines worden verminderd en de Chaperon keert terug naar zijn geboortestaat gevouwen met geen anti-aggregatie-activiteit. Het uiteinde van de Chaperon leidt tot een verdere ontplooiing en destabilization van de afhankelijke client proteïne, die de overdracht aan de canonieke chaperone systeem, DnaK/J, voor uiteinde38triggers. Analyse van de Hsp33 interactie sites suggereert dat Hsp33 gebruikt beide die zijn geladen ontregelde regio's, alsmede de hydrofobe regio's over het linker en het N-terminaal domein te vangen misfolded client eiwitten en voorkomen hun aggregatie38, dat 42. in gevouwen toestand, deze regio's zijn verborgen door de gevouwen linker en C-terminal domein. Interessant is dat fungeert de linker regio als poortwachter van Hsp33 van gevouwen en inactieve staat, "sensing" de opvouwbare status van de aangrenzende C-terminal domein34. Zodra gedestabiliseerd door mutagenese (hetzij door een mutatie van de punt of een volledige reeks perturbation), wordt Hsp33 geconverteerd naar een constitutively actieve chaperone ongeacht de redox staat van haar redox-sensitive cysteines43.

De hier gepresenteerde protocollen toestaan monitoring van Hsp33 de redox-afhankelijke chaperone activiteit, evenals de conformationele wijzigingen van de toewijzing na de activatie en binden van eiwitten van de client. Deze methode kan worden aangepast aan het onderzoek andere chaperon-client erkenning modellen evenals niet-chaperone eiwit-eiwitinteractie. Bovendien presenteren wij protocollen voor de bereiding van volledig gereduceerde en de geoxideerde chaperones die kunnen worden gebruikt in studies van andere redox-switch eiwitten, te onthullen van de potentiële rol van eiwit oxidatie op de activiteit van het eiwit.

Specifiek, beschrijven we een procedure om te controleren chaperone activiteit in vitro en definiëren van zijn substraat specificiteit uit hoofde van verschillende soorten eiwit aggregatie (chemisch of thermisch geïnduceerde) met behulp van de verstrooiing van licht (LS) gemeten door een fluorospectrometer44. Tijdens de samenvoeging, licht verstrooiing op 360 nm stijgt snel als gevolg van de toenemende turbiditeit. Zo kan aggregatie worden gecontroleerd op een tijd-afhankelijke manier bij deze golflengte. LS is een snelle en gevoelige methode voor het testen van de aggregatie van eiwitten en dus de activiteit van de anti-aggregatie van een proteïne van belang met behulp van nanomolar concentraties, waardoor de karakterisering van proteïne aggregatie-gerelateerde kinetische parameters onder verschillende voorwaarden. Bovendien, het LS-protocol beschreven hier vereist geen dure instrumentatie, en kan gemakkelijk worden vastgesteld in een laboratorium.

Het is echter vrij uitdagend om te verkrijgen 'schone' kinetische curven en voor het afleiden van een eiwit kinetische parameters van dergelijke licht verstrooiing experimenten, als gevolg van lawaai en het grote aantal uitschieters gegenereerd door luchtbellen en grote aggregaten. Om te overwinnen deze hindernis, presenteren we een nieuwe grafische tool, Kfits45, ter vermindering van de geluidsniveaus in de verschillende kinetische metingen, speciaal uitgerust voor eiwit aggregatie kinetische gegevens gebruikt. Deze software levert voorontwerp kinetische parameters voor een vroege evaluatie van de resultaten en staat de gebruiker toe om "schoon" grote hoeveelheden data snel zonder de kinetische eigenschappen. Kfits is geïmplementeerd in Python en beschikbaar in open source op 45.

Een van de uitdagende vragen op het gebied betreft aan sites van de interactie tussen chaperones en de proteïnen van hun cliënt in kaart te brengen en het inzicht hoe chaperones herkennen een breed scala van misfolded substraten. Deze vraag wordt nog ingewikkelder wanneer studeren hoogdynamische eiwitcomplexen waarbij intrinsiek chaperones en aggregatie-naar voren gebogen substraten ontregelde. Gelukkig, structurele massaspectrometrie dramatisch het laatste decennium heeft geavanceerde en heeft met succes nuttig benaderingen en hulpmiddelen voor het analyseren van de structurele plasticiteit en kaart van residuen die betrokken zijn bij eiwit erkenning46, 47 , 48 , 49. hier, presenteren we een dergelijke techniek-waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS)-waarmee de toewijzing van residuen wijzigingen in een structurele bevestiging bij wijziging van de proteïne of eiwit/Ligand bindende35, 50,51,52,53,,54,55. HDX-MS maakt gebruik van de voortdurende uitwisseling van ruggengraat waterstof door deuterium, het tarief van die wordt beïnvloed door de chemische milieu, toegankelijkheid, en covalente en niet-covalente bindingen56. HDX-MS deze exchange-processen met behulp van een Halfzwaar oplosmiddel, vaak zwaar water (D2van O) worden bijgehouden en kan waarderingsmethode op basis van de verandering in de moleculaire gewicht na het waterstof met deuterium exchange. Lagere tarieven van waterstof-deuterium exchange kunnen leiden tot van waterstof waterstofbruggen deelnemen of, gewoon, vanaf sterische hinder, waarin lokale wijzigingen in de structuur57. Wijzigingen op een ligand binding of posttranslationele modificaties kunnen het ook leiden tot verschillen in de omgeving van waterstof, met een bindende voortvloeiende verschillen in de waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) tarieven46,53.

We deze technologie toegepast op 1) Hsp33 kaartregio die snel ontvouwen op oxidatie, wat leidt tot het activeren van Hsp33, en 2) het definiëren van de potentiële bindende interface van Hsp33 met zijn album misfolded substraat, citraat synthase (CS)38.

De methoden die worden beschreven in dit manuscript kunnen worden toegepast om te studeren redox-afhankelijke functies van eiwitten in vitro, definiëren van anti-aggregatie activiteit en de rol van structurele veranderingen (indien van toepassing) in eiwitfunctie. Deze methodologieën kunnen gemakkelijk worden aangepast aan uiteenlopende biologische systemen en toegepast in het laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van volledig verminderde en volledig Geoxideerde proteïnen

  1. Voorbereiding van een volledig verlaagd eiwit
    Opmerking: Hier, beschrijven we de vermindering van een zinkhoudende eiwitten, en gebruik een ZnCl2 oplossing om te herstellen van de Braziliaanse Zn-opgenomen, minder eiwitten. De ZnCl2 oplossing kan worden vervangen of verwijderd. Merk op dat de tijd en de temperatuur van het proces van vermindering hangt af van de eiwitstabiliteit en functie, en is dus specifiek per eiwit.
    1. Ontdooi de eiwitSteekproef op ijs en draai het naar verwijderen aggregaten. Incubeer het monster gedurende ten minste 1,5 uur bij 37 ° C met 5 mM DTT en 20 µM ZnCl2 (tot 70% van de eiwitconcentratie).
      Opmerking: De temperatuur in deze stap is afhankelijk van de eiwit en moet worden aangepast aan de eiwitstabiliteit.
    2. DTT met behulp van demineralisatie kolommen verwijderen.
      Opmerking: Er zijn verschillende ontzouten kolommen beschikbaar. Het protocol hieronder beschrijft de procedure met behulp van specifieke demineralisatie kolommen (Zie Tabel van materialen). Voordat u andere demineralisatie kolommen gebruikt, is het raadzaam de behandeling van hun efficiëntie van DTT verwijdering en eiwit herstel, aangezien sommige demineralisatie kolommen gedeeltelijk de proteïne van belang absorberen kunnen.
      1. De kolom met een kalium (KPi) fosfaatbuffer (40 mM, pH 7.5) equilibreer door volledig vullen van de kolom met de buffer en de buffer druppelen uit laten. Herhaal dit proces 2 x.
      2. De witte schijf filter verwijderen in de kolom door voorzichtig met een pincet naar beneden duwen en verwijderen het is het makkelijkst te verwijderen terwijl de kolom is gevuld met de KPi-buffer. Vullen van de kolom met KPi buffer en Centrifugeer het bij 1.000 x g gedurende 3 minuten.
      3. Overdracht van de kolom in een schone buis, voeg de eiwitSteekproef langzaam naar het midden van de kolom en het Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 2 minuten. De DTT-vrije eiwit is nu in de doorstroming.
    3. Controleer de concentraties (bijvoorbeeldgebruik van een UV/Vis-spectrometer) en meten van de absorptie bij 280 nm. Bereken de concentratie van de eiwitten met de Beer law.
    4. De helft van de eiwitsteekproeven over aliquots verdelen. Incubeer de aliquots in anaërobe omstandigheden (bijvoorbeeldmet behulp van een anaërobe kamer) gedurende 20 min voor een volledige verwijdering van zuurstof. Zegel van de buizen met plastic folie en sla de monsters bij-20 ° C of -80 ° C, afhankelijk van het eiwit.
      Opmerking: In plaats van de anaërobe zaal, de buizen kunnen ook worden geflitst met argon gas te verwijderen van zuurstof.
  2. Voorbereiding van een volledig geoxideerd eiwit
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om voor te bereiden van geoxideerde EiwitSteekproeven uit volledig verlaagd eiwit (eerder beschreven). Dit zal de heterogeniteit in oxidatie Staten van cysteines. Het is mogelijk om te gebruiken verschillende oxiderende reagentia; Hier zijn we gericht op waterstof peroxide (H2O2).
    Let op: Vermijd over-oxidatie omdat het tot ongewenste intramoleculaire disulfide bindingen en irreversibele oxidatie van verschillende aminozuren leiden kan, met inbegrip van cysteïne en methionine, tyrosine, e.a..
    1. De resterende eiwitSteekproef, toevoegen van 5 mM H2O2 (vers verdund) en het Incubeer gedurende 3 uur bij 40 ° C terwijl het schudden.
      Opmerking: De temperatuur in deze stap is afhankelijk van de eiwit en moet worden aangepast aan de eiwitstabiliteit.
    2. De kolom met KPi buffer (40 mM, pH 7.5) equilibreer door volledig vullen van de kolom met de buffer en de buffer druppelen uit laten. Herhaal dit proces 2 x.
    3. De witte schijf filter verwijderen in de kolom door voorzichtig met een pincet naar beneden duwen en verwijderen het is het makkelijkst te verwijderen terwijl de kolom is gevuld met de KPi-buffer.
    4. Vullen van de kolom met KPi buffer en Centrifugeer het bij 1.000 x g gedurende 3 minuten.
    5. Overdracht van de kolom in een schone buis, voeg de geoxideerde eiwitSteekproef langzaam naar het midden van de kolom en Centrifugeer het bij 1.000 x g gedurende 2 min; de geoxideerde eiwit is nu in de doorstroming.
    6. Controleer de eiwit-concentraties zoals in stap 1.2.5, de geoxideerde proteïnen in aliquots verdelen, en bewaar ze bij-20 ° C of -80 ° C, eiwit-afhankelijke.

2. licht verstrooiing aggregatie Assay

Opmerking: Alle concentraties in deze test zijn chaperon - en substraat-specifiek, en moeten worden gekalibreerd. Alle buffers moet 0,22 µm-gefilterd, aangezien het uiterst belangrijk dat de buffers zijn vrij van alle deeltjes of luchtbellen en de cuvettes schoon en stofvrij zijn. Het is zeer belangrijk dat u een roerder in de kwarts cuvette geplaatst. Controleer de roerder van verschillende grootte en vormen teneinde een efficiënt mengen van de gehele oplossing zonder ongewenste luchtbellen produceren. Bovendien, er zijn verschillende flouorospectrometers beschikbaar in laboratoria en faciliteiten. Hier, werd een specifieke fluorospectrometer (Zie Tabel van materialen) gebruikt. Verschillende instrumenten hebben een uiteenlopende gevoeligheid, meting van snelheid en sampler parameters. Daarom moeten de exacte meting parameters (bijvoorbeeld, emissie- en excitatie bandbreedte, gevoeligheid, en anderen) worden geoptimaliseerd met behulp van een bekende aggregatie-naar voren gebogen eiwit en de bijbehorende voorwaarden. Het gebruik van citraatsynthase (CS) en/of luciferase als eerste substraten in nanomolar concentraties is aanbevolen.

  1. Chemische aggregatie assay
    1. Het gedenatureerde substraat voor te bereiden door drachtige 12 µM CS overnachting in 40 mM HEPES (pH 7.5) en 4,5 M GdnCl. Los oog op het behoud van de pH, de GdnCl in de 40 mM HEPES (pH 7.5).
    2. Open de software van de fluorospectrometer en ga naar cursus tijdmeting. De parameters ingesteld op: temperatuur: 25 ° C; Λem: 360; Em bandbreedte: 5 nm; Λex: 360; Ex bandbreedte: 2,5 nm; en gegevens interval: 0,5 s.
    3. Bereid het monster door 1.600 µL van 40 mM HEPES toe te voegen aan een kwarts-cuvette. De cuvette invoegen de monsterhouder en laat het monster de gewenste temperatuur te bereiken.
    4. De roeren ingesteld op 600 rpm en begint de meting tot een basislijn is gevestigd. Houd de roeren op voor de gehele meting.
    5. Voor het meten van de samenvoeging van de CS in de afwezigheid van een chaperone, op 120 s in de meting, toevoegen (zachtjes, maar snel) 10 µL van gedenatureerde CS (eindconcentratie van 75 nM). Blijven de meting voor 1200 s.
    6. Voor het meten van de samenvoeging van de CS in aanwezigheid van Hsp33, op 60 s in de meting, toevoegen Hsp33 (eindconcentratie van 300 nM). Na een extra 60 s, voeg 10 µL van gedenatureerde CS (eindconcentratie van 75 nM). Blijven de meting voor 1200 s.
      Opmerking: Bij het toevoegen van het substraat of de Chaperon, om te voorkomen dat de invoeging van bubbels, gebruik een pipet 10-µL.
  2. Bepaling van de thermische aggregatie
    Opmerking: De temperatuur voor de bepaling van de thermische aggregatie hangt de eiwitstabiliteit en moet worden aangepast aan elke proteïne onafhankelijk.
    1. Open de software van de fluorospectrometer en ga naar cursus tijdmeting. Stel de parameters als volgt: temperatuur: 43 ° C; Λem: 360; Emissie bandbreedte: 5 nm; Λex: 360; Excitatie bandbreedte: 2,5 nm; en gegevens interval: 0,5 s.
    2. Bereid het monster door 1.600 µL voorverwarmde 40 mM HEPES toe te voegen aan een kwarts-cuvette. De cuvette invoegen de monsterhouder en laat het monster bereiken 43 ° C.
    3. De roeren ingesteld op 600 rpm en begint de meting tot een basislijn is gevestigd. Houd de roeren op voor de gehele meting.
    4. Voor het meten van de samenvoeging van de CS in de afwezigheid van een chaperone, op 120 s in de meting, zachtjes toevoegen CS (eindconcentratie van 125 nM) en blijven meten voor 1200 s.
    5. Voor het meten van de samenvoeging van de CS in aanwezigheid van Hsp33, op 60 s in de meting, toevoegen Hsp33 (eindconcentratie van 600 nM). Na een extra 60 s, toevoegen van CS (eindconcentratie van 125 nM). Blijven de meting voor 1200 s.
      Opmerking: Bij het toevoegen van het substraat of de Chaperon, Vermijd de invoeging van bubbels.
  3. Data analyse en ruis verwijderen door Kfits
    Opmerking: Kfits is beschikbaar bij gebruik van Kfits is eerder beschreven in Rimon et al. 45
    1. Het uploaden van het gegevensbestand.
      Opmerking: De ingang is de ruwe resultaten van metingen van de verstrooiing van licht in een tekstuele kommagescheiden of tabgescheiden indeling.
    2. Als u wilt verwijderen geen geluid, kies analyseparameters. Gebruik automatische beste model (aanbevolen), mark de ruis is altijd boven signaal vlag.
    3. Handmatig verwijderen voor de hand liggende uitschieters met behulp van de groene en rode verstelbare lijnen; deze stap zal filteren het geluid boven de groene lijn en onder de rode lijn.
    4. Stel de basislijn en de fit curve. Na het toepassen van de Ruisdrempel, de verwerkte gegevens te downloaden.

3. waterstof-deuterium Exchange massaspectrometrie

  1. Bereiding van buffers en EiwitSteekproeven (Hsp33 en Hsp33-CS complex)
    1. Verdun de eiwitsteekproeven tot een definitieve concentratie van 1 mg/mL in 25 mM Tris-HCl buffer met een pH 7.5 en hen overbrengen in 1.5-mL flesjes.
    2. Bereiden van eiwit-substraat complexe monsters door Hsp33 met CS aan het broeden op een verhouding van 1:1.5 bij 43 ° C.
      1. CS toevoegen op een stapsgewijze manier om te voorkomen een snelle aggregatie en zorgen voor een vruchtbare binding tussen de Hsp33 en het thermisch ongevouwen CS.
      2. Ten minste vier stappen te gebruiken (dat wil zeggen, elke keer dat een kwart van het uiteindelijke volume toevoegen) en Incubeer de monsters gedurende 15 minuten na elke toevoeging aan het toestaan van CS bescherming door Hsp33.
    3. Verwijder eventuele aggregaten met behulp van een 30-minuten centrifugeren bij 16.000 x g bij 4 ° C.
      Opmerking: Nieuwe eiwit-substraat complexen moeten vers bereid. Substraat toevoeging geschiedt geleidelijk; anders, aggregatie zal optreden. Temperatuur, substraat en substraat concentraties zijn proteïne-specifiek.
    4. Bereiden van een buffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7.5), die als controle van deuteration dient, en een buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7.09), die de buffer deuteration. Ook bereiden een verse blussen buffer (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0,1% mierenzuur).
      Opmerking: De blussen buffer moet worden geoptimaliseerd voor de proteïne van belang om de maximale sequentie-dekking na de vertering van pepsine.
    5. Breng alle buffers en monsters in flesjes, en plaats ze in de juiste lade. Houden van buffers H en D bij 25 ° C (tray 25 ° C); aan de andere kant, houd de monsters en blussen buffer bij 0 - 2 ° C (tray 0 ° C). Leg de monsters in 150 µL inzetglas (Zie de Tabel van materialen) eerst, en het overdragen daarvan in flesjes.
  2. Voorbereiding van het instrument
    Opmerking: De massaspectrometer wordt geleverd met twee bijbehorende softwareprogramma's: een besturingselementen de pompen en de andere besturingselementen de massaspectrometer (Zie de Tabel van de materialen). De volgende stappen worden beschreven met behulp van deze twee software-programma's.
    1. Inschakelen handmatig alle koelingen. Zodra alle koelsystemen hun doel temperaturen bereiken, handmatig overschakelen op zowel de laden pompen de krachtige vloeibare chromatografie (HPLC).
      Opmerking: In ons geval, deze bestaan uit twee koeling Baden en een koeling doos (die de val en analytische kolommen bevat). Één koelaggregaat koelt de lade bij 0 ° C, terwijl de andere de lade bij 25 ° C houdt; de temperatuur van de koeling vak is 1-2 ° C.
    2. Open de software die zowel pompen controles, alsmede de software die controle van de massa spectrometer; Zorg ervoor dat MS op stand-by.
    3. Het bedrijfsventiel van HPLC Verbreek de MS-bron en wassen van het systeem eerst met een "drievoudige cleaner"-oplossing (1% mierenzuur, 33% acetonitril, 33% isopropanol, 33% methanol), daarna met buffer B (80% acetonitril, 0,1% mierenzuur) en ten slotte met buffer een (0,1% mierenzuur, pH 2,25), en vervolgens de pepsine-kolom invoegen in het systeem. Als het veranderen van buffers, zorg ervoor om te zuiveren van beide pompen voordat u verdergaat.
    4. Zorg ervoor dat het debiet voor beide pompen 0,1 mL/min is en de druk stabiel is.
    5. Na het wassen het systeem met een gestage stroom en constante druk, de HPLC-outlet invoegen de MS-bron en de MS inschakelen.
  3. Massaspectrometer parameters
    1. De peptide-ionisatie aan electrospray ionisatie (ESI) vastgesteld op 175 ° C, de schede gasstroom op 17, de aux gas gloed op 2, en de spanning van de spray aan 4.5 kV (aanvullende figuur 1).
    2. Instellen van de parameters als volgt voor de niet-Halfzwaar monsters.
      1. De parameters instellen: scanbereik m/z tot 300-1500; Resolutie tot 70.000; Automatische gain control doel (AGC) tot en met 106; en de injectie maximumtijd (IT) bij 100 ms.
        Opmerking: De 5 meest intense ionen met gratis Staten + 2 tot + 6 (hun intensiteit hoger is dan 1,3 x 104) en een dynamische venster voor 30 in worden geisoleerd.
      2. De ion versnippering door hogere-energie collisional dissociatie (HCD) in de cel meerdere-botsing met genormaliseerde botsing energie (NCE) gelijk aan 28 uitvoeren Detecteren van fragment ionen met tandem MS met een resolutie van 35.000, AGC streefcijfer van 105, maximale op 60 ms, en een venster van de isolatie van 2,0 m/z.
    3. Dienst voor de Halfzwaar monsters, MS1 alleen met een hogere resolutie van 140.000 en anders soortgelijke parameters.
  4. Uitvoeren van het experiment
    1. De schaaltjes op volgende manier ingesteld.
      1. Buffer H en D plaats in lade 25 ° C en plaats de monsters en blussen buffer in de 0 ° C-lade.
      2. Plaats X lege flesjes, uitgelijnd in beide bakjes, waarbij X = het aantal monsters x het aantal tijdstippen.
        Opmerking: De lade van 25 ° C, de lege flesjes dienen als reactie flesjes, en ter naar de schenkblad 0 ° C, dienen ze als flesjes blussen.
      3. Elk van de lege flesjes bevat een leeg glas invoegen; verwijderen en vervangen van genoemde invoegen tussen experimenten.
        Opmerking: Om te draaien de HDX-experiment in de meest efficiënte en minst tijdrovende manier, een software waarmee monsters kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd (aanvullende figuur 2) werd gebruikt. De volgende stappen worden beschreven met behulp van deze software.
    2. De software niet openen. De programma-parameters instellen voor het uitvoeren van de volgende.
      1. Elk monster (5 µL) met 45 µL van buffer D Incubeer gedurende enkele minuten, afhankelijk van de gekozen tijdstippen (bv1, 3, 18, 40 en 100 min) bij 25 ° C. Incubeer de niet-Halfzwaar monster met 45 µL van buffer H in plaats daarvan.
      2. Onmiddellijk na de incubatie, Meng 50 µL van Halfzwaar eiwit in 50 µL van ijskoude blussen buffer en injecteert ze in een geïmmobiliseerdet pepsine kolom (lengte, 2.0 mm diameter van 20 mm).
      3. Elueer elke peptides van de pepsine-kolom in de pre kolom door wassen met buffer A voor 6 min in een tempo van 50 µL/min. Keep buffer A in het koel vak bij 0 ° C.
      4. Elueer de peptiden uit de pre-kolom in de C18 analytische kolom (C18 kolom, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 mm x 50 mm, gehouden bij 0 ° C) en scheid de items door toepassing van een lineair verloop van acetonitril op 100 µL/min. Run het acetonitril verloop met behulp van acetonitril 100% als buffer B : 7 min 2%, 7 min 10-30%, 2,5 min 30-90%, 1,5 min op 90%, snelle gradiënt voor 1 min 90-8%, en ten slotte equilibreer de kolom voor 4 min op 2%.
    3. Bouwen van een lopende reeks (Zie aanvullende Figuur 2): Geef alle tijdstippen, monster namen, en locaties in de schaaltjes, evenals de namen van de buffer en locaties.
      Opmerking: De software maakt het mogelijk de uitlijning van alle van de verschillende lopende tijden in een programma dat wordt uitgevoerd meerdere monsters tegelijk, efficiënt minderen lopende tijden.
  5. Data-analyse
    Opmerking: Wij werken met verschillende software-programma's in het proces van data-analyse, met inbegrip van Proteoom ontdekker en MaxQuant (vrije software) voor de peptide identificatie en analyse van de dekking van de reeks, evenals de HDX workbench, een gratis software waarmee de analyse van de opneming van het deuterium in eiwitten, en een vergelijking van de tarieven van de HDX tussen verschillende sets van experimenten. De volgende stappen worden beschreven met behulp van deze software programma's.
    1. Analyseer de peptide dekking van het monster door het uitvoeren van de niet-Halfzwaar controlemonsters via de software (aanvullende Figuur 3). De software met behulp van de volgende parameters instellen.
      1. Gebruik de methode Sequest HT met een No-enzym (aspecifieke) klieven. Zoek voor peptides van 4-144 aminozuren met een massale tolerantie van 7 ppm en 0.5 Da voor de voorloper van de ion en fragment. Zorgen voor een dynamische methionine oxidatie.
      2. Maak een database voor de eiwit, waardoor de software de peptide dekking kunt bepalen. De geïdentificeerde peptiden in tekstuele formaat exporteren.
    2. Analyseer de Halfzwaar resultaten met behulp van de HDX workbench vrije software58.
      1. Open de editor van eiwit en definiëren van de eiwitten door het invoegen van het eiwit sequentie en peptide dekking bestand.
      2. Volgende, open de Setup wizard experimenteren editor en voer alle ingangen opgevraagd.
        Opmerking: Het programma vereist het aantal monsters, het aantal punten van de tijd, het aantal replicatieonderzoeken, de pH-waarde van de buffers, en de temperatuur.
      3. Tot slot Voer de parameters met betrekking tot de massaspectrometer gebruikt, waarna het programma een lijst van gedetecteerde peptiden genereert.
        Opmerking: De software detecteert de "HDX" peptiden, inspecteert isotoop clusters en toont een duidelijke visualisatie van deuteration in de monsters.
  6. De presentatie van gegevens
    1. Het label van de regio's met een openhartig deuteration opname op de structuur met behulp van de PyMol software of een andere visualisatie software.
    2. Invoering van het deuterium opname niveaus in plaats van de waarden van de B-factor.
      Opmerking: Een basishandleiding kan gevonden worden op https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De twee methoden gepresenteerd maken het mogelijk de kinetische activiteit en de dynamiek van eiwit interacties tussen een chaperone en zijn substraat te volgen. Bovendien is de reductie-oxidatie-protocol kunnen de voorbereiding van een volledig verminderde en volledig geoxideerd chaperon, geven een meer diepgaand inzicht in het mechanisme van de activering van redox-afhankelijke ongeordende chaperones.

Ten eerste hebben we gebr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze paper voorzien wij protocollen de analyse van de redox-afhankelijke chaperone activiteit en de karakterisatie van structurele veranderingen op de binding van een client-eiwit. Dit zijn de complementaire methoden potentiële chaperon-substraat complexen definiëren en analyseren van potentiële locaties van de interactie.

Hier, wij deze protocollen voor de karakterisering van een complex tussen de redox-gereglementeerde chaperone Hsp33 met een goed bestudeerde chaperone substraat CS toegep...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn Meytal Radzinski dankbaar voor haar nuttige discussies en kritische lezing van het artikel, en Patrick Griffin en zijn leden van de lab voor hun onbeperkte hulp nodig hebt bij de vaststelling van de HDX analyse platform. De auteurs zijn dank aan de Stichting Duits-Israël (I-2332-1149.9/2012), de Binationale Science Foundation (2015056), de Marie-Curie integratie grant (618806), de Israël Science Foundation (1765/13 en 2629/16), en het Human Frontier Science Programma (CDA00064/2014) voor hun financiële steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5Lsolvent
Formic acid Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC gradeFisher ChemicalsP750717solvent
MethanolFisher ChemicalsA456-212solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich252859buffer
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich76-05-1solvent
Water for HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Msolvent
ZnCl2, Zinc ChlorideMerckB0755416 308reagent
DTTgoldbio27565-41-9reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcareGE healthcare29-9180-07desalting column
Potassium PhosphateUnited states Biochemical Corporation20274buffer
Hydrogen peroxide 30%MerckK46809910526oxidizing agent
citrate synthasesigma aldrichC3260substrate
HEPES acid freesigma aldrich7365-45-9buffer
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdenaturant
Deuterium Chloride Solutionsigma aldrich543047-10Gbuffer
Deuterium Oxide 99%sigma aldrich151882-100Gsolvent
TCEPbioworld42000058-2reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvetteHellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 FluorospectrometerJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifugeThermo Scientific
pH meter, PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm)Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock doorCOY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometerThermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samplesPAL systemhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pumpThermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pumpThermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Datahttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench softwarehttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43(2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804(2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357(2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hsp33 chaperonneactiviteitlichtverstrooiingsassayKfits analysecitraatsynthase aggregatieoxidatieve stressconditieseiwitconformationele veranderingenmassaspectrometrie opstellinganti aggregatieactiviteit

Gerelateerde artikelen