Multimodale volumetrische Retinal Imaging door schuine scannen Laser Ophthalmoscopy (oSLO) en optische coherentie tomografie (OCT)

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om een groot beeldveld (FOV) driedimensionale (3D) fluorescentie en OCT retinale beeld met behulp van een roman imaging multimodale platform. We introduceren de systeeminstellingen, de methode van de aanpassing en de operationele protocollen. In vivo imaging zal worden aangetoond, en representatieve resultaten zal worden verstrekt.

Samenvatting

Hoewel fluorescentie imaging wijd in de oogheelkunde gebruikt wordt, is een groot beeldveld (FOV) driedimensionale (3D) fluorescentie retinale beeld nog steeds een grote uitdaging met de state-of-the-art retinal imaging modaliteiten, omdat zij z-stapelen te vereisen zou het compileren van een volumetrische dataset. Nieuwere optische coherentie tomografie (OCT) en OCT angiografie (OCTA) systemen overwinnen deze beperkingen om driedimensionale (3D) anatomische en vasculaire beelden, maar de kleurstof-vrije aard van LGO kan niet visualiseren lekkage indicatieve van vasculaire dysfunctie. Dit protocol beschrijft een roman oblique laser ophthalmoscopy (oSLO) techniek waarmee 3D volumetrische fluorescentie retinale imaging te scannen. De installatie van de imaging systeem genereert de schuine scannen door de schuifregelaar van een duif staart en Hiermee lijnt u de definitieve imaging systeem onder een hoek met fluorescerende transversale afbeeldingen detecteren. Het systeem maakt gebruik van de laser methode voor het scannen, en daarom, een gemakkelijke integratie van LGO wordt toegestaan als een aanvullende structurele volumetrische imaging modaliteit. In vivo imaging op rat netvlies is hier gedemonstreerd. Fluoresceïne oplossing is intraveneus geïnjecteerd om het produceren van volumetrische fluoresceïne-angiografie (vFA).

Inleiding

Oogheelkunde en visie wetenschap veel baat hebben bij de moderne optische beeldvormingstechnieken, want het netvlies zijn gemakkelijk toegankelijk met licht. Fluorescentie retinale imaging is een essentieel instrument in de diagnose en het beheer van chorioretinal en vaatziekten zoals diabetische retinopathie (DR) en leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD), die beide zijn belangrijkste oorzaken van blindheid in de Verenigde Staten.

Het is echter nog steeds uitdagend te verwerven van een groot beeldveld (FOV), driedimensionale (3D) retinal imaging met behulp van fluorescentie imaging. Fundus fotografie hoeft niet het vermogen diepte-oplossen en doet niet verwerpen diffuus licht. Dientengevolge, vermindert het mengen van de signalen van verschillende diepte de beeldkwaliteit. Scan laser ophthalmoscopy (SLO) en confocal SLO (cSLO) kan het effect van diffuus licht met behulp van de confocal gating¹verminderen. Het is echter moeilijk voor SLO of cSLO te verwerven van een 3D-menselijke netvlies beeld als gevolg van de limiet van hun diepte van de focus. Adaptieve optiek SLO (AOSLO) bieden uitstekende resolutie en contrast door te corrigeren voor de afwijkingen van de wavefront geïntroduceerd door het menselijk oog. AOSLO zou nog moeten echter z-stapelen voor volumetrische imaging². Optische coherentie tomografie (OCT)³ en OCT angiografie (OCTA) systemen overwinnen deze beperkingen om te voorzien in driedimensionale (3D) afbeeldingen van de anatomische en vasculaire^4,5,6, maar de kleurstof-vrije natuur van LGO kan niet visualiseren lekkage indicatieve van vasculaire dysfunctie.

Dit protocol beschrijft een roman multimodale platform voor 3D volumetrische fluorescentie retinal imaging, namelijk scanning schuine laser ophthalmoscopy (oSLO). Een schuine scannen wordt gegenereerd door een dove-staart-schuifregelaar in dit imaging systeem, en een definitieve imaging systeem in een hoek met het detecteren van fluorescentie cross-sectionele beelden wordt uitgelijnd. Het systeem maakt gebruik van laser scannen van methoden, en deze technieken laat gemakkelijke integratie met OCT als een aanvullende structurele volumetrische imaging modaliteit. De huidige diepte resolutie is ongeveer 25 µm in het netvlies van de rat en het gezichtsveld is 30°. In wezen, de oSLO kunt een fluorescerende versie van LGO en gelijktijdig kunnen worden gecombineerd met LGO en OCTA over een grote FOV.

In dit protocol beschrijven we de installatie van het oSLO, de methode van uitlijning en de bouw, de methode van in vivo imaging van rat netvlies en de representatieve resultaten.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van Boston Medical Center.

1. de systeeminstellingen

1. oSLO systeem
   1. Gebruik een supercontinuum laserbron als de bron van de laser systeem.
      1. Het zichtbare licht bereik (450-650 nm) van hogere golflengtegebied (650-2000 nm) scheiden door een dichroïde spiegel (DM1). Vouw het spectrum met een paar verspreide prisma's na de lichtbundel passeren een polarisatie balk splitter (PBS).
      2. Plaats een gleuf te selecteren de excitatie golflengtegebied (475-495 nm). Gebruik een reflecterende spiegel na te denken het gefilterde licht terug naar het prisma paar en vervolgens koppel het licht in een enkelvoudige modus fiber (SMF 1).
      3. Gebruik een spectrometer golflengte selectie aan de uitgang van de modus één vezel te bevestigen.
   2. De interne modus vezel verbinden met twee trapsgewijze optische vezel couplers zoals afgebeeld in Figuur 2. Een van de vezel-uitvoerpoort van de tweede fiber coupler levert het licht aan het oSLO-systeem.
   3. Collimate eerst de laser in het oSLO-systeem.
      1. Afbuigen de laser door een galvanometer spiegel (GM1). Relais de laser een tweede galvanometer spiegel (GM2) door een 1:1 telescoop-systeem, en verder het doorsturen van berichten naar de pupil van het oog door een systeem van 3:1 telescoop.
      2. Installeer een dichroïde spiegel (DM2) binnen het systeem van 3:1 telescoop aan de fluorescentie-signalen.
   4. Montage van het systeem van 3:1 telescoop en de dichroïde spiegel (DM2) op een aangepaste duif staart schuifregelaar verschuiving van de optische as te maken van de schuine scannen van verlichting, zoals afgebeeld in Figuur 3. Gebruik een remklauw om exact bepalen de offset lengte zoals gewenst.
   5. Imaging optische weglengte van fluorescentie.
      1. Weerspiegelen de fluorescentie door de dichroïde spiegel en doorsturen van berichten naar de derde galvanometer spiegel-scannen het langzame scannen.
      2. Doorsturen van het licht naar een imaging objectief door een ander systeem van 1:1 telescoop. Installeer de bovenstaande optica op het podium van een vertaling.
         Opmerking: Twee bijkomende vertaling fasen worden geïnstalleerd onder de derde galvanometer spiegel (GM3) om redundantie in de mate van vrijheid voor het optimaliseren van de beeldvorming.
   6. Monteer een definitieve imaging systeem op een podium met drie graden van vrijheid (rotatie, en twee as van vertaling). Een vlakke camera gebruiken om de transversale fluorescentie beelden te vangen.
2. Optische coherentie tomografie systeem
   1. Gebruik dezelfde supercontinuum laserbron als de bron van de laser systeem.
      1. Het nabij infrarood (NIR) bereik (650-900 nm) van het resterende licht (650-2000 nm) scheiden door een ander dichroïde spiegel (DM3). Gebruik een lange pass filter verder de bandbreedte wilt beperken tot 800-900 nm. Koppel de bundel in een enkelvoudige modus fiber (SMF 2).
   2. De interne modus vezel verbinden met de andere invoerpoort van de twee trapsgewijze optische vezel couplers te combineren met de blauwe oSLO excitatie. Het licht van de tweede-uitvoerpoort van de tweede fiber coupler op de OCT referentie arm, die een variabele neutrale-opaciteitsfilter (VNDF), dispersie compensatie platen en een reflecterende spiegel heeft direct.
      Opmerking: Het licht terug uit de referentie-arm en het oog op de tweede optical fiber coupler recombines en wordt geleverd aan de OCT spectrometer voor het verzamelen van het signaal.
3. Data-acquisitie
   1. Gebruik een data acquisitie systeemsoftware geschreven in LabVIEW en bewerkt uit het scannen protocol van OCTA^7,,^8,,^9,10. Voor elke B-scan, een 80% taakcyclus zag tand met 500 stappen wordt uitgevoerd door het bestuur van een analoge uitgang (AO1) om te controleren de x' snel scannen spiegel, GM2.
   2. Activeren van de line scan camera bij elke stap om gegevens te vergaren voor de LGO alleen wanneer de spiegel is in de voorwaartse richting scannen. De blootstellingstijd instellen voor de line scan camera 17 µs.
   3. Om te krijgen de OCTA-signaal, herhaal de meting 5 keer op dezelfde locatie B-scan.
   4. Stel het AO uitvoer tempo 100 kHz en de OCT A-line tarief op 50 kHz. Controle van de y' langzame scannen spiegel, GM1, door een ramping golfvorm. Synchroniseer de-scannen spiegel, GM3, met GM1-scannen het langzame scannen.
   5. De vlakke camera trigger door een ander bord van de analoge uitgang (AO2) een fluorescerende opname bij elke y' locatie. De imaging grootte bijsnijden of bin van de buurman pixels te verhogen van de snelheid en de gevoeligheid zoals gewenst.

2. systeem uitlijning

1. Aanpassen van de gleuf in de oSLO-lichtbron te selecteren de excitatie van de blauwe golflengte. Een spectrometer gebruiken om te controleren de spectraal bereik te rond 475-490 nm.
2. Stel de schuifregelaar duif staart mount om te verschuiven van de optische as door ~ 5 mm. Dit zal resulteren in een verschuiving op de rat leerling door ~1.7 mm, resulterend in een schuine hoek van ~ 15° op het netvlies.
3. De fase van de vertaling van de fluorescentie detectie optica aanpassen door de dezelfde 5 mm.
4. Pas de laatste fluorescentie imaging systeem te ~ 30°.
5. Meet de optische macht met behulp van een Energiemeter. Zorg ervoor dat de blauwe oSLO excitatie macht ≤0.2 mW en de OCT laser macht ≤0.8 mW, die zal niet netvlies beschadigen.
   Opmerking: Gebaseerd op de ANSI-standaard, de tolerante maximumblootstelling (MPE) aan het netvlies is op het niveau van ~ 2 MW^7,8 in zichtbaar licht bereik. Volgens de formule door Delori et al. ⁹, de maximaal toelaatbare fout voor de in de omgeving van infrarood licht is ongeveer twee keer hoger dan het zichtbare licht, op ongeveer 4 mW.

3. in Vivo dierlijke Experiment

1. Pipetteer een 12-weken mannelijke lange Evans rat in de zaal van inductie. Anesthetize de rat met 4,5% Isofluraan in zuurstof gedurende 10 minuten met een debiet van 2 L/min. door een Isofluraan vaporisator.
   1. Diepte van de verdoving zoals bepaald door een gebrek aan terugtrekking reflex tijdens een interdigital snuifje bevestigen.
2. Na de inductie, de rat op een 5-as (x, y, z-vertalingen, yaw en worp) houder te plaatsen. Verstrekken aanvullende warmte door gebruik van een verwarmde stadium, circuleren van warm water deken of andere geschikte methode in een langdurige experiment. De narcose bij 1,5% van het isofluorane met een debiet van 2 liter/minuten handhaven tijdens het resterende deel van het experiment. Wanneer niet met behulp van een inductie-kamer met actieve uitlaat, moet de kamer van de inductie worden geplaatst op een tafel backdraft of een downdraft of onder een snorkel te scharrelen Isofluraan.
3. Het verwijden van de pupil met 1% Tropicamide ophthalmic oplossing gedurende 2 minuten. Breng 0,5% tetracaïne ophthalmic zoutzuur op de rat's oog voor extra plaatselijke verdoving, indien nodig. Houd het oogje gehydrateerd met commerciële kunsttranen ten minste eenmaal per minuut tijdens het experiment.
4. Injecteren van fluoresceïne zout (10% m/m) of FITC (10% w/w) verdund in een steriele zoutoplossing (0,1-0,3 mL) via de ader van de staart met een 1 mL spuit en een 29G naald.
5. De laserbron inschakelen. Plaats een filter met neutrale dichtheid te verzachten van het blauwe licht excitatie tijdens uitlijning. Meten van de kracht van het licht van de OCT als ~0.8 mW, en het blauwe licht < 0.01 mW om te voorkomen dat de vorming van staar.
6. Startmodus de galvanometer scannen en uitlijning. De hoogte van de bal van de ogen te maken van een stationaire laser plek op het hoornvlies aangepast. Pas de rat ooghoogte zodat de rand van de leerling ongeveer loodrecht op de laser en de laser naar de apicale midden van het oog aan over ~1.5 mm compenseren.
7. Verder pas aan de houder van de dieren totdat OCT beelden optimale kwaliteit bereiken. In de x' snel scannen richting, zorg ervoor dat de transversale B-scan afbeelding plat lijkt. Wanneer u overschakelt naar de y' langzame scannen richting, zorg ervoor dat de doorsnede B-scan afbeelding wordt gekanteld, als gevolg van het schuine scannen.
8. Verwijder filter met neutrale dichtheid aan het blauwe licht excitatie en controleren van de real time feed van de camera. Cross-sectionele fluorescerende afbeelding moet worden weergegeven: bloedvaten verschijnen in verschillende diepten weergegeven.
   1. Pas de focus van de definitieve fluorescentie imaging systeem om de optimale focus te bereiken. Toestaan van kleine aanpassingen van de ooghoogte in het laterale vlak te bereiken optimale beeldkwaliteit van oSLO.
9. Na de uitlijning, beginnen om gelijktijdige OCTA en volumetrische fluoresceïne-angiografie (vFA) te verwerven.
10. Construeer de volumetrische beelden voor zowel OCTA en oSLO in Matlab. De algoritmen worden eerder beschreven in detail¹⁰. Netvlies vasculatures diepte-opgelost door beeldsegmentatie genereren.
11. Na het voltooien van de beeldvorming, uitschakelen van de laser, vrij van het dier passen sommige ophthalmic zalf op de ogen en plaats dan het dier in een herstel-vak.
12. Laat niet het dier zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen of zoals per institutioneel beleid.

Resultaten

Figuur 4a toont een transversale OCT beeld van het netvlies van een rat. Figuur 4b -4 c Toon de dezelfde retinale transversale beelden van OCTA- en oSLO vFA verworven op hetzelfde moment. De oSLO kunt transversale FA analoog aan de OCT B-scan. In vergelijking met OCTA identificeert de oSLO vFA transversale afbeelding duidelijk de vaartuigen in de zenuw vezel laag (NFL) en ganglion cel (GCL) en haarvaten in Meervo...

Discussie

Wij hebben hier, oSLO, een in vivo volumetrische fluorescerende retinal imaging techniek met een FOV van meer dan 30 ° beschreven. In vergelijking met de LGO, een huidige standaard van zorg imaging methode in oogheelkunde, oSLO biedt een soortgelijke 3D-imaging vermogen nog kunt fluorescentie contrast dat OCT is niet gevoelig voor. Het voordeel van oSLO is dat het vereist slechts één raster scan, en dus kan de naadloze combinatie van LGO, twee complementaire technieken te voorzien van structurele en fluoresceren...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Supercontinuum Laserbron	NKT Photonics	SuperK EXTREME EXU-OCT6
Dichroïsche spiegel (DM1)	Thorlabs	DMLP650R
Dichroïsche spiegel (DM2)	Chroma	ZT514/1064rpc
Dichroïsche spiegel (DM3)	Thorlabs	DMLP900R
Single Mode Fiber (SMF 1)	Thorlabs	P3-460B-FC-2
Single Mode Fiber (SMF 2)	Thorlabs	P3-780A-FC-2
Optische vezelkoppeling	Thorlabs	TW850R5A2
1:1 Telescoop systeem	Thorlabs	AC254-100-A×2
3:1 Telescoop systeem	Thorlabs	AC254-150-A×2
3:1 Telescoop systeem	Thorlabs	AC254-50-A×2
Galvo spiegels (GM1,GM2)	Thorlabs	GVS201×2
De-scan Galvo spiegels (GM3)	Thorlabs	GVS011
Objectieflens	Olympus	UplanSApo 20×/0.75
Eind beeldvorming systeem	Olympus	UplanFL N 10×/0.3
Eind beeldvorming systeem	Computar	12-36mm/1:2.8
Camera	PCO	Pco.pixelfly usb
Filter	Thorlabs	FEL0800
Gemonteerde continu variabele ND-filter	Thorlabs	NDC-50C-4M-A
Line scan camera	Thorlabs	SPL2048-140K
Analoge uitvoer board (AO1)	National Instrument	PCI-6731
Analoge uitvoer board (AO2)	National Instrument	PCIe-6351
Long pass filter	Thorlabs	FEL0800