Methodenartikel

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

18.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57826

⸱

2 juli 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, McGill University Montreal, 2Department of Bioengineering, McGill University Montreal, 3Department of Molecular Biology, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICyT), 4Department of Mining and Materials Engineering, McGill University Montreal, 5Department of Biomedical Engineering, McGill University Montreal

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Samenvatting

De cellulaire, biochemische en biofysische heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor communicatie is niet gerecapituleerd door groeiende vereeuwigd kanker cellijnen met behulp van conventionele celcultuur tweedimensionale (2D). Deze uitdagingen kunnen worden overwonnen met behulp van bioprinting technieken om te bouwen van heterogene driedimensionale (3D) tumor modellen waarbij verschillende soorten cellen zijn ingesloten. Alginaat en gelatine zijn twee van de meest voorkomende biomaterialen werkzaam in bioprinting als gevolg van hun biocompatibiliteit, biomimicry en mechanische eigenschappen. Door het combineren van de twee polymeren, bereikt we een hydrogel bioprintable composiet met overeenkomsten met de microscopische architectuur van een inheemse tumor stroma. We onderzocht de bedrukbaarheid van de samengestelde hydrogel via reologie en verkregen van het optimale afdrukken venster. Borstkankercellen en fibroblasten werden ingesloten in de hydrogels en afgedrukt om te vormen van een 3D-model na te bootsen van de communicatie in vivo . De heterogene model van bioprinted bereikt een hoge levensvatbaarheid voor langetermijnkweek van cel (> 30 dagen) en bevordert de zelf-assemblage van borstkankercellen in meercellige tumor spheroïden (MCTS). We hebben vastgesteld dat de migratie en de interactie van de cellen van de fibroblast kanker-geassocieerde (IGFA) met de MCTS in dit model. Met behulp van bioprinted cel cultuur platformen als co cultuur systemen, biedt het een uniek instrument om te bestuderen van de afhankelijkheid van tumorvorming van de stroma-samenstelling. Deze techniek beschikt over een hoge-doorvoer, lage kosten en hoge reproduceerbaarheid kan, en het ook een alternatief model voor conventionele enkelgelaagde celculturen en dierlijke tumor modellen om te studeren Kankerbiologie.

Inleiding

Hoewel 2D celkweek wijd in kankeronderzoek gebruikt wordt, bestaan beperkingen als de cellen worden gekweekt in een opmaak monolayer met een uniforme concentratie van voedingsstoffen en zuurstof. Deze culturen ontbreken belangrijke cel-cel en cel-matrix interacties in de communicatie van de oorspronkelijke tumor (TME). Daarom recapituleren deze modellen slecht fysiologische omstandigheden, wat resulteert in de afwijkende cel gedrag, met inbegrip van onnatuurlijke morphologies, onregelmatige receptor organisatie, membraan polarisatie en abnormale genexpressie, onder andere voorwaarden1,2,3,4. Aan de andere kant, biedt 3D-celkweek, waar cellen worden uitgevouwen in een volumetrische ruimte als aggregaten, spheroïden of organoids, een alternatieve techniek om nauwkeuriger in vitro omgevingen inrichten om te bestuderen fundamentele celbiologie en fysiologie. 3D cel cultuur modellen kunnen ook het aanmoedigen van cel-ECM interacties die kritische fysiologische kenmerken van de inheemse TME in vitro1,4,5 zijn. De opkomende 3D bioprinting technologie biedt mogelijkheden om te bouwen van modellen die de heterogene TME na te bootsen.

3D bioprinting is afgeleid van snelle prototyping en maakt de fabricage van 3D microstructuren die kunnen nabootsen van sommige van de complexiteit van levende weefsel monsters6,7. De huidige bioprinting methoden omvatten inkjet-, extrusie- en laser-assisted afdrukken8. Onder hen kunt de methode van de extrusie de heterogeniteit binnen de afgedrukte matrices worden gecontroleerd door het juist positioneren van verschillende soorten materialen op verschillende locaties van de eerste. Daarom is het de beste aanpak te fabriceren van heterogene in vitro modellen waarbij meerdere soorten cellen of matrices. Extrusie bioprinting is met succes gebruikt om te bouwen van auricular gevormde steigers9, vasculaire structuren10,11,12, en de huid weefsels13, wat resulteert in hoge afdrukken trouw en cel levensvatbaarheid. De technologie beschikt ook over veelzijdige materiële selecties, de mogelijkheid om te storten materialen met cellen ingebed met een bekende dichtheid, en hoge reproduceerbaarheid14,15,16,17 . Natuurlijke en synthetische hydrogels worden vaak gebruikt als bioinks voor 3D bioprinting als gevolg van hun biocompatibiliteit, topicale en hun hydrofiele netwerken die kunnen worden ontworpen om te lijken structureel op de ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels zijn ook voordelig aangezien zij zelfklevende sites voor cellen, structurele elementen, permeabiliteit voor voedingsstoffen en gassen opnemen kunnen en de juiste mechanische eigenschappen te moedigen cel ontwikkeling24. Bijvoorbeeld, bieden collageen hydrogels integrine anchorage sites die cellen gebruiken kunnen om te koppelen aan de matrix. Gelatine, gedenatureerde collageen, behoudt vergelijkbare cel adhesie sites. Daarentegen alginaat is bioinert maar geeft een mechanische integriteit door de vorming van crosslinks met divalente ionen25,26,27,28.

In dit werk ontwikkelden we een samengestelde hydrogel als een bioink, samengesteld uit alginaat en gelatine, met overeenkomsten met de microscopische architectuur van een inheemse tumor stroma. Borstkankercellen en fibroblasten werden ingesloten in de hydrogels en afgedrukt via een extrusie gebaseerde bioprinter om te maken van een 3D-model dat de communicatie in vivo nabootst. De gemanipuleerde 3D-omgeving kunnen kankercellen aan vormen van meercellige tumor spheroïden (MCTS) met een hoge levensvatbaarheid voor lange periodes van cultuur van de cel (> 30 dagen). Dit protocol laat zien van de methoden van samengestelde hydrogels synthese, karakterisering van de materialen microstructuur en bedrukbaarheid, bioprinting cellulaire heterogene modellen, en observeren van de vorming van MCTS. Deze methoden kunnen worden toegepast op andere bioinks in de bioprinting van de extrusie ook over verschillende ontwerpen van heterogene weefsel modellen met mogelijke toepassingen in drug screening, cel migratie tests en studies die gericht zijn op fundamentele cel fysiologische functies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding van de materialen, Hydrogel en cel cultuur materialen

  1. Voorbereiding op het materiaal en de oplossing
    1. Wassen en drogen van 250 mL en 100 mL glazen bekers Magneetroerders, spatels, 10 mL cartridges, 25 G cilindrische sproeiers met (een lengte van 0.5 in) en een inwendige diameter van 250 µm. De materialen steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C/15 min. hen/1 atm. de materialen onder steriele omstandigheden houden tot gebruik.
      Nota: Verwijs naar de Tabel van materialen voor leveranciersgegevens.
    2. Weeg af 3 g alginaat (3% w/v) en 7 g van gelatine (7% w/v) (hierna aangeduid als A3G7).
    3. Het steriliseren van de volgende items onder UV-licht voor ten minste 4 h: alginaat en gelatine poeders, paraffine film, aluminiumfolie stukken van 5 cm,2, en 1 mL en 5 mL spuiten. De eindkappen, tip caps en zuigers steriliseren door ze onder te dompelen in 70% ethanol voor ten minste 4 uur en was ze 2 x met gesteriliseerde Ultra zuiver water.
      Nota: Verwijs naar de Tabel van materialen voor leveranciersgegevens.
    4. Los 4 g agarose met ultra zuiver water en het steriliseren in autoclaaf.
      Opmerking: De agarose volledig is opgelost na de autoclaaf proces.
    5. Bereid een 100 mM-oplossing van watervrij calciumchloride (CaCl2) in de gesteriliseerde ultra puur water en een steriel filter (met een poriegrootte van 0,22 µm) voorafgaand aan het gebruik.
    6. Voor agarose beklede 6-Wells-platen, smelten de steriele agarose in een magnetron te verkrijgen van een vloeibare oplossing; vervolgens, onder een bioveiligheid kabinet (BSC) en het gebruik van een micropipet van 1 mL, voeg toe 2 mL per putje en meng dit voorzichtig tot een uniforme laag in de bodem van de put. Laat afkoelen en verzegel de put met paraffine film. Houd het bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik.
  2. Voorbereiding van de voorloper van de hydrogel A3G7
    1. Meng 3 g alginaat en 7 g van gelatine poeders in een bekerglas van 250 mL binnen een BSC. Voeg een magneetroerder en 100 mL DPBS. Zegel van het bekerglas af met steriel paraffine film en aluminium folie (5 cm2) om verontreiniging te voorkomen.
    2. Los de poeders onder een constante agitatie in een magnetische/hete plaat met 600 t/min bij 60 ° C gedurende 1 h en RT voor een extra 2 h.
    3. Verwarm het materiaal bij 37 ° C, totdat de gel faseovergang fase naar de vloeibare toestand (voor 100 mL oplossing van de voorraad gel, dit duurt ongeveer 45 min). Breng de oplossing kwantitatief over in steriele 50 mL conische centrifuge buizen, zegel ze en centrifugeer de buizen bij 834 x g gedurende 5 min te elimineren alle gasbellen uit het materiaal.
    4. De voorloper van de hydrogel gecombineerd in 10 mL spuiten. Zegel het spuiten met caps en paraffine film. Bewaren hen bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Celcultuur
    Opmerking: De stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
    1. Voorbereiden op het basale DMEM medium als volgt (1 L): in een BSC, meng 100 mL foetale runderserum (FBS) plus 10 mL van een antibioticum/antimycotic oplossing (een 100 x gestabiliseerde oplossing) in een verse steriele container. DMEM medium om aan te passen van het mengsel toevoegen aan tot 1000 mL. Verzegelen van de container en houd het bij 4 ° C.
    2. In een eerder verwarmde waterbad (37 ° C), ontdooi 1 flacon van MDA-MB-231-GFP (menselijke borst kanker cellijn GFP-label, nucleaire localisatie) en 1 flacon van IMR-90-mCherry (kanker-geassocieerde fibroblast cellijnen mCherry-label, met cytoplasmatische localisatie ) cellen van de opslag van vloeibare stikstof door ze te verplaatsen voorzichtig in het water. Cellijnen, zowel de plasmiden voor GFP en mCherry labeling, zijn commercieel verkrijgbaar.
    3. Pipetteer 160 µL per putje van cell oplossing (3 x 106 cellen/mL) in een 6-well-plate en voeg 5 mL van verwarmde (37 ° C) basaal DMEM medium. Incubeer de plaat duikt met 37 °C/5% CO2 24-48 uur totdat de cellen samenvloeiing van 80%.
    4. Nadat de cellen samenvloeiing bereiken, negeren van het medium en spoel de cellen tweemaal met DPBS; Incubeer de cellen met 500 µL van trypsine-EDTA oplossing per putje (0,25%, 1 x, eerder opgewarmd bij 37 ° C) bij 37 ° C gedurende 6 minuten. Vervolgens de inactivering van de trypsine door toevoeging van 500 µL van FBS, herstellen van de cell-oplossing en overdragen naar T-75 kolven. Incubeer hen weer bij 37 °C/5% CO2 de cellen tot 80% samenvloeiing.
      Opmerking: Het volume van de trypsine-EDTA-oplossing kan variëren afhankelijk van de celgroei schip.
    5. Herhaal de vorige stap om te werken met cellen op passage 3-4 als thats wanneer cellen hebben meer metabole activiteit en stabiliteit.
    6. Met behulp van een trypan blauwe assay (0,4%) om te bepalen van de oorspronkelijke concentratie van cellen worden gemengd met de hydrogel cellen tellen.

2. meten van Rheologische eigenschappen van Hydrogels

  1. De voorloper van alginaat/gelatine hydrogel, zoals beschreven in stap 1,2 voor te bereiden.
    Opmerking: Steriele omstandigheden zijn niet vereist voor monsters die zijn gegenereerd voor mechanische testen en analyse. Alle Rheologische tests worden uitgevoerd in drievoud.
  2. Neem een spuit van de voorloper van de hydrogel en het opwarmen in een waterbad 37 ° C gedurende 1 uur.
  3. Zet de rheometer en Initialiseer het systeem volgens de volgende stappen uit.
    1. Zet de luchtcompressor aangesloten op het rheometer en laat de luchtcompressor uitvoeren voor 30 min. Switch op de temperatuur control box voor de rheometer, zet de rheometer zelf, en schakel de computer met de rheometer verbonden.
    2. De rheometer-software niet openen, klik op initialiseren op het bedieningspaneel, en laat de initialisatieproces Voltooien. Stel de temperatuur van het platform op 37 ° C op het bedieningspaneel.
    3. Klik op het tabblad Measuring set en navigeer naar het service Startfunctie, selecteer aanpassen stuurprogramma traagheid in het drop-down menu en klikt u op Start van de aanpassing in het pop-upvenster.
    4. Monteer een parallel meetinstrument in de rheometer. Alle experimenten uitgevoerd hier gebruiken een 25 mm diameter plaat met een opening van 1 mm tussen de platen.
    5. Klik op Set van nul-gap op het bedieningspaneel en wacht op de procedure te voltooien. Aandacht besteden aan de normaalkracht tijdens dit proces.
      Opmerking: Na deze procedure moeten de normaalkracht 0.
    6. Klik op het tabblad meten reeks en navigeer naar het startfunctie van de service, selecteer aanpassen bovenste metende systeem traagheiden klikt u op Start van de aanpassing in het pop-upvenster. Zodra gedaan, klik op de driehoek-knop op het bedieningspaneel om het meetinstrument om omhoog te gaan.
  4. Voeren een amplitude sweep.
    1. Klik op Start, klik op Invoegen in het bovenste menu, selecteer wachten uit de drop-down menu. Trek het setup-venster en de wachttijd ingesteld op 2 h.
      Opmerking: Dit zal een stap te wachten voordat de tests toevoegen.
    2. Klik op Start, vervolgens klikt u nogmaals op de knop Invoegen en uit de drop-down menu, selecteer apparaat. Optrekken van het setup-venster, kies temperatuur, en stel het 25 ° C. Uncheck de doos van het wachten tot waarde is bereikt.
    3. Klik op de stap meting, klik op de variabele Oscillation stam, optrekken van het instellingenvenster, profiel aan oprit logaritmeworden en Uwijzigtdewaarde 0.001% en 100% als het aanvankelijke stam en de laatste stam, respectievelijk. Stel de frequentie bij 0,01 Hz.
    4. Klik op de knop toevoegen als u wilt toevoegen van de variabele temperatuur . Klik op de variabele temperatuur en stel het 25 ° C. In het venster pull-up Calculatoruit te breiden, stelt u punt dichtheid op 10 punten/decennium.
    5. Neem de spuit uit het waterbad en extruderen van ongeveer 0,5 mL van de voorloper op het platform rheometer.
    6. Klik op de neerwaartse driehoek knop op het bedieningspaneel. Wachten op het meetinstrument om te gaan naar de positie van trimmen.
    7. Gebruik een spatel om trim eventuele overtollige precursoren die aan de rand van het meetinstrument ontsnapt en negeren het overbodig materiaal.
    8. Pipetteer van minerale olie op de rand van het meetinstrument en wacht totdat de olie volledig de grens zeehonden.
    9. Klik op Doorgaan op het bedieningspaneel. Klik vervolgens op de knop Start (de groene driehoek), gevolgd door op de button Doorgaan klikt op het onderste scherm.
    10. Wanneer de test wordt uitgevoerd, het vrijgeven van het meetinstrument, en klik vervolgens op de omhoog driehoek knop op het bedieningspaneel. Verwijder het meetinstrument en reinig het met 70% ethanol. Reinig het platform met 70% ethanol.
    11. In het huidige project, klik op de stap meting en trek het instellingenvenster. Nu, houden de frequentie tot 100 Hz. alle andere parameters dat is ongewijzigd.
    12. Herhaal stap 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Klik op Diagram. Observeren van de curve van G', G " ten opzichte van de trilling-stam. Vinden van de punten van de uitwijking van G' voor beide frequenties (0.01 Hz en 100 Hz). Vind de overeenkomstige trilling stammen voor beide punten doorbuiging.
    14. Kies de kleinere trilling stam en gebruik van 1/10 van deze spanning voor alle trilling proeven daarna.
      Opmerking: Het begin van de G' afbuiging wordt beschouwd als de ultieme lineair elastische stam (modules) die niet mag worden overschreden in follow-up tests. De verhouding 1/10 is het meestal gebruikt in engineering om veiligheidsredenen. Dit berekende stam wordt aangeduid als gC.
    15. Nadat de test is voltooid, klikt u op tabel, alle gegevens kopiëren en plakken in een tekstbestand.
  5. Het gedrag van een temperatuur sweep.
    1. Klik op mijn apps en selecteer de sjabloon temperatuur oprit, oscillerende schuintrekken: gelering.
    2. Geef het project de naam.
    3. Klik op de stap meting in de workflow. Klik op de variabele temperatuur, optrekken van het setup-venster en Steldetemperatuur in eerste en laatste als 37 ° C en 25 ° C, respectievelijk.
    4. Ingesteld in het venster pull-up trilling stam tot 0,1%, 1Hz frequentie trilling. Vervolgens stelt u het aantal gegevenspunten als 61. Ingesteld de frequentie van de collectie gegevens op 1 punt/min. Klik Calculator en wijs dichtheid tot 0,2 ° C/point.
      Opmerking: Hierdoor kan de temperatuur wijzigen met een snelheid van 0,2 ° C/min.
    5. Laad het monster op het platform rheometer en voer de test uit door stap 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klik op Diagram, observeren de G', G " ten opzichte van de temperatuur. Vinden van de cross-over punt voor G' en G ". De temperatuur op de cross-over punt vinden.
      Opmerking: Dit is de temperatuur van de overgang sol/gel van de voorloper van de hydrogel.
    7. Herhaal stap 2.4.15.
  6. Voeren een sweep isothermische tijd.
    1. Klik op mijn apps vinden en klik op de sjabloon isothermische tijd-temperatuur testen. Klik op de stap meting in de werkstroom, en klik de variabele Oscillation stam, optrekken van het venster setup ingesteld van de trilling-stam tot 0,1%, en de frequentie van de trilling op 1 Hz. In het venster pull-up stelt u het aantal gegevenspunten tot 120. Stel de frequentie van de collectie gegevens op 1 punt/min.
      Opmerking: De waarde van deze soort is gebaseerd op de resultaten van de amplitude sweep.
    2. Klik op toevoegen knop om de temperatuur variabele toe te voegen. Klik op variabele temperatuur in het middelste venster en stel deze in op 25 ° C.
      1. Klik met de rechtermuisknop het apparaat verplaatsen naar het meetpunt stap in de werkstroom, klikt u op verwijderen. Klik op de stap apparaatset waarde, schakelt u het selectievakje wachten tot waarde is bereikten waarde ingesteld op 25 ° C. Klik op de foto, Tittel, knoppen op het onderste scherm, uncheck de doos Doorgaan. Vervolgens klikt u op de stap beginnen, naam van het project en sla het.
    3. Laad het monster op het platform rheometer en start de test door na stappen 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Observeren van de G', G " ten opzichte van de tijd. Vinden van de cross-over punt voor G' en G ". De tijd op de cross-over punt vinden. Nadat de test is voltooid, klikt u op tabel, alle gegevens kopiëren en plakken in een tekstbestand.
      Opmerking: Dit is de tijd van de overgang sol/gel van de voorloper van de hydrogel bij 25 ° C.
  7. Het meten van de sterkte van de opbrengst op verschillende gelerend tijdstippen.
    1. Klik op mijn apps vinden en klik op de sjabloon rendement en stroom stress, Gel-achtige. Geef het project de naam. Klik op de Start stap in de werkstroom. Klik op Invoegen in het menu bovenaan, en in het drop-down menu, selecteer wachten. Optrekken van het instellingenvenster en stel de wachttijd als 20 min.
      Opmerking: Dit zal een stap te wachten voordat de tests toevoegen.
    2. Klik op Start, klik vervolgens op Invoegen weer, en in het drop-down menu, selecteer apparaat. Optrekken van het instellingenvenster, koos van temperatuur, en zet deze op 25 ° C. Uncheck de doos wachten tot waarde is bereikt.
    3. Klik op de stap meting in de workflow, selecteert u de variabele schuifspanning, optrekken van het setup-venster en de eerste en laatste schuifspanning ingesteld op 0 en 10.000 Pa, respectievelijk.  Klik op Rekenmachine, stelt u de dichtheid van het punt op 0,2 punt/Pa. Stel in de gegevenspunten lusje op de linkerzijde, 1 punt per seconde.
      Opmerking: dit zal resulteren in een stress ramping-rate van 5 Pa/s.
    4. Klik op het tabblad gebeurtenis beheer aan de onderkant van het venster pull-up en stel het stop-criterium: stop de meting als de shear stem > 100 s-1.
      Opmerking: Dit zal automatisch stoppen de meting als het materiaal is opgeleverd.
    5. Laad het monster op het platform rheometer en start de test door na stappen 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Klik op Diagram. Observeren van de stam-stress-curve. Het punt van de doorbuiging van de stam en de bijbehorende stress te vinden. Herhaal stap 2.7.2 - 2.7.6, maar de wachttijd wijzigen in 30, 40 en 50 min. voor elke repliceren; Dit zal resulteren in de vloeispanning per gelerend onverpakt.
      Opmerking: Deze stress wordt beschouwd als de schijnbare vloeispanning.
      Opmerking: software klikken kunnen verschillen door de rheometer modellen en softwareversies. Lezers te nemen van de verwijzing van de testende parameters die wij bieden, is het raadzaam even verwijzen naar de handleiding van specifieke rheometer/software in de praktijk.
       

3. steigerwerk ontwerp, cel-beladen Hydrogel en afdrukken in 3D modellen

  1. Steiger ontwerp
    1. Teken een propeller-achtig model op papier.
      Opmerking: De propeller-achtig model is ontworpen op basis van de volgende overwegingen: a zij simuleert de in vivo scenario waar kankercellen zijn omringd door IGFA; (b) het minimaliseert de concentratie van stress via het gebruik van circulaire geometrieën; (c) het is flexibel, zodat meer sectoren in het model in de toekomst kunnen worden toegevoegd zonder dat de bestaande geometrieën; en (d) het is plat in de verticale schaal om nutriënten diffusie.
    2. Laat het midden van de propeller worden de oorsprong en de symbolen R0, R1en R2 gebruiken voor de maximale straal van de binnenste cirkel, sectoren van de middelste en buitenste sectoren, respectievelijk. Kunt de symbolen m en n het aantal interne bogen en spaken binnen de sector gebied, respectievelijk vertegenwoordigen.
    3. Berekenen van de coördinaten van elk knooppunt in het model van de propeller-achtige en schrijf deze op de symbolische expressies van R0, R1 R2, men n.
    4. Start een programma script, R0, R1, R2, men n als variabelen instellen en input van de symbolische uitdrukking van elk belangrijke knooppunt.
      Nota: Verwijs naar de Tabel van materialen voor alle software-informatie.
    5. Regelen van een pad dat de knooppunten verbindt en toewijzen van een cartridge voor de binnenste cirkel, de middelste sectoren en de buitenste sectoren. De laagdikte 150 µm en het aantal lagen 4 instellen
    6. Laat het programma uitvoer een tekstbestand in de indeling van de G-code dat herkenbaar is door de bioprinter.
    7. Instellen van R0 = 3,85, R1 = 6.85, R2 = 8.65, m = 2, en n = 5. Voer het script en het gegenereerde bestand van de G-code op te halen. Kopieer en plak het bestand naar de speciale G-code van de bioprinter map.
    8. Zet de bioprinter en de besturingssoftware. Initialiseren van de printer. Open het script van de G-code gewoon gemaakt en alle druk ingesteld op nul. Terug naar de controle-software, klik op het tabblad Scaffolder generatoren klik vervolgens op de knop uitvoeren op de rechter benedenhoek. Observeer het bewegende pad van de printer.
      Opmerking: Dit zal de precisie van de gegenereerde G-code test. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor informatie met betrekking tot de bioprinter.
    9. Deze stap is optioneel. Het bouwen van een demonstratieve 3D model op basis van de parameters boven via de software van de computer-aided design (CAD).
      Nota: Verwijs naar de Tabel van materialen voor de informatie van de software leverancier.
  2. Maken van een cel-beladen A3G7 hydrogel voorloper
    Opmerking: De stappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Houd de bioprinter binnen een BSC.
    1. De bioprinter door het sproeien van 70% ethanol grondig steriliseren en blootstelling aan UV-licht 's nachts.
    2. Neem een spuit van de voorloper van de hydrogel (bij 4 ° C) en warm het in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    3. Neem de T-kolf met cellen (zie stap 1.3) uit de CO2 incubator en plaats het binnen een BSC. Gooi het kweekmedium en spoel de cellen met DPBS tweemaal. Voeg een verwarmde trypsine-EDTA-oplossing (3,0 mL) en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 6 min. Inactivate de trypsine met een gelijk volume FBS. Met behulp van trypan blauwe assay cellen tellen.
    4. Neem de spuit van de voorloper van de hydrogel uit het waterbad, schoon, en het steriliseren met 70% ethanol. Zet de spuit in de BSC.
    5. Diepte ongeveer 3 mL hydrogel voorloper in een 10 mL afdrukken cartridge. Meng de voorloper met MDA-MB-231-GFP cellen op 1 x 106 cellen/mL door langzaam pipetteren, het vermijden van de productie van bubbels. Dekking van de cartridge met de steriele einde en top caps en verzegel het met paraffine film. Centrifugeer het bij 834 x g voor 1 min te elimineren alle gasbellen geproduceerd.
    6. Herhaal stap 3.2.3 - 3.2.5 voor de cel-beladen voorloper van IMR-90-mCherry en de voorloper van cel-vrij.
    7. Alle 3 cartridges met 70% ethanol steriliseren en ze vervolgens te laden in de kamers van de bioprinter. In de software van de controle van de drukkerij, Steldetemperatuur cartridge tot 25 ° C. Wacht 35 min zodat de voorloper van afdrukbare voorwaarden te bereiken.
      Opmerking: Deze tijd heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen die zijn ingesloten in de hydrogel.
  3. 3D-printen modellen
    1. In de software van de controle van de drukkerij, uitbreiden van het tabblad hulpprogramma hoofd in de software van de controle van de printer en klik op op 1 cartridge op de grafische interface op de linkerzijde klik dan de knoop van de maatregel korte voor het meten van de positie van het uiteinde van het mondstuk. Herhaal dit voor de andere 2 cartridges.
    2. Plaats een duidelijk polystyreen microplate, de G-code-bestand openen en wijzigen in de druk 200 kPa voor alle cartridges. Terug naar de controle-software, klik op het tabblad Scaffolder generator, een punt om te beginnen met afdrukken selecteren en klik vervolgens op de knop uitvoeren op de rechter benedenhoek. Herhaal deze stap om 3 meer replicatieonderzoeken.
    3. Voeg een 100 mM CaCl2 oplossing voor cross-link van de modellen voor 1 min en spoel het na het afdrukken van alle replicatieonderzoeken van de propeller-modellen, 2 x met DPBS om te verwijderen van de overmaat van Ca++ ionen.
    4. Breng zorgvuldig de modellen op een agarose beklede 6-well bord met behulp van een spatel. Voeg 5 mL van DMEM media aan elk putje. Incubeer de platen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de modellen zijn zwevend in de putjes.
    5. Het kweekmedium cel met verse medium om de 3 dagen vervangen, cultuur het voor 30 dagen in totaal.

4. levensvatbaarheid en sferoïde vorming experimenten op de Hydrogel schijven.

  1. Hydrogel schijf voorbereiding
    1. Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.6.
      Opmerking: Het is mogelijk ter vervanging van de cartridge met een kleine steriele container.
    2. Gebruik een steriele afgestudeerd 1 mL spuit en snijd het mondstuk om te maken een groot gat in de spuit (het gat heeft dezelfde diameter als de rest van de spuit buis). Schoon met 70% ethanol en laat deze tot het droog is.
      Opmerking: Dit doen in een steriele BSC.
    3. Gebruik de deksel van een goed-plaat, 100 mM CaCl2 toevoegen totdat het oppervlak bedekt is; dan nemen de cel-beladen hydrogel te vullen de spuit; extruderen van 100 µL met behulp van de opknoping drop methode. Laat de hydrogel voor 1 min en spoel het met buitensporige DPBS. Breng de hydrogel schijven op een agarose-gecoat 6-well bord, voeg 5 mL van basale DMEM, en hen Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende maximaal 30 dagen. Vernieuw het medium om de 3 dagen.
  2. Cel en sferoïde levensvatbaarheid
    1. Gebruik een MTS-test om te bepalen van de levensvatbaarheid van de cellen. Wassen van elke schijf met DPBS en snijd het in 4 delen met een fijne steriele mes. De delen van de hele schijf verzamelen en overbrengen naar een 96-wells-plaat. Vervolgens Voeg 100 μl van DMEM plus 20 μL van MTS reagens toe aan elk putje en Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    2. Na de MTS-reactie, herstellen van het supernatant en overbrengen naar een schone 96-wells-plaat. Meet de extinctie van de monsters bij 490 nm.
  3. Sferoïde vorming
    1. Neem de bebroede propeller of schijf model uit de incubator dagen 0, 7, 15, 21 en 30 van de cultuur en overbrengen naar een schone 6-well-plate.
    2. Gebruik een confocal draaiende schijf omgekeerde Microscoop visualiseren van de spheroïden en het verwerven van de beelden met behulp van meerdere posities en z-stacks. Het imago van elke propeller, of schijf model, langs de horizontale diameter van links naar rechts met een tussenruimte van 500 µm en een z-stack van de bodem naar de top brandvlak op elke horizontale positie verwerven.
      Nota: Verwijs naar de Tabel van materialen voor de leveranciersgegevens.
    3. Het beeld met behulp van een maximale stapel rekenkundige hulpmiddel, geboden door de programma ImageJ, maken de 2D afbeeldingen die worden gebruikt voor de analyse van een sferoïde reconstrueren.

5. scanning elektronen microscopie (SEM)

  1. De hydrogel alginaat/gelatine zoals beschreven in stap 1,2 voor te bereiden.
    Opmerking: Steriele omstandigheden zijn niet vereist.
    Let op: Vloeibare stikstof en paraformaldehyde zijn gevaarlijk en moeten met zorg worden behandeld.
  2. 1 mL hydrogel gestoken in een mortier, vloeibare stikstof toevoegen en grind met behulp van een stamper. Doorgaan met het toevoegen van vloeibare stikstof om te voorkomen dat de hydrogel van ontdooiing. Breng het poeder in een centrifugebuis 1,5 mL, zegel en opslaan bij-80 ° C voor 2 h. Freeze-dry het monster gedurende 24 uur.
  3. Voor sferoïde imaging, wassen de hydrogel voorzichtig met DPBS 2 x, bevestigen de cellen door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij 37 ° C, spoel ze af met DPBS en bevriezen ze met vloeibare stikstof. Tot slot, freeze-dry het monster gedurende 24 uur.
  4. Analyseren van de hydrogel/sferoïde structuur en morfologie met een Scannende Elektronen Microscoop (SEM) op 25,0 kV, onder 70 Pa (kamer druk) met een vergroting van 40 X tot 5, 000 X.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De temperatuur sweep toont een duidelijk verschil van de voorloper van de A3G7 bij 25 ° C en 37 ° C. De voorloper is vloeibare bij 37 ° C en heeft een complexe viscositeit van 1938.1 ± 84.0 mPa x s, die is gevalideerd door een grotere G "over G'. Als de temperatuur daalt, ondergaat de voorloper fysieke gelering toe te schrijven aan de spontane fysieke verstrengeling van de gelatine moleculen in een tri-helix vorming29,30. Zowel de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cel-beladen structuren kunnen worden aangetast als er verontreiniging (biologische of chemische) optreedt op elk punt in het proces. Meestal, biologische verontreiniging wordt gezien na twee of drie dagen van de cultuur als een kleur wijzigen in de cultuur-media of de structuur van de bioprinted. De sterilisatie (fysische en chemische desinfectie) is daarom een belangrijke stap voor alle cel-gerelateerde processen. Opmerkelijk, autoclaaf gelatine verandert de gelerend eigenschappen, waardoor het langzamer gel in de proev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Tao Jiang bedankt de China Scholarship Raad (201403170354) en het McGill doctorale techniekprijs (90025) voor de financiering van hun beurs. Jose G. Munguia-Lopez Bedankt CONACYT (250279, 290936 en 291168) en FRQNT (258421) voor de financiering van hun beurs. Salvador Flores-Torres Bedankt CONACYT voor hun beurs financiering (751540). Joseph M. Kinsella bedankt de National Science en Engineering Research Council, de Canadese Stichting voor innovatie, Townshend-Lamarre Family Foundation en McGill University voor hun financiering. We zouden graag bedanken Allen Ehrlicher voor het toestaan van ons om te gebruiken zijn rheometer, Dan Nicolau voor het toestaan van ons om te gebruiken zijn confocal microscoop en Morag Park voor de toekenning van ons toegang tot fluorescently geëtiketteerde cellijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium alginateFMC BioPolymerCAS-No: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
GelatinSigma-AldrichG9391Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X)GibcoLS141901361×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplateCorning N/AStirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubesCorning352098Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
CentrifugeGMIN/ASorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrousSigma-AldrichC1016
MilliQ waterMilliporeN/A
Millipore 0.22 µm filtersMilliporeSLGS033SBMillex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302Anton PaarN/A
Rheometer measuring tool CP25Anton Paar79038Conical plate geometry for rheometer
RheoCompassAnton PaarN/ASoftware controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscopeHitachiN/ASEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pureAcros Organics416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM)Gibco11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilizedSigmaA5955
Fetal bovine serumWisent Bioproducts080-150
Cell culture T-75 flasksSigma-AldrichCLS43064175 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
GeSim softwareGeSiMN/ASoftware controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resistEFD Nordson7012126
End capEFD Nordson7014472
Tip capEFD Nordson7014469
Piston EFD Nordson7012182
Stainless nozzle G25EFD Nordson7018345
Water bathVWRN/A
AgaroseSigma-AldrichA9539Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates Corning3516TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscopeOlympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS assay kitPromegaG3582CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kitMolecular Probes,ThermoFisher ScientificL3224
Trypsin 0.25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96-well plateCorning3595Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave TuttnauerHeidolph BrinkmannN/AHeidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blueInvitrogen T102820.4% solution
EthanolCommercial AlcoholsP016EA95Greenfield Speciality Alcohols
CO2 IncubatorPanasonicN/AMCO 19AIC-PA
Lyophilizer SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/AA CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLABThe MathWorksN/AA programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

Referenties

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101(2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575(2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1 (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020(2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003(2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. , McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bioprintbare hydrogel3D tumormodelrheologieanalyseborstkankercellenkankerassociated fibroblastenmulticellulaire tumorsfero denconfocale microscopiesteriele bioprinting

Gerelateerde artikelen