Een snelle beeld-gebaseerde bacteriële virulentie Assay met behulp van Amoeba

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de virulentie van de planktonische of oppervlak-ingeschrevenen bacteriën met behulp van D. discoideum (amoeba) als een host. Virulentie wordt gemeten over een periode van 1 h en host doden is gekwantificeerd aan de hand van de fluorescentie microscopie en beeld-analyse. We laten zien dat dit protocol met behulp van de bacterie P. aeruginosa.

Samenvatting

Traditionele bacteriële virulentie tests omvatten langdurige blootstelling van bacteriën in de loop van enkele uren naar gastheer cellen. Gedurende deze tijd, kunnen bacteriën ondergaan veranderingen in de Fysiologie als gevolg van de blootstelling aan groei hostomgeving en de aanwezigheid van de cellen van de gastheer. We ontwikkelden een test voor het snel meten van de staat van de virulentie van de bacteriën die de mate waarop bacteriën in aanwezigheid van cellen van de gastheer groeien te minimaliseren. Bacteriën en amoeben zijn vermengd en geïmmobiliseerd op een enkel imaging vliegtuig met behulp van een agar-pad. De procedure wordt eencellige fluorescentie imaging met calceïne-acetoxymethyl ester (calceïne-AM) als een indicator van host cell gezondheid. De fluorescentie van cellen van de gastheer wordt geanalyseerd na 1 h van de blootstelling van cellen van de gastheer aan bacteriën met behulp van microscopie van epifluorescence. De software van de analyse van de afbeelding wordt gebruikt voor het berekenen van een host doden index. Deze methode is gebruikt voor het meten van de virulentie binnen planktonische en oppervlakte-ingeschrevenen Pseudomonas aeruginosa subpopulatie tijdens het beginstadium van biofilm vorming en kunnen worden aangepast aan andere bacteriën en andere stadia van biofilm groei. Dit protocol biedt een snelle en robuuste methode voor het meten van de virulentie en veel van de complexiteit die is gekoppeld aan de groei en het onderhoud van zoogdieren cellijnen vermijdt. Virulentie fenotypen hier gemeten met behulp van amoeben zijn ook gevalideerd met behulp van de muis macrofagen. Deze test werd met name gebruikt om die oppervlakte bijlage upregulates virulentie in P. aeruginosa.

Inleiding

Bacteriële infectie is een van de hoofdoorzaken van mortaliteit in mens en dier^1,2. De mogelijkheid voor het meten van de virulentie van bacteriën in culturen of biofilms is belangrijk in instellingen voor gezondheidszorg en onderzoek. Hier beschrijven we een veelzijdige, snelle en relatief eenvoudige methode om te kwantificeren van bacteriële virulentie. De eukaryotische organisme Dictyostelium discoideum (amoeba) wordt gebruikt als de modelorganisme voor de host. D. discoideum is gebruikt als een host virulentiefactoren in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)^3,4,5 en andere bacteriën^{6,7 te identificeren ,8} en is gevoelig voor grotendeels dezelfde Virulentiefactoren die de cellen van de zoogdieren doden, met inbegrip van type III secretie^9,10. Vorige virulentie testen met behulp van D. discoideum betrokken zijn langdurige blootstelling van bacteriën met D. discoideum cellen in de loop van uren^3,4,5. Het protocol, hier, presenteert een snelle methode voor het bepalen van de virulentie met behulp van deze amoeba. Dit protocol (Figuur 1) beschrijft hoe: (1) groeien de amoeben axenically (in de afwezigheid van bacteriën), (2) groeien bacteriën voor de assay, (3) bereiden bacteriën en cellen van de gastheer voor microscopie, (4) het uitvoeren van epifluorescence microscopie, en (5) analyseren amoeba fluorescentie.

Amoeben zijn aanvankelijk streaked uit uit bevroren voorraden en gegroeid op een gazon van Escherichia coli (E. coli), waar de amoeben produceren sporen. Deze sporen zijn geplukt en geënt in een verrijkte medium voor een groei. De amoeben worden onderhouden via een groei in voedselrijke omstandigheden totdat ze klaar om te worden gemengd met bacteriën voor de beoordeling van bacteriële virulentie. De overleving of de dood van de amoeben wordt gekwantificeerd door het meten van de fluorescentie van calceïne-acetoxymethyl (calceïne-AM), die door intracellulaire esterasen gekloofd en, daardoor, geactiveerd voor fluorescentie^11,12. Live amoeben vertonen weinig of geen fluorescentie overwegende dat benadrukt en stervende cellen fluoresceren intens. Dit resultaat is te wijten aan een weinig of geen opneming van calceïne-AM in gezonde amoeben en integratie en splijten van het substraat in gespannen amoeben¹³. Dit gedrag verschilt met name van calceïne-AM fluorescentie in zoogdiercellen^11,14,15,16.

Bacteriën die zullen worden beoordeeld op virulentie worden afzonderlijk gekweekt. Hier beschrijven we hoe te meten van de virulentie van de opportunistische pathogenen P. aeruginosa en hoe te kwantificeren van de virulentie van de planktonische (zwemmen) en oppervlakte-ingeschrevenen subpopulatie in detail te beschrijven. Dit protocol kan worden aangepast aan het testen van de virulentie van andere bacteriën. In de sectie vertegenwoordiger resultaten tonen we dat virulentie is geactiveerd in oppervlak vastgehechte cellen en laag in planktonische cellen is, die werd gemeld eerder¹³. Virulentie-geactiveerde oppervlak-ingeschrevenen P. aeruginosa doodt amoeben, terwijl niet-virulente planktonische cellen worden verbruikt door de amoeben. Als de virulentie van de planktonische bacteriën is uitsluitend wordt bepaald, kunnen de bacteriën gekweekt in gewone cultuur buizen in plaats van met behulp van petrischalen, zoals beschreven in het protocol.

De groei van amoeben en P. aeruginosa culturen moet worden gecoördineerd zodat P. aeruginosa culturen de beoogde groeifase bereiken, terwijl de amoeben in stabiele toestand in voedselrijke omstandigheden groeit. Deze voorwaarde vereist normaliter amoeben culturen moeten worden verdund ten minste 1 dag voorafgaand aan wanneer ze worden gemengd met bacteriën. Amoeben en bacteriën zijn geïmmobiliseerd met agar pads zijn mede bebroede gedurende 1 uur, en beeld met behulp van een lage resolutie (10 X, numerieke diafragma 0.3) objectieve, groene fluorescentie proteïne (GFP) filters en een imaging camera. Analyse kan worden uitgevoerd met behulp van vrij toegankelijke ImageJ software of software van de analyse van de afbeelding aangepast. Onze analyse werd uitgevoerd met behulp van onze eigen software geschreven met behulp van een wetenschappelijke analyse pakket¹³. De software moet een masker met behulp van de fase contrast-afbeelding maken en fluorescentie waarden extraheren op basis van de gemaskerde gebieden in de afbeelding van de fluorescentie. Fluorescentie waarden zijn gemiddeld ten minste 100 cellen, wat resulteert in een numerieke host doden index.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd aan de Universiteit van Californië, Irvine.

1. buffers en oplossingen

1. Voorbereiden lysogenie Bouillon (LB) in een fles 1 L door toevoeging van 25 g voor LB-Miller mix in 1 L tweemaal gedestilleerd water (ddH₂van O). Voeg een extra 20 g agar voor petrischalen. Autoclaaf te steriliseren. Giet 25 mL gesmolten agar-voedingsbodem in 10 cm-diameter petrischalen en laat stollen bij kamertemperatuur. Opslag vloeibare media bij kamertemperatuur en agar platen bij 4 ° C.
2. Bereid Glucose Gist-pepton (GYP) platen in een 1 L-fles door het mengen van D-glucose 1 g, 2 g pepton, 0,25 g gist extract, 4.2 gram KH₂PO₄, 5.1 g nb₂HPO₄7 H₂O en 25 gram agar in 1 L ddH₂ O. autoclaaf te steriliseren. Giet 25 mL gesmolten agar in 10 cm-diameter petrischalen en laat stollen bij kamertemperatuur. Bewaren bij 4 ° C.
3. Bereid pepton S (PS) medium in een 1 L-fles door het mengen van pepton 10 g, 7 g gist extract, 15 g van D-glucose, 0,12 g nb₂HPO₄7 H₂O 1.4 g van KH₂PO₄, 40 µg vitamine B₁₂ , en 80 µg foliumzuur in 800 mL ddH₂O. ijken een elektronische pH-meter met behulp van pH 4 en pH 7 normen, indien de pH-meter niet binnen een dag gebruikt is.
   1. Wordt de pH van het medium van de PS met behulp van de pH-meter. 5 M KOH of 5 M H₃PO₄ om Breng de pH op 6.5 toevoegen. Het uiteindelijke volume aan 1 L met behulp van ddH₂O. Filter steriliseren met behulp van 0,22 µm vacuüm filter en bewaren bij 4 ° C.
      Opmerking: Voorzichtig zijn met de pH-aanpassingen door het dragen van beschermende uitrusting, zoals handschoenen, beschermende kleding, oogbescherming en bescherming worden geconfronteerd.
4. Bereiden van 10 x ontwikkeling Buffer Prime (DB') buffer in een fles 1 L door toevoeging van 3,4 g van KH₂PO₄, 13.4 g nb₂HPO₄ 7 H₂O en ddH₂O aan een totaal volume van 800 mL. Ijken van een elektronische pH-meter met behulp van pH 4 en pH 7 normen, indien de pH-meter niet binnen een dag gebruikt is.
   1. Wordt de pH van de buffer met behulp van de elektronische pH-meter. Breng de pH op 6.5 door voorzichtig toe te voegen 5 M KOH of 5 M H₃PO₄ zo nodig. Het uiteindelijke volume aan 1 L met behulp van ddH₂O en steriliseren in autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Voorzichtig zijn met de pH-aanpassingen door het dragen van beschermende uitrusting, zoals handschoenen, beschermende kleding, oogbescherming en bescherming worden geconfronteerd.
5. 1 x ontwikkeling buffer (DB) maken door het mengen van 100 mL 10 x DB' buffer met 1 mL 2 M MgCl₂gesteriliseerd en 1 mL 1 M CaCl₂gesteriliseerd. Het definitieve volume aan 1 L in een 1 L-fles met een gesteriliseerde met autoclaaf gesteriliseerde ddH₂O. winkel bij kamertemperatuur.
6. Bereid PS:DB medium in een 1 L-fles door het mengen van 100 mL van gesteriliseerde PS medium, 100 mL gesteriliseerd 10 x DB' buffer en gesteriliseerde ddH₂O tot een totaal volume van 1 L. Supplement met 1 mL 2 M MgCl₂ gesteriliseerd en 1 mL gesteriliseerd 1 M CaCl ₂. bewaren bij 4 ° C.
7. Bereid de stockoplossing van calceïne-AM door 50 µL van DMSO toevoegen aan 50 µg voor calceïne-AM in de plastic container geleverd door de fabrikant. Winkel bij-20 ° C.

2. groei en het onderhoud van amoeben

1. E. coli stam B/r¹⁷ groeien als voedselbron voor amoeben tijdens de initiële groeiperiode. Streak E. coli B/r uit een bevroren voorraad opgeslagen bij-80 ° C op een bord van de agar LB en Incubeer bij 37 ° C's nachts te verkrijgen van enkele kolonies.
2. Inoculeer een één kolonie van E. coli B/r in 2 mL van LB medium en na een nacht bebroeden in de trommel van een roller of een shaker bij 37 ° C.
3. Breng de overnachting E. coli cultuur op de kamertemperatuur. Met behulp van een houten stok, beënten amoeben uit een bevroren voorraad gehouden bij-80 ° C in 750 µL van de overnachting cultuur.
   Opmerking: Gebruik D. discoideum stam AX3, die kan van een groei¹⁸. Deze stap is niet vereist voor een groei, maar opeenvolgende stappen zijn eis zullen hebben.
4. Voeg onmiddellijk 700 µL van het amoeben -E. coli mengsel op een bord van Glucose Gist-pepton (GYP). Verspreid de cultuur gelijkmatig op het oppervlak van de plaat door het kantelen van het heen-en-weer en side-to-side zo nodig. Vermijd het gebruik van een strooier.
5. Plaats de GYP plaat met agar naar boven in een doos die hoge luchtvochtigheid onderhoudt. Gebruik twee wegwerp plastic containers (183 cm x 183 cm x 91 cm) boven op elkaar gestapeld. Vul de onderkant container met ongeveer 25 mL water en plaats de bovenste container met verschillende 0.5 cm-diameter gaatjes geboord door de vloer van de container om vocht om de bovenste container van het waterreservoir naar.
6. Incubeer de GYP plaat en vak bij 22 ° C gedurende 4-5 dagen totdat amoeba sporen worden waargenomen groeien in de buurt van het oppervlak van de plaat (Figuur 2). Gebruik een gekoelde incubator om platen in plaats van incubatie bij kamertemperatuur incuberen.
   Opmerking: Nadat de sporen zijn gegroeid, zij levensvatbaar blijven op platen wekenlang wanneer opgeslagen bij 4 ° C. Bewaar de platen met agar zijde naar boven. Na 3-4 dagen incubatie, zones van clearing binnen het bacteriële gazon waarneembaar, waaruit blijkt dat het intreden van amoeba sporevorming.
   1. Acht kleine amoeben sporen boven het oppervlak van de plaat na 4-5 dagen incubatie (Figuur 2).
      Opmerking: Niet groeien de amoeben langer dan een week, zoals de kwaliteit van de sporen buiten deze periode afneemt.
7. Verzamelen amoeben sporen te bereiden voor de een groei van de amoeben door vegen een steriele 1 mL pipet tip parallel aan het oppervlak van de plaat. Sporen van de helft van een 10 cm petrischaal verzamelen.
   Opmerking: Raak de tip om het oppervlak van de agarplaat als deze ontwerpresolutie zal het verzamelen van grote aantallen van E. coli.
8. Resuspendeer de amoeben op het puntje van de Pipet van de tip onder te dompelen in 1 mL van PS medium en pipetteren zachtjes op en neer.
9. Breng het geënte mengsel in een kolf van 250 mL met 25 mL van het medium van de PS aangevuld met het antibioticum-antimycotic oplossing met 0,25 x concentratie.
   Opmerking: Bewaar de antibioticum-antimycotic oplossing als 250 µL aliquots bij-20 ° C. Vermijd herhaalde cycli van ontdooien en bevriezen van deze oplossing, aangezien dit kan invloed hebben op de werkzaamheid.
10. Groeien amoeben axenically bij 22 ° C in een roterende shaker op 100 rpm. Voor de virulentie assay in stap 5, cellen te groeien tot een extinctie gemeten op 600 nm (OD₆₀₀) van 0,2 tot 0,5.
    Opmerking: Deze stap vereist 3-4 dagen van de groei vanaf het moment van de inenting (stap 2.7). Als cellen zijn uitgegroeid tot een hogere dichtheid, Verdun de cultuur terug in PS middellange tot een OD₆₀₀ van 0,05 of lager en groeien terug naar een OD₆₀₀ van 0,2 tot 0,5.

3. de groei van P. aeruginosa

1. Kies een één kolonie van P. aeruginosa van een LB-plaat, het enten in een 2 mL PS:DB cultuur, en 's nachts groeien bij 37 ° C tot verzadiging.
   Opmerking: Niet het antibioticum-antimycotic oplossing toevoegt aan de PS:DB media.
2. Verdun de overnachting cultuur 1:100 of 1:1,000 in een 6 cm-diameter petrischaal met behulp van PS:DB. Als de virulentie van de planktonische cellen is uitsluitend wordt bepaald, groeien de culturen die met behulp van conventionele cultuur buizen plaats. Schud de cultuur op een benchtop rotator vastgesteld op 100 rpm bij 37 ° C.
3. De culturen van de oogst op specifieke tijdstippen om de reproduceerbaarheid. Bereiden op 30 min tot 1 h voorafgaand aan de beoordeling van de virulentie, een agar-pad, zoals beschreven in sectie 4.
   Opmerking: Virulentie in P. aeruginosa wordt geïnduceerd door ongeveer 8 h van groei op oppervlakken.
4. U kunt de oppervlak-vastgehechte cellen isoleren, verwijder de vloeistof uit de petrischaal onmiddellijk wassen met 1 mL van de buffer van de DB aan planktonische cellen verwijderen en ga onmiddellijk naar stap 5.1.
   Let op: Was niet langer dan 30 s als dit zal erover en oppervlak vastgehechte cellen los en kan van invloed zijn op de meting van de virulentie.
5. Om te isoleren planktonische cellen, 10 µL van de cultuur van de petrischaal overbrengen in een schone petrischaal en ga onmiddellijk naar stap 5.1.

4. microscopie - voorbereiding van de Agar-Pad

1. Agar pads ongeveer 30 minuten tot 1 uur voor te bereiden voordat amoeben zijn klaar om te worden gemengd met P. aeruginosa.
2. Magnetron 50 mL 1% (m/v) agar in DB buffer in een maatkolf van 250 mL. Mix elke 20 s tot bosjes agar verdwijnen.
3. Koel de gesmolten agar door deze te plaatsen in het waterbad voorverwarmde 55 ° C gedurende 15 minuten.
4. Voeg toe 15 µL van de stockoplossing van calceïne-AM aan 15 mL gesmolten agar in een conische buis. Meng door zachtjes het omkeren van de buis 4 - 5 keer en ga onmiddellijk naar de volgende stap.
   Opmerking: Deze stap uitvoeren in een centrifugebuis polypropyleen 15 mL. Gebruik een dik glas container niet omdat dit leiden de agar tot zal te stollen te snel.
5. Giet de gesmolten agar mengsel bovenop een glasplaat 12 x 10 cm en laat de agar te stollen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Snijdt de gestolde agar pad in kleinere 1.5 x 1.5 cm delen door het plaatsen van de glasplaat over een afgedrukte raster en snijden langs het raster met behulp van een metalen liniaal.
6. Houd de gel gehydrateerd in een vochtige vak totdat het is klaar voor gebruik.

5. microscopie - bereiding van het monster van de bacteriën-amoeba voor Imaging

1. Om te assay de virulentie van oppervlak vastgehechte bacteriële cellen, 10 µL van amoeba cellen uit toevoegen stap 2.10 aan oppervlak-ingeschrevenen bacteriën uit stap 3.4.
   Opmerking: Deze stap wordt het mengen van amoeben met bacteriën.
2. Om te assay de virulentie van de planktonische cellen, meng 10 µL van amoeba cellen uit stap 2.10 met 10 µL van planktonische bacteriën uit stap 3.5.
   Opmerking: Voor het mengen met de bacteriën niet de amoeba axenically gekweekte cellen (bij een OD₆₀₀ van 0,2 tot 0,5) wassen. Geen groei van E. coli zal worden waargenomen in de amoeba cultuur als gevolg van het gebruik van de antibiotica-antimycotic oplossing.
3. Plaats de 1.5 x 1.5 cm calceïne-AM agar pad uit stap 4,5 op de top van de mengeling van de bacteriën-amoeba onmiddellijk op het oppervlak van de petrischaal.
   Opmerking: Plaats de agar pad bovenop het mengsel met behulp van een snelle vloeiende beweging. Het stootkussen langzaam op het mengsel niet lager als deze motie de neiging om de cellen te duwen naar de periferie en weg van de onderkant van het pad. Deze stap zal ervoor zorgen dat bacteriën en amoeben gelijkmatig gemengd, geïmmobiliseerd en dat beide typen cel zijn beperkt tot hetzelfde vlak.
4. Verwijder overtollige vocht door zachtjes pipetteren uit eventuele resterende vloeistof rondom de agar-pad. Laat de petrischaal gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur drogen.
5. Bedek met de petrischaal met een deksel en Incubeer het mengsel geïmmobiliseerdet amoeba-bacteriën bij kamertemperatuur voor een extra 40 min. doorgaan naar stap 6.1.
   Opmerking: Het is belangrijk dat alle monsters voor de zelfde hoeveelheid tijd, aangezien de achtergrond fluorescentie stijgt na verloop van tijd uit te broeden. Een incubatietijd van 1 uur wordt aanbevolen. Incubations voor meer dan 1 h zijn minder reproduceerbare als amoeben cellen beginnen kunnen te barsten.

6. microscopie - Beeldacquisitie

1. Afbeelding amoeben met behulp van een fluorescentie Microscoop staat helderveld en groen fluorescentie afbeeldingen ophalen. Voor groene fluorescentie, groene fluorescentie proteïne (GFP) filters gebruiken met 474/27 nm en 525/45 nm voor excitatie en emissie, respectievelijk. Gebruik een 10 X (≥0.3 numerieke diafragma) doelstelling om het imago van de amoeben.
   Opmerking: De calceïne-AM in de agar zal veroorzaken stervende amoeben aan fluorescentie in het groene fluorescentie-kanaal. Gezonde amoeben zijn anders niet tl.
2. Overname tijden voor de fase contrast, GFP kanalen beperken fototoxiciteit en optimaliseren van het dynamisch bereik van de intensiteit van de afbeelding aanpassen. De differentiële interferentie contrast (DIC) fase contrast vervangen indien nodig.
   Opmerking: Gebruik 100-200 ms posities voor fase contrast en GFP fluorescentie indien mogelijk. Houd de instellingen van het instrument en blootstelling ongewijzigd gedurende het gehele experiment. Dit is essentieel voor het berekenen van de host doden index.
3. Afbeeldingen voor ten minste 100 amoeba cellen verwerven om goede statistieken voor het berekenen van de host doden index.

7. het beeld van analyse en Host doden Index

1. Uitvoeren met behulp van ImageJ beeldanalyse.
2. De fase contrast-afbeeldingsbestand in ImageJ openen door te klikken op bestand | Open en selecteren van de afbeelding. De drempel aanpassen door te klikken op de afbeelding | Analyse | Drempel. Aanpassen van de onderste en bovenste drempel Schakel alleen de piek van de intensiteit (Figuur 3A).
3. De afbeelding converteren naar een binair getal door te klikken op proces | Binaire | Maken van binaire. Vul gaten door het selecteren van proces | Binaire | Vul gaten.
   Opmerking: Het gebruik van de afbeelding in Figuur 1 als bron, zal stappen 7.1-7.2 produceren een afbeelding waarin de amoeben en oppervlakte-ingeschrevenen bacteriën worden weergegeven als donkere gebieden (Figuur 3B).
4. Zorgen dat de ruimte en het gemiddelde grijze waarde selectievakjes zijn ingeschakeld in analyseren | Instellen van metingen. De geschatte grootte van de amoeben meten door het selecteren van het gereedschap Ovaal op de hoofdwerkbalk. Klik analyseren | Maatregel en merk op het gebied van representatieve amoeben.
5. Maskers voor de amoeben maken door te klikken op analyseren | Analyseren van deeltjes. Geef het gebied dat zal omvatten de amoeben maar uitsluiten van de bacteriën in het vak grootte. Selecteer maskers in het dropdown menu voor de optie weergeven. Ervoor zorgen dat het selectievakje toevoegen aan Manager is ingeschakeld.
6. Klik op OK en een afbeelding toont alleen de amoeben en een ROI-Manager dialoogvenster verschijnt (Figuur 3C).
7. Open de afbeelding van de fluorescentie met behulp van bestand | Open en selecteer het juiste bestand. Selecteer alle regio's in de ROI Manager door de Shift-toets ingedrukt te houden en te klikken op elk gebied in de lijst (Figuur 3D).
8. Klik op de knop van de maatregel in de Manager van de ROI. Dit opent een resultatenvenster met de intensiteitswaarde van de gemiddelde voor elke amoeba.
9. De fluorescentie-waarden voor elke amoeba kopiëren naar een spreadsheetprogramma en de host index doden door het nemen van het gemiddelde van alle waarden van de fluorescentie te berekenen.

Resultaten

Wij groeide wild-type P. aeruginosa stam PA14¹⁹ of een ΔlasR stam²⁰ op de dezelfde PA14 achtergrond in 6 cm-diameter petrischalen en vehiculumcontrolegroep de virulentie van de planktonische en oppervlakte-ingeschrevenen cellen. Culturen waren geënt uit single-koloniën in PS:DB culturen, 's nachts uitgegroeid in cultuur buizen in de trommel van een roller bij 37 ° C tot verzadiging, 1:100 in PS:DB, geteeld voor 8u in 6 cm-d...

Discussie

Dit protocol wordt een snelle en kwantitatieve methode assay virulentie in P. aeruginosabeschreven. Dit protocol kan worden getest met andere bacteriën. Het is echter belangrijk om te houden in het achterhoofd dat het groeimedium verenigbaar met de voorwaarden van de groei amoeba zijn moet. In het bijzonder, hebben wij het protocol gebruikt PS:DB als de bacteriële groeimedium geoptimaliseerd. Als andere media worden gebruikt, is het mogelijk dat het noodzakelijk is voor het uitvoeren van een groei-dit is een all...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
Bacto agar, gedehydrateerd	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL en bewaar bij -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	Voor filter sterilisatie
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyreen platen
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyreen platen
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Vierkante 3-kopjes containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	Voor het bereiden van agar pads. Andere glazen platen kunnen worden gebruikt met vergelijkbare afmetingen.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscoop setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscoop setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscoop setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscoop setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscoop setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software voor beeldanalyse
MATLAB	Mathworks	R2013	Software voor beeldanalyse
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	Voor groei van bacteriën bij 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	Voor groei van amoeben bij 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	Voor groei van amoeben bij 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	Voor koeling media tot 55 °C