In vivo microdialysis heeft ingeschakeld collectie van moleculen aanwezig in de interstitiële vloeistof van de hersenen (ISF) van wakker, vrij-gedragen dieren. Om te analyseren relatief grote moleculen in ISF, het huidige artikel richt zich specifiek op het microdialysis protocol sondes met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vivo Microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht Cut-off Probes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In vivo microdialysis is een krachtige techniek voor het verzamelen van ISF van wakker, vrij-gedragen dieren gebaseerd op het beginsel van een dialyse. Terwijl microdialysis een gevestigde methode die relatief kleine molecules, zoals aminozuren of neurotransmitters maatregelen is, is het onlangs gebruikt om te beoordelen ook dynamica van grotere moleculen in ISF sondes met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen. Op het gebruik van dergelijke sondes, moet microdialysis worden uitgevoerd in een push-pull-modus om te voorkomen dat druk opgebouwd binnenkant van de sondes. Dit artikel bevat stapsgewijze protocollen zoals stereotaxic chirurgie en microdialysis lijnen instellen voor het verzamelen van eiwitten van ISF. Tijdens microdialysis, kunnen drugs worden toegediend hetzij systemisch, hetzij door directe infusie in ISF. Omgekeerde microdialysis is een techniek om direct inblazen ISF verbindingen. Integratie van drugs in de microdialysis perfusie buffer hen in staat stelt om te verspreiden in ISF via de sondes terwijl gelijktijdig het verzamelen van ISF. Door het meten van tau-eiwit als voorbeeld, toont de auteur aan hoe haar niveau op stimulerende Neuronale activiteit worden gewijzigd door omgekeerde microdialysis van picrotoxin. Voordelen en beperkingen van microdialysis worden beschreven samen met de uitgebreide toepassing door het combineren van andere methoden in vivo .
Inleiding
ISF bestaat uit 15-20% van de totale hersenvolume en biedt een communicatie cruciaal voor signaaltransductie, substraat vervoer en afval goedkeuring1. Daarom zullen de mogelijkheid van het ISF verzamelen van levende dieren verlenen meer gevolgen voor verschillende biologische processen, alsmede ziekte mechanisme. In vivo microdialysis is een van de enkele methoden die steekproef en kwantificeren van extracellulaire moleculen van ISF van wakker, vrij bewegende dieren en daardoor fungeert als een nuttig hulpmiddel in neurowetenschap onderzoek veld2,3. Bij deze methode, microdialysis sondes met semipermeable membranen zijn ingevoegd in de hersenen en geperfundeerd met perfusie buffer op de relatief trage stroomsnelheid (0.1-5 µL/min). Tijdens deze perfusie, extracellulaire moleculen in ISF passief diffuse in de sonde volgens het verloop van de concentratie en verzamelen als een dialysate. Hoewel dit artikel richt zich op de methode om te monster ISF in de hersenen, kunnen zowel het beginsel als de methode worden toegepast op andere organen door de juiste wijziging indien nodig.
Microdialysis werkte eerst in de vroege jaren 1960, en sinds dan het uitgebreid gebruikt is voor het verzamelen van kleine molecules, zoals aminozuren of neurotransmitters in de hersenen. Echter, recente commerciële beschikbaarheid van microdialysis sondes met hoog-moleculair gewicht afgesneden membranen (100 kDa-3 MDa) heeft uitgebreid de toepassing ervan op relatief grotere proteïnen in ISF evenals4,5,6 ,7. De studies met behulp van deze sondes heeft geleid tot de bevinding dat eiwitten zoals tau of α-synuclein die werden lang beschouwd als exclusieve cytoplasmatische zijn ook fysiologisch aanwezig in ISF4,5,8.
Een van de problemen microdialysis sondes met grote afgesneden membranen (meestal meer dan 1.000 kDa) is dat ze gevoeliger voor ultrafiltratie vocht verlies als gevolg van de innerlijke druk opgebouwd in de sondes. Microdialysis sondes gebruikt hier hebben een unieke structuur om te voorkomen dat dit probleem. De druk zal niet worden opgebouwd als gevolg van deze structuur, dus microdialysis met deze sondes moet worden beheerd in een modus van de "push-pull" een spuitpomp met perfuse de sondes (= druk) en een roller/peristaltische pomp voor het verzamelen van de dialysate komen uit het stopcontact sonde (= Trek) 9 (hoewel het zowel push- en pull-pompen, als gevolg van druk annuleren luchtgaten aanwezig in de sondes, moet het systeem is technisch alleen aangestuurd door de pull-pomp). Dit artikel begint met de stereotaxic operatie een gids canule innesteling en wordt beschreven hoe u microdialysis regels instellen om te verzamelen van ISF via microdialysis sondes met 1.000 kDa cut-off membranen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke studies werden herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Graduate School of Medicine aan de Universiteit van Tokio.
1. pre-operatieve ingreep
- Voordat u begint chirurgie, veeg alles met 70% ethanol steriele voorwaarden te handhaven. Thermische ondersteuning met behulp van een verwarming pad wordt aanbevolen.
- Anesthetize de muizen door intraperitoneale injectie van Chloraalhydraat (400 mg/kg). Afstomping bevestigen door het uitvoeren van een teen snuifje. Gebruik van meloxicam SR op inductie en buprenorfine inning bod gedurende ten minste 24 uur wordt aanbevolen.
- Het scheren van het haar met een chirurgische clipper. Een muis in de muis en neonatale rat adapter met oor bars en een neus klem vast te stellen.
Opmerking: Het is essentieel om ervoor te zorgen dat muis hoofd is beveiligd in dit stadium en side-by-side niet wordt verplaatst. - Dierenarts zalf toepassen op ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
2. stereotaxic chirurgie voor gids canule implantatie
- Stel de muis en neonatale rat adapter op het stereotaxic apparaat. Maak een incisie sagittally op de huid over de schedel met behulp van een scalpel. Veeg van bloed en het bindweefsel op de schedel met behulp van een vochtig wattenstaafje.
- Het bepalen van de coördinaat voor hersenen regio van belang met behulp van de atlas van de hersenen. Voordat u begint metingen, zorg ervoor dat middellijn rechte zodat de boor kan worden verplaatst van A-P en blijven op de middellijn Sutuur (geologie) de hele tijd.
Opmerking: Dit artikel maakt gebruik van de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,5 mm, D/V:-1,2 mm, 12 graden) te richten posterieure hippocampus. - Niveau schedel A-P
- Bevestig een boor op een manipulator van stereotaxic frame. Verlaag de boor totdat het zachtjes lambda aanraakt en de ventrale coördinaat opnemen. Herhaal deze procedure voor bregma.
Opmerking: Wanneer de schedel wordt herverdeeld, is de verticale afmeting van bregma is gelijk aan die van lambda. Zo niet, de hoogte van de neus klem dienovereenkomstig aanpassen. Nadat de schedel wordt herverdeeld, registreren de anterior/posterior, laterale coördinaat van bregma.
- Bevestig een boor op een manipulator van stereotaxic frame. Verlaag de boor totdat het zachtjes lambda aanraakt en de ventrale coördinaat opnemen. Herhaal deze procedure voor bregma.
- Niveau schedel links-rechts
- Verplaatsen van de boor van de bregma naar de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L: +2.0 mm), lagere de boor op de schedel en de verticale coördinaat opnemen. Herhaal deze procedure voor de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,0 mm).
Opmerking: Als de schedel wordt herverdeeld, is deze verticale metingen van twee equidistante punten vanaf de middellijn zijn gelijk. Als dat niet het geval is, het aanpassen van de hoogte van de balken van het oor.
- Verplaatsen van de boor van de bregma naar de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L: +2.0 mm), lagere de boor op de schedel en de verticale coördinaat opnemen. Herhaal deze procedure voor de coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,0 mm).
- Boor een burr gat zorgvuldig op de doelgroep coördinaat (A / P:-3.1 mm, M/L:-2,5 mm) om het implantaat een canule gids. Als de diameter van een burr gat niet groot genoeg voor een gids canule implantatie is, boor een gat dat wordt overlapt door het ene. Boor een gat aan het bot van de pariëtale recht (contralaterale zijde) en voeg een botschroef, die helpt bij het beveiligen van tandheelkundige cement in 1.10 (Zie figuur 1B).
- Een circulaire vergrendeling stuk uit de achterzijde van het deksel van een centrifugebuis 1,5 mL gesneden met een scheermesje en maak een '' kroon ''. Deze kroon wordt gebruikt om te voorkomen dat tandheelkundige cement verspreiden naar de huid. Plaats deze op de schedel, zodat de burr gaten gemaakt in stap 2.5 binnen de cirkel (Zie Figuur 1 blijven).
- Een stereotaxic vergadering instellen door een gids canule op de korte arm van een stereotaxic adapter en zet vast met behulp van een GLB moer. De lange arm van de stereotaxic adapter ingesteld op de elektrode klem. Sluit het op de manipulator van het stereotaxic apparaat (Zie figuur 1A).
- Draai de D-V stereotax vergadering op de manipulator arm door 12 graden (Zie figuur 1B). Verplaats de canule gids naar het burr gat gemaakt in 1.6. Plaats de canule gids langzaam in de hersenen door het verlagen van het door 1.2 mm.
Opmerking: De hoek van de sonde is specifiek voor de hippocampus; andere regio's kunnen vereisen andere hoeken of geen hoek helemaal. Raadpleeg een atlas van de hersenen voor precieze coördinaten. Droog het oppervlak van de schedel, want als niet de cement niet vasthouden zal en cement GLB kan worden verdreven - Voeg de tandheelkundige cement binnen de kroon aan zowel het metalen deel van de canule gids en de botschroef genoeg om hen volledig te dekken. Gelden aanvullende tandheelkundige cement als er een deel van de schedel blootgesteld.
- Wachten tot tandheelkundige cement wordt volledig gedroogd (~ 12-20 min). Verwijder de stereotaxic adapter van de elektrode klem. Verwijderen van de GLB-moer en de stereotaxic adapter met een dummy sonde vervangen en vastmaken van de GLB-moer.
- Laat de muisknop los uit het stereotaxic apparaat en huis van de muis alleen in een individuele kooi.
Opmerking: De muis mag niet worden overgelaten zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Controleren de muis dagelijks tot de dag van microdialysis. De muis ontvangt NSAID's zoals carprofen als het lijkt te zijn in pijn. 2 weken wachten is noodzakelijk voor slaap-waak onderzoek, zodat de muis habituates aan de nieuwe milieu-10, maar andere soorten studies kortere perioden van herstel (bijvoorbeeld 1-2 dagen vereisen kunnen).
3. Microdialysis Setup
- Kwaliteitscontrole van sondes: Vul een wegwerp 1ml spuit met gedestilleerd waterand aansluiten op de uitlaat (kortere poort) van een sonde die met behulp van een byton buis. Bedek de luchtgaten met de vingers en druk de plunjer van de injectiespuit zachtjes om de infusie van water aan de sonde. Controleer of water uit de inlaat van de sonde blijkt en er geen lekkage op het oppervlak van een microdialysis-membraan is.
- Activering van sondes: dompelen de membranen van een sonde in ethanol (70-100%) gedurende twee seconden. Vervolgens inblazen gedestilleerd water de sonde opnieuw met een spuit weer.
- Voorbereiding van perfusie buffer: toevoegen om te voorkomen dat de hechting van doel moleculen naar de tubings, BSA door verdunning van de oplossing van de BSA van 30% naar 4% met kunstmatige CSF (1.3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 , 122 mM NaCl, pH 7,35 =), die overeenkomt met elektrolyt concentratie in het CSF, onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken. De buffer van de perfusie door middel van een spuit filter eenheid met 0.1 µm poriegrootte filteren.
Opmerking: 4% BSA verbetert herstel voor steken eiwitten maar levering van stoffen, met name voor verbindingen die hoge BSA-bindende ernstig kan beperken. Dit is een voordeel van het gebruik van lagere concentratie van BSA (bijvoorbeeld 0,15%) in bepaalde gevallen3. Merk op dat BSA kan statistische heel gemakkelijk-wanneer geschud door vortex of roer plaat. Deze aggregaten kunnen sondes of membraan poriën verstoppen. Ga voorzichtig te werk bij het opstellen van een oplossing van de BSA te beperken deze aggregatie - Twee afzonderlijke regels voorbereiden met inlaat en uitlaat (Zie Figuur 1 c) en beide lijnen sluit met een naald van de verbinding. Vul een wegwerp 3 mL spuit gevuld met perfusie buffer en verbinding te maken met het einde van de inlaat van de buis met behulp van een naald blunt-einde. Vul de hele slang met perfusie buffer door de spuitpomp uit te voeren.
- Stoppen met de spuitpomp en de naald van de verbinding tussen lijn van de inlaat en uitlaat lijn vervangen door een sonde van de geactiveerde microdialysis uit stap 3.3 (Zie Figuur 1 c). Voordat deze vervanging, door de GLB-moer te zetten door de sonde.
- Monteer de roller buis in de uitlaat slang op de roller pomp. Start de spuitpomp op 10 µL/min en vervolgens de roller pomp aan de iets langzamere stroomtarief (9.5-9,8 µL/min). Zorg ervoor dat alle luchtbellen in de hele buis, die invloed op het herstel hebben kan bij het invoeren van de sonde te verwijderen.
- Anesthetize de muis vanaf stap 1.12 op dezelfde manier als in stap 1.2. Zet de muis kraag om haar nek. Verwijder de moer van het GLB en de dummy sonde langzaam een microdialysis-sonde uit 3.4 via de canule gids invoegen en vastmaken van de GLB-moer.
- Plaats de muis in de kooi aangesloten op een gratis voortbewegende systeem en ketting de muis met de kraag. Houden lopend-spuitpomp én roller pomp aan de aangegeven stroomtarief in stap 3.5 voor ten minste 1 uur.
Opmerking: Om te bereiken ISF collectie van wakker dieren, dit artikel maakt gebruik van een gratis voortbewegende systeem, waar de kooi zelf reageert op het dier beweging om te voorkomen dat tubings draaien. U kunt ook de vloeibare wartels verkrijgbaar bij diverse bedrijven kunnen ook worden gebruikt. - Stop de roller pomp eerst en vervolgens de spuitpomp. Stel de gewenste debiet. Voer de spuit pomp 20% sneller dan de roller pomp.
Opmerking: bijvoorbeeld, als u op 1 µL/min uitvoeren, werken de spuitpomp op 1.2 µL/min. optimale debiet empirisch moet worden bepaald voor elke molecuul. - Verzamelen van ISF monsters: plaats het vrije uiteinde van de uitlaat slang op de gekoelde breuk verzamelaar.
Opmerking: Passende monstervolume varieert afhankelijk van testen gebruikt voor analyse. - Verwijder na de voltooiing van het experiment, de sonde. (Anesthetize de muis desgewenst.) Omgaan met muis herstel de dezelfde manier als in stap 2.11. Het analyseren van de verzamelde ISF door methoden zoals HPLC of ELISA.
- Om te wassen de hele buis na microdialysis, sluit inlaat en uitlaat tubings opnieuw door het vervangen van de sonde met de verbinding naald en het verdunde bleekwater in de hele buis uitgevoerd en vervolgens met water spoelen. Droog en bewaar het voor herhaald gebruik.
Opmerking: Andere soorten tubings zijn aanvaardbaar, maar BSA in perfusie buffer kan verstoppen de tubings met kleine diameter, dus deze tubings worden beschouwd als eenmalig gebruik. De slangen kunnen worden versleten of verstopt na meerdere toepassingen, dus zorg ervoor dat het debiet telkens vóór gebruik strookt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te stimuleren of remmen Neuronale activiteit in omgekeerde microdialysis11,12,13, picrotoxin, GABAA receptor antagonist of tetrodotoxine, nb+ kanaal blocker zijn gebruikt. Het is aangetoond dat tau release wordt gestimuleerd door toename van neuronale activiteit13,14. Overeenstemming met dit eerdere opmerkingen, w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Microdialysis met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen moet worden bediend door een push-pull-modus, dus is het essentieel dat het debiet nauwkeurig en constant is. De onnauwkeurigheid in de stroomsnelheid kunnen de oorzaak van air bubble generatie en inconsistentie in de concentratie van het monster. Als de stroom niet consistent is, controleert u alle verbindingen op lekkage. Als het probleem nog steeds aanhoudt, is het mogelijk dat het nodig om opnieuw te beginnen met nieuwe sondes en tubings.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur heeft niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door '' Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (hersenen eiwitten veroudering en dementie Control)(15H01552) van MEXT en Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (B) (16K 20969). De auteur dankt Dr. David M. Holtzman en Dr. John R. Cirrito voor de technische adviezen tijdens de ontwikkeling van deze methode.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Gekoelde fractiecollector |
| Spuitpomp | KD scientific | KDS-101 | |
| Rollerpomp | Eicom microdialyse | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone Systeem | BASi | MD-1409 | Vrij bewegend systeem |
| Dual species kooikit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialyse sonde (schachtlengte 8 mm, membraanlengte 2 mm) | Eicom microdialyse | PEP-8-02 | Schachtlengte voor een sonde, een gids, een dummy sonde en een stereotaxische adapter moeten identiek zijn. |
| Microdialyse gids (schachtlengte 8 mm) | Eicom microdialyse | PEG-8 | |
| Microdialyse dummy sonde (schachtlengte 8 mm) | Eicom microdialyse | PED-8 | |
| Botschroef | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Tandheelkundig cement | |
| Stereotaxisch instrument voor kleine dieren met digitale weergaveconsole | Kopf | Model 940 | Stereotaxisch apparaat |
| Muis en neonatale rat adapter | Stoelting | 51625 | |
| Standaard oorstaven en rubberen tips voor muis stereotaxie | Stoelting | 51648 | |
| Albumine oplossing uit runder serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA oplossing |
| FEP slang (70 cm) | Eicom microdialyse | JF-10-70 | Intern volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon slang (50 cm) | Eicom microdialyse | JT-10-50 | Intern volume = 0.08 µL/cm |
| Byton buis | Eicom microdialyse | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adapter 23G | BD | 427565 | Blunt end naald |
| Rollerslang | Eicom microdialyse | RT-5S | Intern volume = 4 µL |
| Kappenmoer | Eicom microdialyse | AC-5 | |
| 0,25 mL microcentrifugebuis met dop | QSP | 503-Q | Buizen voor fractiecollector |
| Stereotaxische adapter (schachtlengte 8 mm) | Eicom microdialyse | PESG-8 | |
| Verbindingsnaald | Eicom microdialyse | RTJ | |
| Muis collier | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Boor |
| Picrotoxine | Sigma | P1675 | |
| Schroevendraaier voor botschroeven | |||
| Schaar | |||
| Wattenstaafje | |||
| Chirurgische knip |
Referenties
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
