Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Summary

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Abstract

Micro-RNAs (miRNAs) zijn single-stranded RNA afschriften die binden aan messenger RNAs (mRNAs) en hun vertaling remmen of bevorderen van hun afbraak. Tot op heden zijn miRNAs betrokken bij een groot aantal biologische en ziekte processen, die de behoefte aan betrouwbare detectiemethoden van miRNA afschriften heeft aangegeven. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor heksenkruid-label (DIG) vergrendeld Nucleic Acid (LNA) sonde gebaseerde miRNA detectie, gecombineerd met eiwit immunokleuring op muis hart secties. Voor het eerst, we een in situ hybridisatie techniek met behulp van de sonde te identificeren van miRNA-182 expressie in hart secties van controle en hypertrofie van het hart muizen uitgevoerd. Vervolgens hebben we uitgevoerd immunokleuring voor cardiale troponine T (cTnT) eiwit, op dezelfde baanvakken, mede lokaliseren miRNA-182 met de cardiomyocyte cellen. Met behulp van dit protocol, waren wij kundig voor speurder miRNA-182 via een alkalische fosfatase gebaseerd colorimetrische bepaling, en cTnT door middel van fluorescerende vlekken. Dit protocol kan worden gebruikt om de uitdrukking van een miRNA van belang door DIG-geëtiketteerden LNA sondes, en relevante eiwit expressie op muis hart weefselsecties te detecteren.

Introduction

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte (18-25 nucleotiden), single-stranded, noncoding RNAs die als negatieve regelgevers van genexpressie op post-transcriptional niveau functioneren door remming van de boodschapper-RNA (mRNA) vertaling en/of bevordering van de aantasting van het mRNA ¹. miRNAs zijn transcriptie van introns of exons van codering of noncoding genen en zijn in de nucleus door DROSHA, aan de voorloper van miRNAs (pre-miRNAs), die korte stam-lus structuren van 70 nucleotiden²gekloofd. Na cytoplasmatische exporteren, pre-miRNAs zijn verder verwerkt door DICER tot volwassen miRNAs die zich uitstrekken van 18-25 nucleo....

Protocol

Muis hart weefselmonsters voor deze studie werden verkregen met inachtneming van de relevante wetten en institutionele richtsnoeren en door Yale University institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd.

1. oplossing voorbereiding

1. RNase gratis ddH₂O voor te bereiden, door de behandeling van 5 L van ddH₂O met 5 mL 0,1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 's nachts (O/N), bij kamertemperatuur (RT). Autoclaaf (121 ° C) om te schakelen van de DEPC. Gebruik DEPC-behandelde ddH₂O voor de bereiding van downstream oplossingen als aangegeven.
   Let op: DEPC is een bekend carcinogeen, alleen behandel....

Results

miRNA in situ hybridisatie is geoptimaliseerd op muis hart secties met een scramble miRNA en U6-snRNA, die als negatieve en positieve controles respectievelijk diende. Positieve kleuring wordt aangegeven in het blauw, terwijl de negatieve kleuring wordt aangegeven door het gebrek aan ontwikkeling van de kleur (figuur 1A-1B). De specifieke expressie cardiomyocyte van miRNA-182 evalueerden in hart secties van controle- en PlGF overexpr.......

Discussion

miRNA transcript detectie kan worden bereikt door middel van verschillende technieken die in de gevoeligheid, specificiteit en kwantitatieve macht verschillen. Hier tonen we de koppeling van miRNA in situ hybridisatie met immunokleuring en beschrijven een protocol waarmee voor gelijktijdige beoordeling van de niveaus van de expressie van miRNA en eiwit moleculen, op de dezelfde baanvakken van het hart. Eerst laten we zien hoe u kunt uitvoeren in situ hybridisatie aan DIG-geëtiketteerden LNA miRNA sondes.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethylpyrocarbonate	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417	PBS
Tween-20	American Bioanalytical	AB02038	non-ionisch oppervlakte-actief
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Sigma Aldrich	3115879001	ProK
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	PFA
Sodium Chloride	ThermoFisher	S271	NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-Methylimidazole	Sigma Aldrich	336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	39391	EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
Trisodium citrate dihydrate	Sigma Aldrich	S1804	Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe	QIagen	YD00615701	5'-DIG en 3'-DIG gelabeld
Levamisol hydrochloride	Sigma Aldrich	31742
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP Tablets	Sigma Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
Potassium Chloride	ThermoFisher	P217	KCl
DAPI solution (1mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
Glass coverslip	ThermoFisher	12-545E	Glasuurlaagblokje
Plastic coverslip	Grace Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0.25mm	RNA-ase vrij plastic uurlaagblokje
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Sigma Aldrich	11093274910	DIG antilichaam
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000	Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody	Abcam	ab92546	cTnT antilichaam
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	anti-konijn-568 antilichaam
Dako Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023	montagemedium
Sheep serum	Sigma Aldrich	S3772
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Deionized Formamide	American Bioanalytical	AB00600
Hybridization Oven	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer