Methodenartikel

Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel

8.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57952

⸱

19 januari 2019

 ,  ,  , 
1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Acute inbeslagneming modellen zijn belangrijk voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epileptiform gebeurtenissen. Bovendien biedt de mogelijkheid om het genereren van epileptiform evenementen op afroep een zeer efficiënte methode om te bestuderen van de exacte volgorde van de gebeurtenissen ten grondslag liggen aan hun inleiding. Hier beschrijven we de acute 4-aminopyridine corticale inbeslagneming modellen gevestigd in muis en menselijk weefsel.

Samenvatting

Controle van de vangsten, blijft een uitdagende kwestie voor de medische gemeenschap. Onderzoekers moeten om vorderingen te maken, een manier om uitvoerig bestuderen van inbeslagneming dynamiek en onderzoeken van de onderliggende mechanismen. Acute inbeslagneming modellen zijn handig, bieden de mogelijkheid voor het uitvoeren van elektrofysiologische opnames, en een grote hoeveelheid electrographic inbeslagneming-achtige (Ictale) gebeurtenissen kunnen genereren. De veelbelovende resultaten van acute inbeslagneming modellen kunnen vervolgens aan chronische epilepsie modellen en klinische proeven worden vooruitgegaan. Dus, bestuderen van de vangsten in acute modellen die getrouw het repliceren van de electrographic en dynamische handtekeningen van een klinische inbeslagneming is essentieel voor het maken van klinisch relevante bevindingen. Bestuderen van Ictale gebeurtenissen in acute inbeslagneming modellen bereid uit menselijk weefsel is ook belangrijk voor het maken van de bevindingen die klinisch relevant zijn. De belangrijkste focus in dit document is op de corticale 4-AP model vanwege zijn veelzijdigheid in Ictale gebeurtenissen genereert in zowel in vivo en in vitro studies, evenals in zowel muis en menselijk weefsel. De methoden in dit artikel zal ook beschrijven een alternatieve methode van inbeslagneming inductie met behulp van de nul-Mg2 + model en bieden een gedetailleerd overzicht van de voordelen en beperkingen van de activiteit van de epileptiform-achtige gegenereerd in de verschillende acute inbeslagneming modellen. Bovendien, door te profiteren van verkrijgbare optogenetic muis stammen, een lichte puls van korte (30 ms) kan worden gebruikt om een identiek zijn aan die welke voorkomen spontaan Ictale gebeurtenis te activeren. 30-100 ms soezen van neurotransmitters (Gamma-Amino Boterzuur of glutamaat) kunnen ook worden toegepast op het menselijke weefsel trigger Ictale gebeurtenissen die identiek zijn aan die welke voorkomen spontaan. De mogelijkheid om te activeren Ictale gebeurtenissen op afroep in acute inbeslagneming modellen biedt de pas ontdekte mogelijkheid om te observeren de exacte volgorde van de gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de inbeslagneming initiatie dynamiek en efficiënt het evalueren van potentiële anti-epilepsie therapieën.

Inleiding

Acute inbeslagneming modellen kunnen met succes reproduceren electrographic handtekeningen die doet denken aan Ictale gebeurtenissen waargenomen in het electroencephalogram (EEG) van individuen een beslaglegging te ervaren. Onderzoekers gebruiken deze Ictale-achtige gebeurtenissen (hierna te noemen 'Ictale events') als surrogaten voor de inbeslagneming gebeurtenis1. Klinisch, dienen Ictale gebeurtenissen als een betrouwbare proxy voor inbeslagneming evenementen omdat vangsten zijn een neurologische aandoening die afkomstig van de hersenen is. In de controle unit van epilepsie, neurologen zijn afhankelijk van de opsporing van Ictale gebeurtenissen isoleren voor resectie2te bevestigen de epileptogene regio van de hersenen. Op de intensive care toezicht op artsen Ictale activiteit om te beoordelen wanneer een activiteit van de inbeslagneming ingetogen patiënten3 blijft. Controle van de vangsten blijft een uitdagende kwestie voor de medische gemeenschap, worden als 30% van de epilepsie patiënten drug resistent tegen de beschikbare medicatie4,5 zijn, en 10% van de medische gevallen waarbij drug-induced toevallen reageert niet op de standaardbehandeling3. Dit presenteert een ernstig probleem voor de samenleving, zoals 10% van de Amerikaanse bevolking is verkenden om te ervaren een inbeslagneming gebeurtenis in hun leven en 3% worden verwacht om epilepsie6.

Vangsten in chronische epilepsie modellen bestuderen is duur, arbeidsintensief en vaak maanden duren om te bereiden7. Het is ook moeilijk uit te voeren van elektrofysiologische opnames in vrij bewegende dieren. Klinische testen worden geconfronteerd met soortgelijke problemen, evenals extra complexiteit aan de patiënt toestemming, variabiliteit in de achtergronden van de deelnemers en de morele en ethische overwegingen betrokken8gerelateerde. Acute inbeslagneming modellen, aan de andere kant, zijn gunstig omdat ze relatief gemakkelijk te bereiden, kosten-efficiënte en geschikt voor het genereren van grote hoeveelheden Ictale gebeurtenissen voor studie9. Bovendien, wordt het weefsel vastgesteld in een stabiele positie, zodat de voorwaarden ideaal zijn voor het uitvoeren van de elektrofysiologische opnames nodig om te studeren van de dynamiek van de inbeslagneming en de bijbehorende onderliggende pathofysiologie. Acute inbeslagneming modellen blijven gunstig over in silico (computer) modellen, omdat ze zijn gebaseerd op biologisch materiaal bestaat uit de hersenen samenstellende neuronale netwerk met al zijn inherente factoren en synaptische verbinding, die niet kan worden vastgelegd modellen10door zelfs de meest gedetailleerde computer. Deze functies maken acute inbeslagneming modellen klaar om efficiënt op de screening voor potentiële anti-epilepsie therapieën en het maken van de voorlopige bevindingen voor het bevorderen van hen voor verder onderzoek in chronische epilepsie modellen en klinische proeven.

Acute inbeslagneming modellen zijn meestal ontleend aan de normale hersenweefsel die hyper-prikkelbaar voorwaarden heeft ondergaan. Om klinisch relevante Ictale gebeurtenissen in gezonde hersenweefsel, is het belangrijk om te begrijpen dat de hersenen optimaal functioneert in een kritieke toestand11 waar (E) excitatie en inhibitie (I) zijn evenwichtige12. Een verstoring van de E-ik evenwicht kan leiden tot de staat van de hyper-prikkelbaar inbeslagneming waarin neerslag Ictale gebeurtenissen. Daarom in dit conceptuele kader, er zijn twee belangrijke strategieën voor het genereren van Ictale gebeurtenissen in hersenen plakjes (in vitro) of in geheel-hersenen (in vivo) preparaten: verhoogd of verminderde remming ("disinhibitie") excitatie ("niet-disinhibitie"). Echter Ictale gebeurtenissen worden hoogst gerangschikt en gesynchroniseerd evenementen waarvoor de invloed van GABAergic interneuronen te orkestreren van de neurale netwerk activiteit13,14. Om deze reden zijn niet-disinhibitie modellen het meest effectief voor genereren Ictale evenementen in geïsoleerde neurale netwerken, zoals in een in vitro brain slice15, overwegende dat de in vitro disinhibitie modellen vaak leiden tot een stekelige activiteit denken aan The-achtige stekelige. Bovendien, deze conceptuele kader, een kortstondige synchroniseren gebeurtenis kan ook betrouwbaar leiden tot een Ictale gebeurtenis16. In feite, kan een Ictale gebeurtenis worden veroorzaakt door een kleine verstoring op de neurale systeem17 toegepast wanneer er op een kritieke toestand overgang ("bifurcatie") punt18. Traditioneel werden deze verstoringen veroorzaakt door elektrische stimulatie. De recente ontwikkeling van optogenetics in de neurowetenschappen, echter biedt nu een meer elegante strategie om kritieke toestand overgangen16.

De in dit document beschreven methoden laten zien hoe te genereren Ictale gebeurtenissen op afroep in acute inbeslagneming modellen voor zowel in vitro (stap 1 van het Protocol) en in vivo studies (stap 2 van het Protocol). Het gaat om de keuze van de regio van de hersenen, inbeslagneming inductie methode, studie type en soorten; de focus zal evenwel op de aanbevolen keuze van een acute 4-AP corticale inbeslagneming model vanwege haar veelzijdigheid in een breed scala aan studie typen. De 4-AP inbeslagneming acute in vitro model is gebaseerd op het standaardprotocol voor te bereiden op kwalitatief hoogwaardige hersenen segmenten elektrofysiologische opnames en imaging studies19. Al zijn deze protocollen gebruikt te maken van de in vitro coronale hersenen segmenten van de somatosensorische-motorische cortex van muizen16,20 en mens21. Wijzigingen voor het genereren van Ictale gebeurtenissen in dit soort hersenen segmenten zijn eerder aangetoond16 en de volledige details zijn beschreven in het Protocol hieronder. De acute in vivo 4-AP corticale inbeslagneming model is gebaseerd op het standaardprotocol voor te bereiden op een craniotomy imaging studies22. De wijziging is dat geen venster (glasplaatje) is geïnstalleerd na de craniotomy. In plaats daarvan, worden proconvulsant agenten (4-AP) topisch toegepast op de blootgestelde cortex ertoe Ictale gebeurtenissen terwijl het dier onder narcose. Om onze kennis was onze fractie de eerste om deze acute in vivo corticale inbeslagneming model in muizen16,23te ontwikkelen. De acute in vivo 4-AP corticale inbeslagneming model bereid uit volwassen muizen werd ontwikkeld ter aanvulling van de in vitro segment model uit jonge weefsel. De replicatie van de bevindingen in het volwassen in vivo inbeslagneming model helpt om te generaliseren van de bevindingen van segment modellen door de inherente problemen met betrekking tot de niet-fysiologische omstandigheden van een 2D hersenen segment (versus een 3-D geheel-hersenen structuur) en de fysiologische verschillen tussen jonge en volwassen weefsel.

De methode van op afroep Ictale gebeurtenis inleiding is aangetoond door middel van ofwel soezen van neurotransmitters met een picospritzer of optogenetic strategieën. Tot de beste van onze kennis is onze fractie de eerste Ictale gebeurtenissen in menselijk weefsel met behulp van neurotransmitters via een picospritzer16starten. Voor optogenetic strategieën is de C57BL/6 muizen stam de conventionele stam gebruikt voor het uitdrukken van transgenen. De expressie voor channelrhodopsin-2 (ChR2) in GABAergic interneuronen of glutamaterge piramidale cellen zal bieden de optionele mogelijkheid voor het genereren van Ictale gebeurtenissen op afroep met korte pulsen van licht. Geschikt optogenetic muizen stammen omvatten de verkrijgbare C57BL/6 variant die ChR2 in beide interneuronen uitdrukt, met behulp van de muis vesiculaire GABA vervoerder promotor (VGAT)24of piramidevormige cellen, met behulp van de muis thymus cel antigeen 1 promotor (Thy1)25. Deze verkrijgbare VGAT-ChR2 en Thy1-ChR2 muizen bieden de mogelijkheid om het activeren van de GABAergic neuronen of glutamaterge neuronen, respectievelijk in de neocortex met blauw (470 nm) licht. De mogelijkheid gebeurtenissen moet genereren Ictale on-demand in acute inbeslagneming modellen bieden nieuwe mogelijkheden om te studeren inbeslagneming initiatie dynamiek en efficiënt het evalueren van potentiële anti-epilepsie therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle onderzoek waarbij patiënten werd uitgevoerd onder een protocol dat is goedgekeurd door de University Health Network onderzoek Ethics Board overeenkomstig de verklaring van Helsinki. Procedures waarbij dieren werden overeenkomstig de richtsnoeren van de Canadese Raad over Animal Care en goedgekeurd door het Krembil Instituut Animal Care onderzoekscomité.

1. protocol I: Acute In vitro inbeslagneming Model

  1. Voorbereiding van de dissectie oplossingen en kunstmatige cerebrospinale vloeistof
    1. Carbogenate ultrazuiver water (water met een soortelijke weerstand van 18.2 MΩ·cm gefilterd) met carbogen (95% O2/5% CO2) gedurende 5 minuten met behulp van air stenen zeepbel diffusoren (beluchters voor aquaria).
      Opmerking: Air stenen kunnen worden aangesloten op van de carbogen tank regulator via standaard silicone slangen. Als lucht stenen niet beschikbaar zijn, seal dicht het einde van de Siliconen slang en porren kleine gaatjes in het zegel dat de carbogen gas aan bubble uit en carbogenate de oplossing.
    2. Bereid een dissectie-oplossing door het oplossen van de opgeloste stoffen van tabel 1 in ultrazuiver water. CaCl2 toevoegen aan een oplossing die is geweest carbogenated voor ten minste 5 min. te helpen oplossen.
      Opmerking: U kunt ook CaCl2 eerst toevoegen, zodat het gemakkelijk in een onverzadigde oplossing ontbinden kan. De oplossing, in vloeibare vorm, moet 300-320 mOsm/L en een pH van 7,4 hebben na verzadigd met carbogen.
      1. Chill de dissectie-oplossing voor 0 - 4 ° C. Laat de oplossing in de koelkast 's nachts of plaats de oplossing in de vriezer voor 1 h en voortdurend toezicht op de temperatuur.
        Opmerking: De dissectie-oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 3 nachten; daarna Gooi.
      2. Carbogenate de dissectie-oplossing voor 5-10 min vóór gebruik.
        Opmerking: Ideaal, de oplossing moet verschijnen als slush of overgang om slush voorafgaand aan gebruik.
    3. Knaagdier kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) door de ontbinding van de opgeloste stoffen van tabel 2 (of 3 van de tabel voor de menselijke ACSF) in ultrazuiver water bereiden. Carbogenate is de oplossing van de ACSF terwijl het in een waterbad verwarmd tot 35 ° C tot gebruik. CaCl2 toevoegen aan een oplossing die is geweest carbogenated voor ten minste 5 min. te helpen oplossen.
      Opmerking: U kunt ook CaCl2 eerst toevoegen zodat het gemakkelijker in een onverzadigde oplossing ontbinden kan. De oplossing, in vloeibare vorm, 290-320 mOsm/L en met een pH van 7,4 na verzadigd met carbogen. Oplossingen moeten in hoeveelheden van 1, 2 of 4 L afhankelijk van de duur van de experimenten worden gemaakt. Het maken van 4 L voor een volledige dag (8 h) van experimenten. De ACSF dient te geschieden verse elk dag; Bewaar het niet langer dan 1 d.
  2. Dissectie van de muis voor het verzamelen van hersenweefsel
    Opmerking: Voor menselijk weefsel, gaat u verder met de volgende stap (stap 1.3) op het maken van segmenten van de hersenen met de vibratome. De kubus-vormige blokken (1 cm3) van hersenweefsel moeten worden verkregen bij de neurochirurg met behulp van de procedures eerder beschreven26,27.
    1. Het verzamelen van alle gereedschappen en materialen die nodig zijn voor dierlijke dissecties. De werkruimte instellen voor dierlijke dissecties te bereiden.
      1. Controleer de carbogen tank (95 %O2/5%CO2) om ervoor te zorgen is niet leeg. Vervang de gasfles voorafgaand aan experimenten als er minder dan 500 psi druk blijven.
      2. Kalibreren van het vibratome (trillende blade weefsel slicer) volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Pas de vibratome instelt op een snijden amplitude van 1 mm en een snijsnelheid van 0,12 mm/s hebben.
        Opmerking: De optimale instellingen kunnen verschillen voor elke individuele trillend weefsel blade cutter; echter in het algemeen, de amplitude moet hoog en de snijsnelheid zou laag moeten zijn.
      3. De zaal van de incubatie van hersenen-segment, (dat wil zeggen, de hersenen segment houder) vullen met ACSF en het bubble met carbogen. Plaats dan de incubatie-zaal in een waterbad instellen op 35 ° C.
        Opmerking: Gebruik knaagdier ACSF voor knaagdier hersenen segmenten en menselijke ACSF voor segmenten van het menselijk brein.
    2. Het verkrijgen van een jonge muis van beide geslachten, tussen de leeftijd van 13 d (p13) tot en met 21 d (p21, waar p0 de datum van geboorte is).
    3. Anesthetize de muis met een intraperitoneale injectie van natrium pentobarbital (55 mg/kg lichaamsgewicht). Zodra de muis is diep verdoofd, zoals aangegeven door het ontbreken van de teen snuifje reflex, snel kunt een guillotine dierenarts-goedgekeurd instrument onthoofden van de muis in één snelle beweging.
      Opmerking: De natrium pentobarbital injectie volgens de procedures die zijn aanbevolen door institutionele richtsnoeren voor te bereiden.
    4. Houd de muis in de neus te stabiliseren van de onthoofde hoofd zachtjes een insnijding van de middellijn beginnen tussen de ogen van de muis en langs de gehele lengte van de hoofdhuid te bloot van de schedel. Zorg ervoor dat de schedel is niet gecomprimeerd door de druk van het scheermes. Gebruik de hoek van het scherp van de snede te verhogen van gesneden precisie.
    5. Gespreid de kleppen van de muis de hoofdhuid met behulp van de vingers bloot van de schedel. Gebruik vervolgens de verse hoek van een scherp van de snede te maken van een sneetje langs de middellijn van de schedel; Let goed op het vermijden van contact met de hersenschors.
    6. Invoegen splinter pincet in de oogkassen van de muis te stabiliseren van de onthoofde hoofd en breng dit in een petrischaal gevuld met koude (0 - 4 ° C) dissectie oplossing. Zorg ervoor dat het hoofd volledig wordt ondergedompeld in de dissectie-oplossing.
    7. Een tweede set van splinter verlostang gebruikt voor zachtjes schil weg van de muis hoofdhuid, verwijderen van de neus bone door peeling het en verwijder de achterkant (caudal zijde) van de schedel.
      Opmerking: De neus bone van jonge muizen is zeer zacht en gemakkelijk gebroken.
    8. Gebruik een micro spatel te snijden de optische zenuwen, trigeminal zenuwen en ruggemerg. Gebruik vervolgens de micro spatel om voorzichtig het scheiden van de hersenen van de schedel. Laat de hersenen volledig ondergedompeld in de petrischaal gevuld met dissectie oplossing.
  3. Voorbereiding van corticale segmenten van de somatosensorische-motorische cortex
    1. Vullen van de vibratome buffer lade met ~ 150 mL koude (0 - 4° C) dissectie oplossing.
      Opmerking: Houd desgewenst de buffer-lade in de vriezer totdat het nodig is om een lage temperatuur tijdens het snijden procedure.
    2. Lijm het hersenweefsel van muis of mens op het vibratome podium (model houder/tray) met behulp van instant Lijm lijm. Voor muizen, gesneden uit een kleine caudal gedeelte van de hersenen (dat wil zeggen, het cerebellum) zodat het gemakkelijk kan worden gelijmd plat op de monsterhouder (waardoor de rostraal kant van de hersenen onder ogen zien het plafond).
      Opmerking: U kunt ook horizontale muis hersenen segmenten kunnen bereid worden door lijmen de dorsale zijde van de hersenen naar de monsterhouder (de ventrale zijde van de hersenen moet het gezicht van het plafond)28.
    3. Plaats de monsterhouder (met hersenweefsel) zachtjes in de lade van de buffer. Zorg ervoor dat het dorsale gedeelte van de hersenen wordt geconfronteerd met de vibratome van blade.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het minimaliseren van de hoeveelheid tijd dat de hersenen wordt blootgesteld aan lucht.
  4. Hersenen weefsel segmenteren en collectie
    1. Snijd de hersenen in 450 μm dikke plakjes met behulp van de vibratome in de dorsale ventrale richting. Ervoor zorgen dat de hersenen volledig verankerd aan het Dienblad van het specimen blijft terwijl het snijden.
      1. Maak de eerste snede in de hersenen van de muis te verwijderen van de bulbus olfactorius. Vervolgens maken verdere bezuinigingen totdat het gebied somatosensorische-motor wordt waargenomen (ligt ongeveer halverwege tussen de bulbus olfactorius en bregma).
        Opmerking: Optioneel, segment de hersenen in dunner (200 μm) plakjes totdat het corpus callosum verschijnt in de coronale weergave van de hersenen, wat dat aangeeft het gebied somatosensorische-motor is dichtbij.
    2. Gebruik een wide-boring overdracht pipet voor het verzamelen van coronale segmenten (450 μm) die de somatosensorische-motor gebied bevatten en dompelen hen in een petrischaal met koude (0 - 4 ° C) dissectie oplossing.
    3. Gebruik een nieuwe scheermesje en sneed eventuele overtollige weefsel van de segmenten. Voor coronale plakjes van muizen, verrichten een dwarse snede net onder de neocortical commissuur (d.w.z., corpus callosum). Dus knip niet af in een zaagmachines beweging; gewoon druk uitoefenen op het blad in het weefsel en gebruik een detaillering borstel voorzichtig het scheiden van het weefsel. Zorg ervoor om te minimaliseren van het verkeer van de coronale segment.
    4. Gebruik een pipet wide-boring overdracht over te dragen van het dorsale gedeelte van de coronale segmenten waarin de neocortex (layer 1-6) naar een tweede petrischaal gevuld met warm (35 ° C) ACSF voor een moment (~ 1 s). Vervolgens onverwijld overbrengen in de segmenten een cupje van de incubatie met warm (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Opmerking: Het doel van de overdracht in de petrischaal met ACSF is om te minimaliseren van de overdracht van de dissectie oplossing aan de incubatie kamer tijdens het overzetten van hersenen segmenten met de pipet wide-boring. Gebruik maken van de incubatie van kamer meerdere putten te houden verschillende hersenen segmenten georganiseerd.
    5. Gooi de rest van de hersenen en het karkas van de dieren volgens de richtlijnen van de institutionele.
  5. Incubatie en onderhoud
    1. Laat de plakjes van de hersenen iets ondergedompeld in de zaal van de incubatie bij 35 ° C gedurende 30 minuten. Vervolgens de incubatie kamer verwijderen uit het waterbad en laat ze terugkomen op kamertemperatuur (20-25 ° C). Wacht 1 h voor de segmenten van de hersenen te herstellen voordat u elektrofysiologische opnames.
      Opmerking: Zorg ervoor er geen luchtbellen die onder de segmenten van de hersenen in het incubatie-kamer verzamelen. Luchtbellen zijn lucht-interfaces die weefselschade veroorzaken. De muis hersenen segmenten kunnen worden gehandhaafd voor 6-8 h, terwijl het menselijk hersenweefsel kan worden opgeslagen gedurende maximaal 24 uur in een zaal van de incubatie goed-carbogenated met de juiste ACSF.
  6. Elektrofysiologische opnames van de oppervlakkige laag van corticale
    Opmerking: Ictale gebeurtenissen worden waargenomen in de extracellulaire lokale potentiële (LFP) veldopnames uit segmenten van de hersenen. De LFP van het segment van de hersenen kan worden geobserveerd en geregistreerd met een interface type kamer29 of een verzonken multi elektrodenserie (MEA) systeem16. De procedure is eerder beschreven16 en aanvullende details worden hieronder beschreven.
    1. Een wide-boring overdracht pipet of een detaillering borstel gebruiken om te verplaatsen van een segment van de hersenen op iets grotere voorgesneden lens papier dat wordt gehouden in plaats met behulp van een tandheelkundige pincetten. Het papier van de lens (dat het segment van de hersenen is rustend op) overbrengen met de opname-zaal en veilig in positie met een harp-scherm.
    2. Run warm (35 ° C), carbogenated ACSF perfusaat door de kamer opnemen in het segment van de hersenen met een snelheid van 3 mL/min (~ 1 infuus/s). Gebruik een digitale thermometer om ervoor te zorgen dat de opname-kamer is 33-36° C.
    3. Trek glas elektroden met een impedantie van 1-3 MΩ van borosilicaatglas slang (met een buitendiameter van 1,5 mm) met een trekker. Aanvulling funderingsput de elektroden glas met ACSF (~ 10 µL) met behulp van een injectiespuit Hamilton. Onmiddellijk de elektrode te negeren als de tip is beschadigd.
      Opmerking: De zilveren draad (5 min) bleekmiddel en alleen een minimaal gedeelte (dat wil zeggen, het topje) van de zilver draad om te worden ondergedompeld in de ACSF rug gevulde glazen elektroden tot een minimum beperken van lawaai en drift tijdens de opnames. Eventuele overtollige ACSF verwijderen door de glazen elektrode met een spuit van de Hamilton indien nodig.
    4. Gebruik een 20 X stereo microscoop nauwkeurig de opname glaselektrode in de oppervlakkige corticale guide layer (2/3) met behulp van handmatige manipulatoren. Record-/ view de elektrische activiteit van het segment van de hersenen op een computer met standaard software.
      Opmerking: Levensvatbare (hoogwaardige) hersenen segmenten zal vertonen een robuuste evoked potentieel in reactie op de toegepaste elektrische prikkels (100 µs, 30-300 μA) of lichte pulsen (30 ms, 10 mW/mm2) voor optogenetic weefsel.
  7. Inductie van inbeslagneming-achtige activiteiten
    1. Perfuse ACSF met 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) over het segment van de hersenen. Los 80 mg 4-AP in 8,5 mL water te maken van een stamoplossing van 100 mM 4-AP. Voeg 100 µL van 100 mM 4-AP stockoplossing tot 100 mL van ACSF om een ACSF perfusaat met 100 µM 4-AP.
      Opmerking: U kunt nul-Mg2 + ACSF (tabel 4), een gewijzigde ACSF oplossing met geen toegevoegde Mg2 +, perfuse van het segment van de hersenen. Voor menselijk weefsel, gebruik een combinatie van 100 µM 4-AP in nul-Mg2 + menselijke ACSF (tabel 5) om optimale resultaten te bereiken. De gemiddelde tijd voor Ictale evenementen te verschijnen is 15 min; het duurt echter maximaal 40 min. voor sommige segmenten van de hersenen.
  8. Op afroep inbeslagneming generatie: een strategie van de optogenetic voor optogenetic muizen
    1. Toepassing van een korte (30 ms) puls van blauw (470 nm) licht (met een minimaal 1 mW/mm2 uitvoer intensiteit) tot een Ictale gebeurtenis gestart. Gebruik een handmatige manipulator om de positie van een 1.000 µm Kern diameter optische vezel (0.39 nvt) direct boven de opname-regio.
      Opmerking: Stelt het tarief van de foto-stimulatie overeenkomt met de gewenste baudrate van het voorval Ictale gebeurtenis (dat wil zeggen, 1 pulse elke 50 s). Echter kan niet het tempo overdreven worden overdreven van de intrinsieke groeisnelheid waartegen Ictale gebeurtenissen plaatsvinden.
  9. Op afroep inbeslagneming generatie: een niet-optogenetic strategie voor menselijk weefsel
    1. Plaats de hersenen segment zodat de oppervlakkige lagen stroomopwaarts zijn en de diepe lagen stroomafwaarts naar de stroom van het perfusaat door de kamer van de opname.
    2. Trek een glaselektrode (hetzelfde type als gebruikt voor de opnames van de LFP) en zachtjes aanraken haar tip met een Wisser van de delicate taak maken van een kleine opening. Aanvulling funderingsput de elektrode met ~ 25 µL van 100 mM GABA (opgelost in water) en deze koppelen aan de picospritzer. U kunt ook maakte het Internet aanvulling funderingsput de elektrode met 200 µM glutamaat (opgelost in water).
      Opmerking: Als u wilt schatten het volume van de picospritzer (~ 50 µL) worden opgeblazen, gelden een trekje van de test op een kunststof plaat (bij voorkeur gerasterde). Vervolgens passen een druppel van bekende volumes (dat wil zeggen, 10 µL, 20 µL, 50 µL of 100 µL) met een pipet voor een vergelijking met de test trekje.
    3. Soesjes van de neurotransmitter (GABA of glutamaat) toepassen door het menselijke weefsel met een picospritzer (10-20 psi voor 30-100 ms) om een Ictale gebeurtenis gestart. Een enkel trekje van 100 mM GABA op de diepe laag (5) van het hersenweefsel gebeurtenissen moet genereren Ictale in de oppervlakkige laag van toepassing (2/3). U kunt ook een enkel trekje van 200 µM glutamaat rechtstreeks op de oppervlakkige laag gebeurtenissen moet genereren Ictale in de oppervlakkige laag van toepassing.
      Opmerking: Stelt het tarief van de picospritzer bladerdeeg overeenkomt met de gewenste baudrate van het voorval Ictale gebeurtenis (dat wil zeggen, 1 pulse elke 50 s). Echter kan niet het tempo overdreven worden overdreven van de intrinsieke groeisnelheid waartegen Ictale gebeurtenissen plaatsvinden.

2. protocol II: Acute In vivo inbeslagneming Model

  1. Chirurgische voorbereiding en chirurgie
    1. Het verkrijgen van een volwassen muis (p35 - p60) van beide geslachten.
    2. Diep anesthetize muis met Ketamine (95 mg/kg) en Xylazine (5 mg/kg). Het uitvoeren van de test teen-snuifje reflex om ervoor te zorgen dat de muis is verdoofd. U kunt ook kunt Isofluraan (4% voor inductie, 1,5-2% voor chirurgie) anesthetize van de muis.
      Opmerking: De keuze van de verdoving kan invloed hebben op de inbeslagneming activiteit30,31.
    3. Monteer de muis in een stereotaxic kader door het veiligstellen van haar hoofd met oor bars. Plaats een verwarmde pad onder de muis voor de duur van de operatie.
    4. De bovenkant van de muis het hoofd met behulp van een knaagdier trimmer bloot van de hoofdhuid te scheren. Injecteren 0.3 mL van lidocaïne met een 25 G 5/8 in de naald in het beenvlies om excessief bloeden of pijn te vermijden. Oog zalf toepassen door de ogen van de muis om te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens het experiment.
    5. Knijpen en til het midden van de hoofdhuid van de muis te beoordelen als de reflexen verdwenen zijn. Vervolgens voeren een horizontale gesneden te bloot de bregma lambda regio van de schedel. Voorzichtig schrapen de hele blootgestelde gebied van de schedel met een wattenstaafje om een droog oppervlak te maken.
    6. Voer een craniotomy van 4 mm in diameter aan coördinaten 2.0 mm lateromedial en -2,0 mm rostrocaudal de Somatosensorische cortex bloot te stellen. Markeer de locatie met een cirkel (4 mm in doorsnede) met behulp van een permanent marker. Boor rond de cirkel met een pneumatische tandheelkundige boor tot de resterende laag van het bot craniotomy geeft gemakkelijk manier wanneer omlaag geduwd. Zoutoplossing op de laag van het bot toepassen voordat u de craniotomy verwijdert met een splinter Tang. Vervolgens toepassing warme zoutoplossing op de blootgestelde regio.
  2. Opname methoden en chemische inductie van vangsten
    1. Trek glas elektroden met een impedantie van 1-3 MΩ van borosilicaatglas slang (met een buitendiameter van 1,5 mm) met een trekker. Aanvulling funderingsput de glas-elektroden met ~ 10 µL van ACSF of zoutoplossing met behulp van een Hamilton syringe. Onmiddellijk de elektrode te negeren als de tip is beschadigd.
      Opmerking: De zilveren draad (5 min) bleekmiddel en alleen een minimaal gedeelte (dat wil zeggen, het topje) van de zilver draad om te worden ondergedompeld in de ACSF rug gevulde glazen elektroden tot een minimum beperken van lawaai en drift tijdens de opnames. Eventuele overtollige ACSF verwijderen door de glazen elektrode met een spuit van de Hamilton indien nodig.
    2. Gebruik een handmatige manipulator te begeleiden van de glazen elektrode in de oppervlakkige corticale laag (2/3) op het gebied van somatosensorische-motor. Record-/ view de elektrische activiteit van het segment van de hersenen op een computer met standaard software.
      Opmerking: Layer 2/3 is ongeveer 0.3 mm diepe van de oppervlakte32.
    3. Topisch ~0.5 mL 1.5 mM 4-AP zoutoplossing op de blootgestelde cortex van de muis worden toegepast met een spuit totdat het volledig de craniotomy bedekt. Los 14 mg 4-AP in 100 mL isotonische zoutoplossing te maken van een stamoplossing 1,5 mM 4-AP zoutoplossing.
      Opmerking: Bereiden de 4-AP zoutoplossing, voordat het experiment wordt gestart. Ictale gebeurtenissen lijken gemiddeld, 15-30 min na topische applicatie.
  3. Op afroep generatie van beslagleggingen in optogenetic muizen
    1. Toepassing van een korte (30 ms) puls van blauw (470 nm) licht (met een minimum 10 mW/mm2 uitvoer intensiteit) tot een Ictale gebeurtenis gestart. Gebruik een handmatige manipulator om de positie van een 1.000 µm Kern diameter optische vezel (0.39 nvt) direct boven de opname-regio.
      Opmerking: Stelt het tarief van de foto-stimulatie overeenkomt met de gewenste baudrate van het voorval Ictale gebeurtenis (dat wil zeggen, 1 pulse elke 300 s). Echter kan niet het tempo overdreven worden overdreven van de intrinsieke groeisnelheid waartegen Ictale gebeurtenissen plaatsvinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De toepassing van 100 µM 4-AP aan kwalitatief goede (onbeschadigd) 450 µm en middelgrote corticale hersenen segmenten van een jonge VGAT-ChR2 geïnduceerde betrouwbaar terugkerende Ictale muisgebeurtenissen (> 5 s) binnen 15 min (figuur 1Ai). De toepassing van 100 µM 4-AP op segmenten van slechte kwaliteit resulteerde in barsten van gebeurtenissen of stekelige activiteit (figuur 1Aii). Gemiddeld 40% van de segmenten van de hersene...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De segmenten van de hersenen worden behandeld met een proconvulsant drug of een gewijzigde ACSF perfusaat verhogen van het neurale netwerk prikkelbaarheid en bevorderen van een neerslag van Ictale evenementen (electrographic inbeslagneming-achtige events). Bij muizen, moeten de voorkeur coronale segmenten van de somatosensorische-motor ruimte bevatten die de cortex cingularis, gebied 2 (CG), maar niet het retrosplenial gebied (RS); Deze anatomische Markeringen helpen bij het identificeren van het bereik van coronale segm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (MOP 119603 Peter L. Carlen en Taufik A. Valiante), het Ontario hersenen Instituut (Taufik A. Valiante) en de Mightex Student onderzoeksbeurs (naar Michael Chang). We zouden graag bedanken Liam Long voor zijn hulp bij het filmen van het video manuscript. Wij willen erkennen Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran en Shadini Dematagoda voor hun hulp bij het opstellen van de figuren en tabellen in dit manuscript. Figuren 1A, 3Aen 4A 6A zijn alle originele figuren gemaakt van gegevens die zijn gepubliceerd in Chang et al. 16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sodium pentobarbitalN/AN/AGekocht via de leveranciers van het Toronto Western Hospital
1 mm spuitN/AN/AGekocht via UT Med Store
25G 5/8” steriele naaldN/AN/AGekocht via UT Med Store
Eenvoudig scheermes (2x)N/AN/AGekocht via UT Med Store
Onmiddellijke kleeflijmN/AN/AGekocht via UT Med Store
LenspapierN/AN/AGekocht via UT Med Store
Glazen petrischaal (2x)N/AN/AGekocht via UT Med Store
Spleettang (2x)N/AN/AGekocht via UT Med Store
PVC handgreep microlepelN/AN/AGekocht via UT Med Store
Microlepel met platte puntN/AN/AGekocht via UT Med Store
Detailborstel 5/0N/AN/AGekocht bij een boetiek kunstwinkel
Transferpipet met brede boringN/AN/AGekocht via UT Med Store
Tandheelkundige pincetN/AN/AGekocht via UT Med Store
Thermometer (digitaal)N/AN/AGekocht op Amazon.ca
Controleer carbogentank (95%O2/5%CO2) N/AN/AGekocht via de leveranciers van het Toronto Western Hospital
VibratomeLeicaN/AGekocht via de leveranciers van het Toronto Western Hospital
hersenslice incubatiekamer (ook wel hersenslice houder) Scientific Systems Design IncN/A
Natriumchloride (NaCl)N/AN/AGekocht via UT Med Store
NatriumbicarbonaatN/AN/AGekocht via UT Med Store
DextroseN/AN/AGekocht via UT Med Store
Kaliumchloride (KCl)N/AN/AGekocht via UT Med Store
Magnesiumsulfaat (MgSO4 H2O)N/AN/AGekocht via UT Med Store
Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (HNaPO4·H2O)N/AN/AGekocht via UT Med Store
Calciumchloride (CaCl2·2H2O)N/AN/AGekocht via UT Med Store
SucroseN/AN/AGekocht via UT Med Store

Referenties

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750(2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Acute epileptische modellenPreparatie van corticale coupes4 AP inductieOptogenetische stimulatieElektrofysiologische registratiesDetectie van ictal eventsHerstel van hersencoupesCarbogenatie ACSFStudie naar epileptische mechanismenScreening van anti epileptische therapie

Gerelateerde artikelen