Een temperatuurgradiënt Assay thermische voorkeur van Drosophila larven bepalen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.

Samenvatting

Veel dieren, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, zijn geschikt voor discriminerende minieme verschillen in omgevingstemperatuur, die hen toelaat om te zoeken naar hun voorkeur thermische landschap. Om de voorkeuren van de temperatuur van larven via een gedefinieerd bereik van de lineaire gedefinieerd, ontwikkelden we een bepaling met behulp van een temperatuurgradiënt. Om vast te stellen een single-directionele verloop, zijn twee aluminium blokken verbonden met onafhankelijke waterbaden, elk waarvan de temperatuur van de afzonderlijke blokken regelt. De twee blokken Stel de boven- en ondergrenzen van het verloop. De temperatuurgradiënt is opgericht door het plaatsen van een agarose-coated aluminiumplaat over de twee water-gecontroleerde blokken, zodat de plaat de afstand tussen hen overspant. De uiteinden van de aluminiumplaat die is ingesteld op de bovenkant van de water-blokken definieert de minimale en maximale temperaturen en de regio's tussen de twee blokken vormen een lineair verloop van de temperatuur. De kleurovergang bepaling kan worden toegepast op de larven van verschillende leeftijden en kan worden gebruikt voor het identificeren van mutanten die vertonen fenotypen, zoals die met mutaties die genen coderend voor TRP channels en opsins, die nodig voor de discriminatie van de temperatuur zijn.

Inleiding

Thermotaxis is werkzaam bij mobiele dieren te selecteren van een omgeving met de meest gunstige voorwaarden^1,2,3. Als het klimaat is extreem warm of koud, dit probleem is van vitaal belang voor het voortbestaan. Daarnaast veel dieren zijn gevoelig voor zeer kleine verschillen in temperatuur in het comfortabele bereik en omgeving met een ideale temperatuur uitzoeken. Dit is van bijzonder belang voor poikilothermic organismen zoals fruitvliegjes, die equilibreer hun lichaamstemperatuur met het milieu. Testen om te controleren van larvale thermotaxis hebben bijgedragen in de identificatie en verduidelijking van de rol van moleculaire sensoren zoals Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële (TRP) kanalen^4,5,6, rhodopsins^7,8, en ionotropic receptor receptoren (IRs)⁹, die deze dieren met temperatuur gevoeligheden begiftigen over verschillende temperatuurbereiken.

Een tweeweg multiple-choice test biedt een aanpak om te bestuderen van thermische voorkeuren in larven^6,7. De bepaling brengt met zich mee tot de oprichting van twee verschillende temperatuurzones en laat de dieren om te selecteren van de ene kant boven de andere. De resultaten van twee richtingen keuze tests kunnen robuust, vooral als de temperatuurverschillen tussen de twee opties groot zijn. Bovendien, aangezien elke bepaling classificatie van slechts twee groepen impliceert, kan de gegevens worden uitgedrukt als een eenvoudige voorkeur-index. Het gemak en de eenvoud van twee richtingen keuze tests zijn ook vatbaar voor genetische schermen. Een belangrijk minpunt is echter dat veel experimenten nodig om de gewenste temperatuur van de wild-type of mutant dieren zijn.

Een kleurovergang assay biedt de mogelijkheid om de gewenste temperatuur in een enkele assay-⁸. Bovendien, in tegenstelling tot de twee richtingen multiple-choice test, het maakt het mogelijk de evaluatie van de verdeling van een groep dieren, wanneer geconfronteerd met een doorlopend bereik van temperaturen. Een kleurovergang assay gebruikt een petrischaal en enkele dieren en is geschikt voor het karakteriseren van de gedetailleerde gedrag van individuele dieren¹⁰. Echter, aangezien petrischaaltjes ronde zijn, de grootte van de temperatuurzones variëren en geleidelijk kleiner zijn afhankelijk van de afstand van het centrum. Dus, deze setup is niet ideaal voor het toezicht op de selecties van de temperatuur van de populaties van dieren.

Een continu thermisch kleurovergang apparaat dat is geschikt voor het beoordelen van de voorkeuren van de temperatuur van groepen van larven maakt gebruik van een rechthoekige arena en hier wordt beschreven. Het apparaat is eenvoudig te construeren en te assembleren. Bovendien, het verloop is lineair, en is flexibel, aangezien het kan worden gebruikt om te beoordelen van thermotaxis over grote temperatuur variëren van 10 ° C tot 42 ° C. De bepaling is snel en eenvoudig uit te voeren en reproduceerbare gegevens levert. Naast de rapportage van de favoriete temperatuur van larven, blijkt het de voorkeuren van de bevolking van dieren over een gehele lineaire bereik in een enkele experiment. Als gevolg van deze voordelen is het een uitstekende keuze voor de identificatie van genen die nodig zijn voor thermotaxis.

Protocol

1. apparatuur fabricage en montage apparaat voor kleurovergang Assays

1. De aluminium assay platen voor de single-directionele kleurovergang assay fabriceren.
   1. Trim en slijpen van elke aluminiumplaat assay (figuur 1A) uit één stuk aluminium met behulp van een lintzaag en scherpe verticale molen met de volgende dimensies: de buitenste grootte is 140 x 100 x 9 mm en de binnenste grootte is 130 x 90 x 8 mm (figuur 1B). Anodize van de binnenkant van elke assay plaat met zwarte verf gemakkelijker voorkomen dat roest te visualiseren van de larven.
      Opmerking: Vervaardiging van de platen aluminium assay voor het single-directionele verloop wordt gedaan door een machine winkel. De anodisatie wordt uitgevoerd door een commerciële leverancier.
   2. Mark van de bovenste en onderste randen van elke plaat assay met 13 begrenzingen, gescheiden door 10 mm met behulp van een permanent marker. Plaats de eerste en laatste begrenzingen 5 mm van de binnenste rand van de platen assay (figuur 1A, B).
2. Om de aluminiumplaat van de bepaling van de bidirectionele gradatie, een aluminiumplaat met uitgesneden de volgende afmetingen gebruikt plaatwerk schaar: 250 x 220 x 2 mm. Anodize de assay platen met zwarte verf.
   Opmerking: Fabricage van de aluminium assay platen voor de bidirectionele verlopen wordt uitgevoerd door een machine winkel. De anodisatie wordt gedaan door een commerciële leverancier.
3. De aluminium blokken te fabriceren.
   Opmerking: Twee blokken nodig zijn voor het verloop van de single-directionele en drie blokken nodig zijn voor het verloop van de bidirectionele.
   1. Snijd de aluminium blokken (Figuur 1 c) uit één stuk aluminium met behulp van een lintzaag (afmeting van 50 x 255 x 14 mm) (Figuur 1 c, D).
   2. Boor het water kanaal binnen het blok (7 mm in doorsnede) met behulp van een verticale molen en draad groeven in de open uiteinden aan de ene kant (Figuur 1 d). Sluit de gegroefde gaten met bouten en draad tape van de zegel te vormen van een U-vormige water kanaal (Figuur 1 c, D).
      Opmerking: De fabricage van de aluminium assay blokken wordt uitgevoerd door een machine winkel.
   3. Herstellen van de connector in het aluminium blok (Figuur 1 d) met schroefdraad en draad afdichting band aan het ene uiteinde. Het andere uiteinde met meerdere weerhaken past silicone slangen (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" muur).
4. Krijgen twee gekoeld/verwarmd circulerende Baden.
5. Assembleren temperatuurgevoelig blokken voor de kleurovergang assay-systeem.
   1. Voor het verloop van de single-directionele, verbinden met elk van de twee aluminium blokken een aparte waterbad zodat de temperatuur van elk blok wordt gecontroleerd door een onafhankelijke water circuleren systeem (figuur 2A). Silicone slangen (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" muur) gebruiken de uitlaat van het waterbad verbinden met de connector op de binnenzijde van het aluminium blok (figuur 2A). Gebruik ook buizen de inlaat van het waterbad verbinden met de connector van de buitenzijde van het aluminium blok.
   2. Voor het verloop van de bidirectionele, plaatst u twee van de drie blokken onder de links en rechts van de plaat en hen verbinden met de dezelfde waterbad met de buis (figuur 2B). Het derde blok aluminium verbinden met een tweede bad met water en plaats onder het midden van de plaat (figuur 2B).
      Opmerking: Dit apparaat en de bepaling zijn alleen nodig als de larven zich in de zone op een van de randen of de andere van het single-directionele verloop ophopen. Zo ja, is het belangrijk om te beoordelen of er is een randeffect. Om te testen deze mogelijkheid, stellen een bidirectionele verloop waarin de rand zone temperatuur de voorkeur van de larven met behulp van het single-directionele verloop (bijvoorbeeld 18 ° C) de temperatuur in het midden van de plaat van het bidirectionele verloop (figuur 3E is , F).

2. de larvale synchronisatie

1. Voeden vliegen moet worden gebruikt voor het leggen van eieren.
   1. Mix gist korrels en gedestilleerd water met een stamper om gist plakken. Grondig vermalen en roer totdat het de consistentie van de pasta is vergelijkbaar met pindakaas. Vermijd overdreven droge pasta, die kan bij het overbrengen van vliegen naar verse flesjes afschilferen, of natte pasta, die de vliegen overlappen kan.
   2. Voeg de gist plakken dicht bij de binnenmuren van standaard Drosophila flesjes, net boven het oppervlak van het voedsel met behulp van een stamper.
   3. Graaf 12-35 vrouwtjes tot half zoveel mannetjes (maar niet meer dan 10) op een pad van CO₂ en de vrouwtjes en mannetjes toevoegen aan elke gist plakken-bevattende flacon.
   4. Om te houden van de vlieg voedsel met de gist-pasta vochtig, terwijl de vliegen voeden, combineren deze flesjes in een lade die in het bezit tot 100 flacons met 20 open flesjes met gedestilleerd water alleen. Plaats de lade in een doorzichtige plastic zak en verzegelen.
   5. Incubeer de lade in een incubator 25 ° C gedurende 48 uur zodat de vrouwtjes worden gevoed adequaat, waardoor ze te grote aantallen eieren leggen.
2. Instellen van flesjes voor het leggen van eieren.
   1. Breng de gevoed vliegen in nieuwe voedsel flesjes voor het verzamelen van ei door te tikken op hen. Gebruik geen CO_2, waardoor de vliegen minder om eieren te leggen over de volgende korte tijd venster.
      Opmerking: Standaard Drosophila voedsel flesjes worden gebruikt zonder gist plakken voor de eicelpunctie.
   2. Laat het vliegen om eieren te leggen gedurende 3 uur bij 25 ° C zodat alle eitjes zijn verzameld over een relatief smalle tijd venster.
      Opmerking: Dit zal toelaten de larven moeten worden gesynchroniseerd op de dezelfde ontwikkelingsstadium.
   3. Plaats de flesjes met de eieren in de lade met de flesjes water en draai de zak. Incubeer bij 25 ° C onder 12 h licht: 12 h donkere cycli.
   4. De larven van de leeftijd voor een gegeven aantal uren nadat ei leggen (AEL) afhankelijk van het larvale stadium gewenst.
      Opmerking: Tabel 1 is een schatting van de relatie tussen de uren AEL en het larvale stadium, die afhankelijk van de vlieg materieel variëren zal, voedsel gebruikt, temperatuur, etc. de precieze relatie tussen de AEL en ontwikkelingsstadium moet fokken gecontroleerd door elke onderzoeker die met behulp van fysieke criteria, zoals de morfologie van de mond haken en spiracles¹¹.

3. temperatuurverloop tijdens Setup

1. Bereiden van single-directionele verloop
   1. Om te maken een vochtige ambient omgeving tijdens het testen, plaatst u de twee aluminium blokken verbonden met twee waterbaden op natte papieren handdoeken, gescheiden door 10 cm (figuur 2A).
   2. De twee waterbaden ~ 2 h alvorens aan te vangen de bepaling zodat u genoeg tijd voor de temperatuur van de aluminium blokken te equilibreer inschakelen.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van een mock experiment om te bepalen van de temperatuur van elk waterbad die nodig is om de gewenste lineair verloop van de temperatuur. Sommige paren van de typische temperatuur in te stellen van de waterbaden zijn vermeld in tabel 2. Nochtans, merken op dat de oppervlakte temperaturen worden beïnvloed door de omgevingstemperatuur. De lengte van de buizen ook beïnvloedt de temperaturen er is koelen in de buizen. De lengte van de buis in onze opstelling is 1,5 m.
   3. Magnetron 100 mL van de 1% agarose op de high-power instelling in een 500 mL ronde wide-mouth fles en giet 25 mL/assay plaat op een niveau benchtop. Twee assay platen, die kunnen worden geplaatst op de aluminium blokken op hetzelfde moment (figuur 2A) voor te bereiden.
   4. Nadat de agarose heeft verhard (10-20 min), wrijf zachtjes elk agarose oppervlak met een standaard keuken spons of een melamine spons te maken de oppervlakte agarose enigszins grof, zodat wanneer het sproeien van water op de agarose gel, een soepele dunne water membraan worden gemaakt, en geen waterdruppels zal vormen.
   5. Volledig dompelen de platen in een container met gedestilleerd water totdat de bepaling klaar om te worden uitgevoerd is om te voorkomen dat de platen krijgen verdroogde.
2. Bereiden een bidirectionele verloop (optioneel)
   1. Als u wilt maken een vochtige ambient omgeving tijdens het testen, drie aluminium blokken 8 cm uit elkaar (figuur 2B) op natte papieren handdoeken te plaatsen.
   2. De twee waterbaden ~ 2 h alvorens aan te vangen de bepaling zodat u genoeg tijd voor de temperatuur van de aluminium blokken te equilibreer inschakelen.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van een mock experiment om te bepalen van de temperatuur van elke waterbad voor het bidirectionele verloop. Sommige paren van de typische temperatuur in te stellen van de waterbaden zijn vermeld in tabel 3. Nochtans, merken op dat de oppervlakte temperaturen worden beïnvloed door de omgevingstemperatuur. De lengte van de buizen ook beïnvloedt de temperaturen er is koelen in de buizen. De lengte van de buis in onze opstelling is 1,5 m.
   3. Wikkelen om te verhinderen dat de agarose morsen uit de plaat, de randen van de aluminiumplaat met het labelen van tape om te vormen van een 10 mm hoge muur (figuur 2B).
   4. Met behulp van de high-power instelling, magnetron 200 mL van de 1% agarose in een 500 mL ronde wide-mouth fles en giet 120 mL op een plaat assay.
   5. Nadat de agarose heeft verhard (~ 30 min), zachtjes wrijf elk agarose oppervlak met een standaard keuken spons of een melamine spons te maken van het agarose oppervlak enigszins grof, zodat wanneer het sproeien van water op de agarose gel, een soepele dunne water membraan ontstaat en neen waterdruppels vorm.
   6. Volledig dompelen de assay platen in een container met gedestilleerd water totdat de bepaling klaar om te worden uitgevoerd is om te voorkomen dat ze uitdrogen.
3. Single-directionele kleurovergang instellen
   1. Bereiden van reagentia en items op een bankje naast het apparaat van de kleurovergang assay (Zie de Tabel van de materialen).
   2. Ter bevordering van efficiënte temperatuur overdracht, vult u eventuele leemten tussen de aluminium blokken en de assay platen door het sproeien van water op het raakvlak tussen de blokken en de plaat.
   3. Met behulp van handschoenen, verwijder de assay platen uit de watercontainer. Als water tussen de agarose gel en de plaat valt en zorgt ervoor dat oneffenheden te vormen op het oppervlak, verwijdert u het water met een micropipet P1000.
   4. De assay-platen op de aluminium blokken plaatsen, zodat de begrenzingen die 2 cm vanaf beide rand precies overeenkomen met de randen van de aluminium blokken (figuur 2A, C).
   5. Spuit water op het oppervlak van de plaat (een dunne water membraan die betrekking hebben op het oppervlak van het agarose is voldoende) om te voorkomen dat de agarose gel uitdrogen. Zorg ervoor dat het membraan van het water continue en vrij van waterdruppels omdat larven krijgen in waterdruppels gevangen kunnen.
   6. Betrekking hebben op het verloop systeem met een kartonnen doos te water verdamping verminderen en helpen stabiliseren van de temperatuur van het oppervlak van de gel. 5-10 min om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur aan equilibreer wacht.
   7. Controleer de oppervlaktetemperatuur op 12 punten op de plaat (figuur 2C). Neem twee metingen binnen elke zone vast te stellen of er variabiliteit binnen een zone is. Zorg ervoor dat de temperatuur op beide plekken binnen ± 0,2 ° C van de gewenste temperatuur.
      Opmerking: Variabiliteit binnen een zone meestal treedt op omdat de exacte afstanden van de twee plekken aan de rand van de aluminium blokken niet identiek zijn. Pas de positie van de plaat op de aluminium blokken om ervoor te zorgen dat de begrenzingen die 2 cm vanaf beide rand precies overeenkomt met de randen van de aluminium blokken.
   8. Indien de gemeten temperatuur gradiënt van het gewenste verloop afwijkt, verhogen of verlagen van het water bad temperatuur instelling(en) en gecontroleerd of de oppervlaktetemperatuur nadat de temperatuur van het water bad stabilize(s).
   9. Gelden de kleurovergang systeem met een kartonnen doos tot het starten van de test.
4. Bidirectionele kleurovergang instellen (optioneel)
   1. Bereiden van reagentia en items op een bankje naast het apparaat van de kleurovergang assay (Zie de Tabel van de materialen).
   2. Spray water op de oppervlakken van de drie blokken van het aluminium te bevorderen van efficiënte temperatuur overdracht van de aluminium blokken aan de assay platen door het invullen van een kloof tussen de oppervlakken.
   3. Verwijder de assay platen zorgvuldig uit de watercontainer en plaats op de aluminium blokken. Als water tussen de agarose gel en de plaat, die zou kunnen veroorzaken hobbels te vormen op het oppervlak binnenvalt, verwijdert u het water met een micropipet P1000.
   4. De assay-plaat op de aluminium blokken plaatsen, zodat de midlines van de eerste en laatste zones van beide rand exact overeenkomen met de randen van de twee zijden aluminium blokken (figuur 2B, D).
   5. Spuit water op het oppervlak van de plaat (een dunne water membraan die betrekking hebben op het oppervlak van het agarose is voldoende) om te voorkomen dat de agarose gel uitdrogen. Zorg ervoor dat het membraan water continue en vrij van waterdruppels, want larven krijgen in waterdruppels gevangen kunnen.
   6. Betrekking hebben op het verloop systeem met een kartonnen doos te water verdamping verminderen en helpen stabiliseren van de temperatuur van het oppervlak van de gel. 5-10 min om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur aan equilibreer wachten.
   7. Controleer de oppervlaktetemperatuur op twee punten langs de middellijn van elk van de 10 zones (figuur 2D). Neem twee metingen binnen elke zone vast te stellen of er variabiliteit binnen een zone is. Zorg ervoor dat de temperatuur op beide plekken binnen ± 0,2 ° C van de gewenste temperatuur.
      Opmerking: Variabiliteit binnen een zone meestal treedt op omdat de exacte afstanden van de twee plekken aan de rand van de aluminium blokken niet identiek zijn. Pas de positie van de plaat op de aluminium blokken om ervoor te zorgen dat de midlines van de eerste en laatste zones dichtstbijzijnde elke rand exact overeenkomen met de randen van de twee zijden aluminium blokken.
   8. Indien de gemeten temperatuur gradiënt van het gewenste verloop afwijkt, aanpassen van de water bad temperatuur instelling(en) en controleer de oppervlaktetemperatuur nadat de temperatuur van het water bad stabilize(s).
   9. De blokken met een kartonnen doos gelden tot het begin van de test.

4. larvale collectie en wassen

1. Isoleren van schone larven (optie 1)
   1. ~ 40 mL 18% sacharoseoplossing toevoegen aan een test tube van 50 mL. Schep de larven van de voedsel-vial(s) met een scoopula en de overdracht naar de 18% sacharoseoplossing.
   2. Meng grondig maar voorzichtig met behulp van een scoopula te scheiden van de larven van het voedsel puin. Wachten voor 30-60-s tot de larven float aan de bovenste laag van de buis. De bovenste laag met de larven (~ 10 mL) pour naar een andere tube van 50 mL en vul de buis met vers 18% sacharoseoplossing. Wachten voor 30-60-s tot de larven float aan de bovenste laag weer.
      Opmerking: Grote voedseldeeltjes soms dragen samen met larven en larvale thermotaxis kunnen beïnvloeden als ze niet worden verwijderd. Als grote voedseldeeltjes in de bovenste laag blijven, herhaal stappen 4.1.1-4.1.2 of deze handmatig verwijderen met een scoopula.
   3. De bovenste laag van de larven (~ 10 mL) overbrengen naar twee andere buizen van 50 mL en vul de twee buizen met gedestilleerd water tot het verminderen van de sucrose concentratie, zodat de larven wordt snel in water dalen. Wachten voor 30-60-s tot de larven naar de bodem zinken. Dit en volgt zo spoedig mogelijk om te voorkomen dat de larven van de verdrinkingsdood uitvoeren.
   4. Gooi zoveel mogelijk van het water mogelijk door het voorzichtig het kantelen van de buizen. Larven combineren in één buis door gieten uit de larven met het resterende water en vul de buis met gedestilleerd water.
   5. Wachten voor 30-60-s alle larven zinken en water zo veel mogelijk door het kantelen van de buizen voorzichtig verwijderen. Herhaal deze stap wassen 2 - 4 keer tot volledig verwijderen sacharose en alle zichtbare voedsel.
   6. Verwijder zo veel van het water mogelijk en de larven overbrengen in een lege 35 mm petrischaal door decanteren. Spray de buis met water en een kleine kwast gebruiken om te helpen de overdracht de larven.
   7. Verwijder overtollig water uit de petrischaal met behulp van een micropipet P1000. Laat ~0.5 mL water om uitdroging van de larven te voorkomen.
   8. Plaats het deksel op de schotel om te voorkomen dat de larven ontsnappen. Zet de deksel ondersteboven ter vermindering van het vermogen van larven te ontsnappen door het kleine gat tussen de deksel en de schotel. Toestaan dat de larven te herstellen voor 10-20 min.
2. Isoleren van schone larven (optie 2)
   Opmerking: Deze alternatieve methode voor het schoonmaken van de larven vermindert de mogelijkheid van verstikkende de larven tijdens de procedure wassen. Voor het gebruik van deze methode, gaat u verder met de volgende stappen na het uitvoeren van de bovenstaande stappen 4.1.1-4.1.2.
   1. Plaats een cel zeef (300 µm, behoudt larven 72 h AEL of ouder) op de top van een tube van 50 mL.
   2. Nadat u hebt bevestigd dat er is geen volwassen organen of voedsel puin drijvend op het oppervlak van de sacharoseoplossing, giet de bovenste laag met de larven door de zeef val alle de larven op het gaas-scherm. Wassen de larven grondig met gedestilleerd water tot de 50 mL-buis is gevuld.
   3. Verwijder de zeef van de cel met de larven en de afzet van het gebruikte water uit de buis. Plaats de zeef met de larven op de top van de lege buis en wassen van de larven opnieuw met gedestilleerd water tot de 50 mL-buis is gevuld.
   4. Draai de zeef ondersteboven om een lege 35 mm petrischaal, en spuiten van water vanaf de bovenkant van de cel zeef overdracht van de larven naar de petrischaal. Overdracht van de resterende larven met een kleine kwast.
   5. Blijven stap 4.1.7 boven voordat u verdergaat met stap 5.

5. assay en berekening

1. Verwijder kartonnen doos en controleer de oppervlaktetemperatuur van de gel direct vóór de overbrenging van de larven aan de plaat. Minimaliseer de tijd die de kartonnen doos geopend is om te voorkomen dat de temperatuur evenwichtsinstelling verstoren. Als het oppervlak droog, spuit een kleine hoeveelheid water op het oppervlak.
2. Distribueren van 150 ± 50 larven in de buurt van het centrum van elke plaat (tussen de zones 3 en 4 uit de 6 zones) voor de single-directionele gradatie (release zone; Figuur 2C).
   Opmerking: Voor het verloop van de bidirectionele, distribueren 200-400 larven langs de middelste zone van elke helft (figuur 2D).
3. Plaats een microplate deksel boven elke assay plaat om te voorkomen dat de larven kruipen uit. Betrekking hebben op de installatie met een kartonnen doos om te voorkomen dat blootstelling aan licht, die mogelijk van invloed zijn op de larvale keuze op de agarose gel.
   Opmerking: Voor het bidirectionele verloop, het moet niet noodzakelijk zijn ter dekking van de plaat met een deksel, omdat de plaat groter is, en de gewenste temperatuur van de larven in de middelste zone is. Daarom enkele larven zich ophopen op de randen en hebben een kans om te kruipen uit.
4. Het toestaan van de bepaling te gaan voor 10-30 min voor het verloop van de single-directionele en voor 15-35 min. voor het verloop van de bidirectionele, afhankelijk van de leeftijd van de larven (tabel 4).
5. De kartonnen doos en het deksel microplate verwijderen. De platen uit bovenstaande met behulp van een digitale camera te fotograferen. Twee foto's nemen van elke plaat assay zodat de onderzoeker met een beter contrast en helderheid voor analyse kiezen kunt.
6. Verwijder alle van de larven van de assay platen en overal buiten de platen door aspiratie.
7. Reinig de platen assay, de buizen en de cel zeef grondig met gedestilleerd water. Hergebruik de assay platen die dag bereid, tenzij de oppervlakte van het agarose is beschadigd.
8. Berekenen de percentage-verdeling van de larven in elke zone.
   1. Open het fotografische beeld van de resultaten van de test met software waarmee markeringen toe te voegen aan de afbeelding. Om aan te geven de assay zones, tekent u verticale lijnen elke 2 cm op basis van de begrenzingen op de plaat assay.
   2. Het aantal larven in elke zone en de nummers opnemen. Tellen niet larven in regio's 0.5 cm vanaf een van de muren. De gel is dikker in de buurt van de muren en de oppervlaktetemperaturen niet lineaire in deze regio's.
   3. Voor het verloop van de single-directionele, het percentage distributie in elke zone als volgt te berekenen:
      (aantal larven in een bepaalde zone 2-cm) / (totale aantal larven in 6 zones) x 100.
   4. Voor het verloop van de bidirectionele, het percentage distributie in elke zone als volgt te berekenen:
      (aantal larven in een bepaalde zone 2-cm) / (totale aantal larven in 5 zones op elke zijde van het verloop) x 100.

Resultaten

Om vast te stellen een 18 ° C - 28 ° C single-directionele kleurovergangen, we stellen de temperaturen van twee waterbaden op 16,8 ° C en 31 ° C. Door het meten van de temperatuur op 26 posities binnen de bovenste en onderste gedeelten van alle 6 zones, de randen tussen de zones, en aan de extreme uiteinden van het agarose gel oppervlak (figuur 2C, 2E) verkrijgen we de temperaturen op 13 punten. De verdeling van de temperatuur langs het verlo...

Discussie

Om het welslagen van dit protocol, is het belangrijk maatregelen te nemen voor het verkrijgen van voldoende aantal larven uit te voeren van de experimenten. Deze omvatten vooraf voeden de vliegen in gist plakken-bevattende flesjes voor 2-3 d te verbeteren met het leggen van eieren. De flesjes moeten worden geplaatst in een lade met flesjes water en ingesloten in een doorzichtige plastic zak, die houdt het vocht van het levensmiddel en bevordert effectief voeden door de larven terwijl blootstelling aan normale licht-donke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gradient assay apparaat
PolyScience 9106, Gekoelde/verwarmde 6L Circulerende Bad	Thomas Scientific	9106	Dit model is niet meer leverbaar. Bijgewerkte vervangende modellen zijn: 1186R00 en 1197U04 voor 120 V, 60 Hz, of 1184L08 en 1197U04 voor 240 V, 50 Hz.
Aluminium assay plaat (voor eenrichtingsgradiënt)			Buitenafmetingen: 14 x 10,1 x 0,9 cm, binnenafmetingen: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, zwart geanodiseerd.
Aluminium plaat (voor tweedirichtingsgradiënt)			25 x 22 x 0,2 cm, zwart geanodiseerd.
Aluminium blok			Buitenafmetingen: 25,5 x 5 x 1,4 cm, parameters van de binnenkanalen zijn weergegeven in figuur 1D.
Connector voor aluminium blokken en slangen	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitair Silicone Slang	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wand
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Items en reagentia voor assay
Pistool	USA Scientific	17361	Pistool voor 1,5 mL microcentrifugebuizen
Thermometer	Fluke	51II
Thermokoppel	Fluke	K type
Universele microplate deksel	Corning	6980A77
35 mm schotel	Corning	9380D40
Labeling tape (voor tweedirichtingsgradiënt)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Bereid 1% oplossing
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Bereid 18% oplossing vlak voor het starten van de assay
Verfkwast	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifugebuizen	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL ronde fles met brede mond	Pyrex	1395-500
Celstrainer (300 mm poriën)	PluriSelect	43-50300	Optioneel item voor het wassen van larven
Karton doos (buisjesbak)	Genesee Scientific	FS32-124
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Drosophila voedsel
Gedestilleerd water			22.400 mL
Maïsmeel, geel (extra fijn maas, gekruld) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1.609 g
Brewersgist 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Sojameel (10 kg/eenheid)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo light maïsstroop	Karo		1.700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoaat (opgehangen in 200 proof ethanol)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Propionzuur puriss. p.a., >99,5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Fosforzuur  ACS reagens, ≥85 wt. % in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8,5 mL