Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor imaging-myelinated axonen in een segment van de vaste hersenen met behulp van een label-vrije nanoschaal imaging techniek gebaseerd op spectrale reflectometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Spectrale Reflectometric microscopie op Myelinated axonen In Situ
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In een zoogdieren zenuwstelsel biedt myeline een elektrische isolatie door enwrapping de axon vezels in een spiraal van meerdere lagen. Geïnspireerd door haar zeer georganiseerde subcellular architectuur, ontwikkelden we onlangs een nieuwe beeldvorming modaliteit, spectrale reflectometrie (SpeRe), waarmee de ongekende label-vrije nanoschaal beeldvorming van de levende myelinated axonen in situgenoemd. Het onderliggende principe is nanostructural om informatie te verkrijgen door het analyseren van het spectrum van de reflectie van de meerdere lagen subcellular structuur. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerde stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van een basic SpeRe beeldvorming van de nerveus weefsels met behulp van een commerciële confocal microscopische systeem, uitgerust met een laser wit-licht en een afstembare filter. Wij behandelen de procedures voor de bereiding van de monsters, verwerving van spectrale gegevens en beeldverwerking voor het verkrijgen van nanostructural informatie.
Inleiding
In de zoogdieren zenuwstelsel biedt myeline snelle zenuw geleiding en axonale integriteit door het enwrapping van de axon vezels met meerdere lagen membraanachtig omhulsels. Zijn meerdere lagen structuur bestaat uit afwisselende nanoschaal dun-films samengesteld uit plasma membranen (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), en extracellulaire ruimte (~ 7 nm)1,2. Optische microscopie, met inbegrip van de recente Super resolutie microscopie, zijn niet geschikt voor het observeren van de nanoschaal myeline dynamiek als gevolg van hun onvoldoende resolutie als gevolg van optische diffractie3,4,5. Hoewel elektronenmicroscopie de fijne details van de myeline nanostructuur bieden kan, is het niet compatibel met de levende biologische systemen als gevolg van sterk invasieve staalvoorbereiding waarbij chemische fixatie en ultrasectioning6,7 . Tot voor kort, is er geen techniek toepassing op nanoschaal dynamiek van myelinated axonen in situte observeren.
Shain et al. eerder gemeld dat myelinated axonen kleurrijk licht reflectie8vertonen. Door het aannemen van de spectroscopische analyse van het gereflecteerde licht, hebben we een nieuwe beeldvorming modaliteit voor de nanoschaal beeldvorming van myelinated axonen, genaamd spectrale reflectometrie (SpeRe)9bedacht. SpeRe is gebaseerd op de inmenging van de dunne-film die zich voordoen in de multi-gelaagde structuur van de myelineschede (Figuur 1). Door middel van optische simulatie op verschillende axonen, we hebben aangetoond dat het spectrum van de reflectie een periodieke functie van golfgetal en de periodiciteit (
) is omgekeerd evenredig met de diameter van de axon (d). Deze eenvoudige relatie (
) biedt facile kwantificering van axon diameter van de SpeRe gegevens. Gebruik makend van dit, onthuld wij het overwegend axon bolling onder licht traumatisch hersenletsel in onze voorafgaand verslag.
Het SpeRe systeem is gebaseerd op confocale microscopie en bestaat uit een gespecialiseerde laserbron en filters (Figuur 2). De invoerbron is een wit-light laser, verstrekken van breedband spectrale uitgang voor infrarood regio's zichtbaar. Voor de spectrale scan, het systeem is uitgerust met twee akoestisch-optische apparaten: een akoestisch-optische afstembare filter (AOTF) voor het leveren van een geselecteerde golflengte van de breedband ingangsbron en een akoestisch-optische balk splitter (AOBS) voor de geselecteerde begeleiden weerspiegeld golflengte naar de detector. De software voor hyperspectrale confocale microscopie biedt (Zie Tabel van materialen) een aanpasbare spectrale scan-optie om opeenvolgend verwerven de reflectiecoëfficiënt beelden bij verschillende input golflengten. Bovendien, kan chromatische aberratie kritisch mengen in de spectrale meting; Daarom wordt gebruik van een objectief apochromat aanbevolen.
Wit-licht lasers produceren een ongelijke spectrale vermogen van de nota, en de optische onderdelen ook invloed hebben op de spectrale profiel. Daarom moeten de verworven spectra worden gekalibreerd voor de verdere kwantitatieve analyse. Een beschermde zilveren spiegel wordt het meestal gebruikt als een verwijzing, waarin een bijna constante reflectie (> 97%) over de volledige zichtbare gebied. De verworven spectra worden vervolgens gedeeld door de spectra van de verwijzing van de spiegel.
De spectrale stap-grootte voor de spectrale scan bepaalt de snelheid van de overname; Dus, moet worden geoptimaliseerd. Aangezien een grotere axon een hogere spectrale periode heeft, vereist het fijnere spectrale bemonstering. Een axon met een diameter van 10 µm, een van de grootste fysiologische axonen, heeft bijvoorbeeld een spectrale periode van ~ 8 nm. Door Nyquist bemonstering criteria toe te passen we gebruikt de spectrale voorbeeldinterval van 4 nm ter dekking van alle fysiologische axonen in de muis nerveus weefsels. Deze aanpak meestal neemt enkele seconden voor een volledige spectrale scan en dus niet geschikt voor in vivo toepassingen, waar fysiologische beweging (b.v. ademhaling en hartslag) interfereert stabiele spectrale acquisitie. Wij eerder dit probleem opgelost door het implementeren van een aangepaste rechtop Microscoop, ontworpen om het volledige spectrum voor elk punt met behulp van een array spectrometer (overname snelheid ≈ 30 ms per pixel) verwerven.
In dit verslag, beschrijven we een gedetailleerd protocol op de imaging SpeRe op een vaste brain slice, die kan worden uitgevoerd in een commerciële hyperspectrale Microscoop (Zie Tabel van materialen). Aldus, kan het protocol worden uitgevoerd door onderzoekers zonder expertise in optische instrumentatie. Wij behandelen ook de mogelijke problemen en probleemoplossing voor overname en analyseren van SpeRe gegevens.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Sungkyunkwan Universiteit.
1. de monstervoorbereiding
Opmerking: Autoclaaf alle chirurgische instrumenten vóór hun dierlijke behandeling. Alle chirurgische prestaties in een ruimte gewijd aan chirurgische ingrepen verrichten. Steriele chirurgische jassen en handschoenen moeten gedragen worden door al het personeel in de chirurgische kamer te allen tijde.
-
Weefsel fixatie
- Twee 10 mL spuiten, die elk gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS voor te bereiden.
- Anesthetize van een 7-12-weken oude muis, (C57BL/6J of geen muis lijnen met beide geslachten) door het toedienen van een mengsel van zoletil en xylazine (1:1, 20 mg/kg per stuk) of een alternatieve geschikt verdoving regime (b.v., mix van 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine) met een intraperitoneale injectie.
- Zodra de muis bereikt een chirurgische vliegtuig van anesthesie (gebruik de teen snuifje-respons methode), bloot het hart door het afsnijden van de huid en de ribbenkast met een schaar.
- Snip het juiste atrium met een kleine schaar te afvoer van het bloed en de oplossing van het PBS en PFA opeenvolgend door het linkerventrikel perfuse met een naald (perfusie tarief = 4 mL/min, volume = 10 mL voor elke oplossing).
Opmerking: De muis wordt stijf als de procedure is voltooid. Het gebruik van oog zalf of sterilisatie is niet nodig omdat de procedure terminal is. De fixatie procedure kan worden overgeslagen. Deze stap wordt echter aanbevolen om te minimaliseren van structurele vervormingen met inbegrip van mechanische weefselschade en ischemische axonale zwelling. Voor meer informatie over weefsel fixatie, verwijzen naar het artikel door Gage, G. J. et al. 10
-
Voorbereiding van het segment van de hersenen
- Decapitate de muis met een chirurgische schaar via de ventrale borststuk en buik.
- Verwijder de hoofdhuid en het beenvlies met behulp van een voldoende kleine schaar tot volledig bloot de schedel.
- Het voorhoofdsbeen breken en snijd de schedel langs de Sagittaal hechtdraad uit het occipitale bot met behulp van kleine schaar met zorg niet aan de hersenen beschadigen.
- De schedel en de dura mater opeenvolgend met fijne pincet voorzichtig te verwijderen.
- Pak de hersenen met behulp van een zachte kunststof lepel, verzorgen niet om schade aan het weefsel.
- Spoel en geniet van de uitgepakte hersenen in een 4% PFA-oplossing gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Snijd de vaste hersenen in 100 – 150 µm secties met behulp van een vibratome.
Opmerking: Voor nadere bijzonderheden over de voorbereiding van het weefsel, verwijzen naar het artikel door Segev et al. 11. voor latere procedures, het weefsel moet worden gesneden in secties dunner beeldscherm mogelijk dan de dikte van het tussenstuk.
-
Montage van het segment van de hersenen
- Bereiden 1 glasplaatje en 2 vierkante cover glazen (22 × 22 × 0,17 mm) voor elk segment van het weefsel.
- Één van de vierkante cover-bril in de helft gesneden (twee rechthoekige stukken) met behulp van een glassnijder.
- Bevestig de twee van de gehalveerde cover bril met behulp van een super lijm op het dia-glas.
Opmerking: De ruimte tussen de twee gehalveerde bril moet iets groter dan de grootte van het segment van het weefsel. - Oogst van het segment van de hersenen met een borstel of een pipet en leg het weefsel op het glas van de dia tussen het tussenstuk. Wees voorzichtig niet te vouwen van het weefsel.
- Breng 100 μl van PBS op het oppervlak van het weefsel.
- Plaats de andere vierkante cover glas op de top van het weefsel. Vermijd het insluiten van luchtbellen tijdens deze etappe.
- Seal rond het glas van de cover met behulp van een nagellak (of als alternatief geschikt lijmen) ter voorkoming van verdamping van PBS en verontreiniging door stof tijdens de daaropvolgende imaging-sessie.
Opmerking: De experimentator kan onderbreken in dit stadium.
2. kalibratie
- Inschakelen van de Microscoop ten minste 1 uur vóór de beeldvorming toe thermische stabilisatie van de laser bron (Zie Tabel van materialen). Vervolgens zet de software voor het scannen van spectrale (Zie Tabel van materialen) en klik op de knop ophalen op de bovenkant van GUI (Figuur 3a).
- Inschakelen van de sluiter van de software voor de wit-light laser (WLL) en fotomultiplicator (bet) (Figuur 3a).
- Selecteer de xyΛ modus op de drop-down lijst in de Modus van de overname, dan de invoermodus laser wordt automatisch gewijzigd van constante procent in Constant vermogen. Schakel het selectievakje automatische SPverkeer. En stel vervolgens de spectrale venster van de input laser 470-670 nm en de spectrale stap-grootte naar 4 nm op Λ-excitatie Lambda Scan instellingen (Figuur 3b).
- Stel in het spectraal bereik van bet op 450-690 door erop te dubbelklikken of het verplaatsen van de balk voor aanpassing voor spectraal bereik (Figuur 3 c).
Opmerking: Deze spectrale moet omvatten de volledige bandbreedte van de ingangsbron. - Selecteer een water-immersie objectief, naar behoren met een hoge numerieke diafragma (nb > 0,7) en geef een willekeurige waarde aan de bet en laser macht om AOBS configuratie en Live scannen knop te activeren. Schakel de optische weglengte door het controleren van de reflectie in de AOBS configuratie (afbeelding 3d).
- Monteren van een referentie-spiegel (Zie Tabel van materialen) in het werkgebied van de Microscoop. Het spiegelend oppervlak moet tegen de objectief worden geconfronteerd. Als het is niet gemakkelijk om te zetten van de spiegel in het werkgebied van de Microscoop, obligatie een spiegel op de vlakke plaat (bijvoorbeeld dia glas).
- Controle het stadium van de Microscoop het brandvlak aan het spiegelend oppervlak worden uitgelijnd.
- De bet winst en de kracht van de laser overweegt het dynamisch bereik van de detector aanpassen en wijzig vervolgens de invoermodus laser van constante procent Constant vermogen.
Opmerking: Zoals gebruikelijk, een bet winst van 500 (V) en een relatieve laser kracht van 0,1% worden gebruikt bij 570 nm. - Bevestigen in een pseudo-kleurmodus om te controleren of er geen verzadiging in het golflengtegebied. Als verzadiging wordt waargenomen, verlaagt u de kracht van de laser (Figuur 3a).
- De overname van Lambda Scan uitvoeren
- De spiegel uit het werkgebied verwijderen en herhaal de zelfde overname zonder een monster met het oog op de donkere verwijzing (d.w.z., donkere offset).
- De gegevens in een Multistacked TIF -indeling opslaan.
3. SpeRe Beeldacquisitie
- Plaats het gemonteerde weefsel in het werkgebied van de Microscoop. Gebruik de breed-gebied fluorescentie-modus door middel van een oog-delige ruwweg, wilt uitlijnen het weefsel naar het brandvlak van het objectief.
- Met de Live scannen op het stadium van de Microscoop voor het uitlijnen van het brandvlak naar de regio van belang in het weefsel te bepalen. Om te voorkomen dat de achtergrondgeluiden van de cover slip, door de regio van de doelstelling van ten minste 15 μm diepte te selecteren in de glas-weefsel-interface.
- Het verwerven van de spectrale afbeeldingsstapel voor de regio van de doelgroep met de hierboven beschreven procedure zoals beschreven in stappen 2.1-2.10.
- De gegevens voor het weefsel en de donkere verschuiving in Multistacked TIF -indeling opslaan.
Opmerking: De experimentator kan onderbreken in dit stadium.
4. verwerking en analyse van het beeld
- Open de spectrale gegevens (multistacked TIF) voor de spiegel van de verwijzing en het hersenweefsel in ImageJ.
- Selecteer de ROIs (regio's van belang) voor de geopende afbeeldingsstapels — het centrale gebied voor de spiegel van de verwijzing en het segment van een axon fiber voor het hersenweefsel.
- De ruwe spectra verwerven voor de geselecteerde ROIs door lopend beeld → stapels → Plot z profiel ImageJ menu.
- Open de donkere offset gegevens, een genomen voor de spiegel van de verwijzing en de andere genomen voor het hersenweefsel.
- Verwerven van de spectra voor de donkere verschuivingen door lopend beeld → stapels → Plot z profiel ImageJ menu.
- Sla alle de verworven spectra met behulp van de opties voor kopiëren en plakken .
Opmerking: Voor SpeRe imaging, gebruik van de centrale imaging veld te minimaliseren off-axis optische aberraties wordt aanbevolen. De axon vezels kunnen worden structureel heterogene langs hun lengte. Vandaar, de ROI op een kleine axon segment selecteren, meestal < 5 µm, tot een minimum beperken van partiële-volume artefact is aanbevolen.
5. correctie van de basislijn en SpeRe signaalanalyse
- Aftrekken van de offset spectra van de spectra van de referentie-spiegel en de weefsels van de hersenen.
- Normaliseren elk spectrum door het verdelen van de maximumlichtsterkte van het spectrum.
- Verdeel het genormaliseerde spectrum van het axon door de genormaliseerde spectrum van de referentie-spiegel en aftrekken van de DC-offset uit het genormaliseerde spectrum.
- Meten van de frequentie golfgetal door het aanbrengen van de verworven spectrum aan een sinusoïdale curve (Zie Tabel van materialen) en vervolgens omzetten in de verworven golfgetal periodiciteit door wederkerige nemen.
- De periodiciteit golfgetal omzetten in de diameter van de axon met behulp van de vergelijking in Figuur 4 c.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens het protocol, een vaste hersenen-segment was bereid met exogene kleuring, een fluorophore van myeline-targeting (Zie Tabel van materialen). SpeRe imaging werd uitgevoerd op het segment van de hersenen met behulp van een commerciële hyperspectrale confocal microscoop in combinatie met confocal fluorescentie imaging (figuur 4a). Voor SpeRe, input optische intensiteit werd ingesteld op 5 μW/µm2 met een pixel Nadruktijd ~ 1 µs....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
SpeRe is een nieuwe label-vrije imaging modaliteit op basis van spectrale interferometrie, die voor het eerst biedt de nanoschaal informatie in levende myelinated axonen. In het huidige protocol voor de verwerving, de ruimtelijke resolutie voor de axon diameter is in de orde van 10 nm. Bovendien SpeRe maakt gebruik van de ordes van grootte lager lichte dosis in vergelijking met andere super resolutie microscopies; het is dus vrij van fototoxiciteit en photobleaching. SpeRe zou voorzien in een nieuwe laan studeren nanosch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen: Kwon van J. en M. Choi zijn uitvinders van de octrooi-hangende technologie in dit artikel beschreven.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door het Institute of Basic Science (IBS-R015-D1) en door fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2017R1A6A1A03015642).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Glass cutter | - | - | Kan worden gekocht in een lokale buurtwinkel of online winkels. |
| Nagellak | - | - | Kan worden gekocht in een lokale buurtwinkel of online winkels. |
| Apochromat objectief 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersie type |
| Fluoromeilin Groen | Thermo Fisher | F34651 | Alternatief kan Fluoromeilin Rood (F34652) worden gebruikt. |
| Leica SP8 TCS microscoop | Leica Microsystems | SP8 | Zie de "Configuratie van microscoop" in de Inleidingsectie voor details. |
| Beeldvormingssoftware | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Spiegel | Thorlabs | PF10-03-P01 | Gecoat met beschermd zilver. |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Dekglas | Thermo Fisher | 3306 | Dikte: #1 (0.13 tot 0.17 mm) |
| Glijglas | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Dikte: ~1 mm |
| Superlijm | Henkel | Loctite 406 | Gebruik een doseerapparaat om contact met de huid of ogen te voorkomen. |
| Spuitpomp | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| Wit-licht laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 is stopgezet en vervangen door EXU-6. |
Referenties
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832(2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024(2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
