Methodenartikel

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

DOI:

10.3791/57978

⸱

6 juli 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Wright State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontluikende gist is wijd verbeid gebruikt als een model in het bestuderen van eiwitten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens. Genoom-brede genetische screening is een krachtig hulpmiddel gebruikte gist studies. De expressie van een aantal neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten in gist zorgt ervoor dat de cytotoxiciteit en statistische vorming, Recapitulerend bevindingen gezien bij patiënten met deze aandoeningen. Hier beschrijven we een methode voor het screenen van een model van de gist van de Amyotrofische laterale sclerose-geassocieerde proteïne FUS voor parameters van de toxiciteit. In plaats van transformatie, berust dit nieuwe platform voor screening op de paring van de gist te introduceren een gekleed bibliotheek van plasmiden in het model van de gist. De paring methode kent twee duidelijke voordelen: ten eerste, het is uiterst efficiënt; Ten tweede, de vooraf getransformeerde gekleed bibliotheek van plasmiden kan worden opgeslagen voor de lange termijn als een voorraad van glycerol en snel toegepast op andere schermen zonder de arbeidsintensieve stap van transformatie naar het model van de gist telkens. We laten zien hoe deze methode kan met succes worden gebruikt aan het scherm voor de genen die de toxiciteit van FUS wijzigen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae heeft wijd gebruikt in fundamenteel wetenschappelijk onderzoek1 om te begrijpen van de cellulaire processen rechtstreeks verband houdt met ziekten bij de mens. Bovendien, het is gebruikt als een modelorganisme bestuderen van menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten, zoals die in verband met de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale sclerose (ALS)2. Een voordeel van de gist-model is het gemak waarmee een genoom-brede scherm kan worden uitgevoerd om te identificeren van cellulaire routes in verband met de toxiciteit van ziekte-gerelateerde eiwitten, waardoor inzicht in het mechanisme van hun toxiciteit. Één dergelijke scherm heet een overexpressie bibliotheek scherm, waarin elk van de 5.500 gist genen in een gekleed bibliotheek is omgevormd tot een model van de gist om te identificeren welke genen toxiciteit wanneer overexpressie kunnen wijzigen. Deze screeningmethode is succesvol toegepast in de modellen van de gist van meerdere neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten, met inbegrip van huntingtin voor de ziekte van Huntington3, α-synuclein voor de ziekte van Parkinson4,5 , Aβ voor Alzheimer's disease6, FUS en TDP-43 voor ALS7,8,9. Terwijl het gebeurt meestal in een high-throughput wijze10, is de meest arbeidsintensieve stap van het scherm afzonderlijk 5.500 gist genen uit een gekleed bibliotheek transformeren. Deze stap moet worden uitgevoerd telkens wanneer die de screening wordt herhaald, en wanneer een nieuw opgerichte gist-model moet worden bestudeerd. Het is belangrijk om te vinden van een meer efficiënte manier om deze taak te volbrengen.

Gistcellen kunnen stabiel in zowel haploïde en diploïde vormen bestaan. Er zijn twee tegenover paring soorten haploïde cellen, paring type een en α. haploïde cellen van elke paring Typ produceren en afscheiden van hun eigen specifieke paring feromoon, waarop alleen de tegenovergestelde paring type cellen reageren. Hierdoor wordt de paring tussen een en α cellen tot stabiele diploïde cellen, een/α. Dit proces is spontaan en hoogefficiënte11. We kunnen profiteren van deze unieke levenscyclus van S. cerevisiae in te voeren van de plasmide-bibliotheek. Meer in het bijzonder, zal elk gen in de gekleed plasmide-bibliotheek worden omgezet in haploïde cellen van één paring type, dat wil zeggen, α-cel. Deze cellen met de genen van de bibliotheek zal dan in glycerol voorraad in een gekleed 96-Wells-indeling worden opgeslagen. Voor elk gist-model dat moet worden onderzocht, kunnen gistcellen die de bibliotheek genen bevatten worden ontdooid uit de voorraad van glycerol en de screening kan worden gedaan door de paring met het model van de gist van belang in het tegenovergestelde paring type, dat wil zeggen, paring type een. Dit idee van het gebruik van de paring aan het samenbrengen van twee genen in gist is niet nieuw. Het is met succes toegepast in de gist van de high-throughput screening van de twee-hybride, in die een aas bouwen (dat wil zeggen, Gal4-DNA-bindende domein fusies) in één paring type is samengebracht door paring met een prooi construct uit een gekleed bibliotheek 12. deze strategie heeft echter nooit zijn toegepast in overexpressie bibliotheek vertoningen, die altijd gebruik van traditionele transformatie methoden gemaakt hebben.

Ons laboratorium gevestigd eerder een model van de gist van de ALS-geassocieerde proteïne FUS7. Door overexpressie bibliotheek screening met de transformatie methode ontdekten we vijf gist genen(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1en VHR1) die het redden van de toxiciteit van FUS wanneer overexpressie. Deze bevindingen werden onafhankelijk van elkaar met een gelijkaardige studie bevestigd door een andere groep8. hUPF1, een menselijke homolog van ECM32, werd later aan het onderdrukken van de toxiciteit in primaire neuronale cellen13 en in een diermodel van ALS14 ook aangetoond. Met behulp van deze vijf genen als bewijs van beginsel, we laten zien dat alle vijf genen ook FUS toxiciteit redden, wanneer zij worden binnengebracht in het model van de gist FUS door paring. Omdat gistcellen met de genen van de bibliotheek kunnen worden permanent in glycerol voorraad opgeslagen en nieuw leven ingeblazen wanneer nodig, zal deze paring gebaseerde methode de tijdrovende stap van transformatie telkens die de bibliotheek worden gescreend moet tegen verwijderen. Omdat de paring is zeer efficiënt met geen plasmide transformatie betrokken, vermindert deze strategie ook aanzienlijk de kosten in verband met reiniging en transformatie van een grote plasmide-bibliotheek. We zullen met succes deze methode toepassen op een bibliotheek screening tegen gist model van FUS.

De procedure voor paring gebaseerde screening wordt kort beschreven in Figuur 1. In eerste instantie is de gekleed plasmide-bibliotheek omgevormd tot een haploïde giststam van het type α met een hoge gegevensdoorvoer gist transformatie protocol waarin elk putje van een 96-wells-plaat gist getransformeerd met een specifieke bibliotheek plasmide bevat paring. Deze collectie van getransformeerde gist wordt opgeslagen als een glycerol voorraad die kan worden ontdooid en nieuw leven ingeblazen voor gebruik later. Het model van de gist van belang, in dit geval FUS toxiciteit, moet worden gegenereerd in een haploïde giststam met de tegenovergestelde paring type (type paring een). In een high-throughput wijze met behulp van steriele 96-pins replicators, zijn de FUS stam giststammen met de bibliotheek van de plasmide overgedragen aan 96-wells-platen met rijke media en kunnen van de stuurman. Na de paring, een klein volume van elk putje van de paring cultuur wordt overgedragen aan 96-wells-platen met synthetische dropout media in welke alleen diploïde gist met zowel de FUS en bibliotheek genen kunnen groeien. Een robotic spotten machine wordt vervolgens gebruikt voor het overzetten van gist cultuur van elk putje op agar platen waar de uitdrukking van FUS en de genen van de bibliotheek wordt geïnduceerd.  Bovendien is gist cultuur gespot om agar platen waar FUS en de bibliotheek genen niet worden uitgedrukt. Na groei op agar platen, genen die redden of verergeren FUS toxiciteit worden geïdentificeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: De hier beschreven protocol is ontworpen voor het screenen van bibliotheek plasmiden vervat in tien 96-wells-platen maar kunnen worden geschaald omhoog of omlaag dienovereenkomstig. Het protocol moet worden herhaald om te voltooien van de hele bibliotheek screening. Gewoonlijk, kan screening tegen 10 platen van bibliotheek genen telkens comfortabel worden behandeld door 1 persoon.

1. voorbereiding van de 96-Wells gist transformatie

Opmerking: Deze stap wordt gedaan als eerder beschreven7,10.

  1. Aliquot 5 µL (ongeveer 50 – 100 ng) van plasmide DNA uit een mediawisselaar gekleed plasmide in ieder putje van een ronde bodem 96-wells-plaat.
    Opmerking: Een voorbeeld van een dergelijke bibliotheek zou een gist gene overexpressie bibliotheek10.
  2. Gist-pepton dextrose (YPD) media in een maatkolf van 500 mL met een kolonie (2 – 3 mm doorsnede) van het haploïde giststam W303α 150 mL beënten. Incubeer ze 's nachts bij 30 ° C met schudden (200 rpm).
  3. De volgende ochtend, meten de OD600 van de overnachting cultuur en verdunnen van de cultuur van de gist tot OD600 = 0.1 in (maximaal) 2 L van YPD. Incubeer bij 30 ° C met schudden (200 rpm) voor ~ 5 h tot de cultuur OD600 bereikt = 0,4-0,6.

2. gist transformatie

  1. Oogst de cultuur van de gist door 8 steriele 250 mL centrifuge flessen vullen en centrifugeren hen bij kamertemperatuur bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.
    Opmerking: Voer alle centrifugeren stappen uit bij kamertemperatuur.
  2. Wassen van de gist met steriele-gedistilleerd H2O. Hiervoor Voeg 100 mL steriele H2O aan elke centrifuge fles en vortex te resuspendeer de pellet cel. De gewassen cellen combineren tot 2 flessen en centrifuge hen bij 3000 x g gedurende 5 min. af het supernatant giet.
  3. Wassen van de cellen in elke fles in 100 mL 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) en centrifugeer ze bij 3000 x g gedurende 5 min. Pour uit het supernatant.
  4. Tijdens het centrifugeren, kook 5 mL zalm sperma DNA (10 mg/mL) bij 100 ° C, met behulp van een blok kachel voor 3 min en vervolgens afkoelen in de ijskast.
  5. Resuspendeer de pellet cel in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in elke fles, combineren de geresuspendeerde cellen en hen overbrengen in een maatkolf van 150 mL. Voeg 5 mL van de vooraf afgekoelde zalm zaadcellen DNA en na het bebroeden bij 30 ° C met schudden (225 rpm) voor 30 min.
  6. Giet het mengsel van de cel in een steriele wegwerp reagens reservoir en 35 µL van het mengsel van de cel met behulp van een meerkanaalspipet, overdragen aan elk putje van de ronde onderkant 96-wells-plaat met de bibliotheek plasmide DNA. Vortex de 96-wells-platen met behulp van een plaat-vortexer voor 1 min bij 1000 omwentelingen per minuut. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 30 ° C zonder schudden.
    Opmerking: Niet stapelen de platen, zodat de warmte efficiënter kunt overbrengen. We hebben ontdekt dat vortexing de 96-wells-platen op 1000 rpm veroorzaakt geen vloeistof te morsen uit de putten, maar een veilige vortex snelheid moet worden getest voordat u de stap uitvoert.
  7. Bereiden in een maatkolf van 200 mL van de buffer van de transformatie met een eindconcentratie van 40% PEG3350, 10% DMSO en 0,1 M LiOAc. Voorbereiden van de transformatie buffer onmiddellijk vóór gebruik en meng het door schudden.
  8. Verwijderen 96-wells-platen van de 30 ° C incubator en meng ze voor 30 s 1000 rpm met behulp van de vortexer van de plaat. 125 µL van de buffer van de transformatie op toevoegen aan elk goed en vervolgens de vortex de platen voor 1 min 1000 rpm.
  9. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 30 minuten en dan het verwarmen van schok de gist door het plaatsen van de platen in een incubator 42 ° C gedurende 15 minuten.
    Opmerking: Niet stapelen de platen.
  10. De platen gedurende 5 minuten op 3000 x gcentrifugeren. De buffer van de transformatie uit de putten verwijderen door het omkeren van de platen over een prullenbak en krachtig dumping de buffer van de platen. Snel wissen de omgekeerde platen op een schone papieren handdoek te verwijderen van een vloeistof op de bovenkant van de platen.
  11. Spoel de cellen door toe te voegen aan de platen 200 µL van het minimale uitval middellange overeenkomen met selecteerbare markering op de bibliotheek plasmide.
    Opmerking: We gebruikt een synthetische Ura-medium.
  12. De platen gedurende 5 minuten op 3000 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie over een prullenbak zoals in stap 2.10.
  13. Voeg 160 µL van minimale Ura-medium met 2% glucose. Vortex de platen voor 1 min op 1000 rpm en hen bij 30 ° C gedurende 48 h zonder schudden uit te broeden. Na 48u, rekening mee dat een pellet van getransformeerde gist zichtbaar aan de onderkant van elk putje.
  14. Met behulp van een vloeistof dispenser, voeg 100 µL van Ura-media bevatten glucose in ieder putje van een nieuwe reeks van 96-wells-platen.
  15. Vortex de platen met de getransformeerde gist (uit stap 2.13) bij 1000 t/min voor 30 s. met behulp van een steriele kunststof 96-pins replicator, plaatst u de pinnen in de putjes met de getransformeerde gist en enten ze vervolgens in de overeenkomstige putten van de nieuwe platen gevuld met media. Incubeer de nieuwe platen bij 30 ° C gedurende 24 uur.
    Opmerking: Als u werkt met 10 platen, het medium kan ook achterwege worden gelaten handmatig met behulp van meerkanaals pipetten.
  16. Na 24 h, moet een pellet van gist zichtbaar zijn in de bodem van elk putje met succes getransformeerd gist. Als u wilt deze giststammen opslaan als glycerol voorraden, voeg 50 µL 50% glycerol aan elk putje, vortex de platen voor 30 s bij 1.000 tpm, verzegelen van de platen met tape afdichten en bevriezen ze bij-80 ° C.
    Opmerking: De bovenstaande stappen moeten slechts eenmaal worden uitgevoerd. Toekomstige voorstellingen van verschillende gist modellen tegen het dezelfde bibliotheek wegwerp reagens reservoir te beginnen uit de voorraden van glycerol en gaan onmiddellijk uit de onderstaande stappen.

3. paring tussen cellen met bibliotheek genen en Query gist

  1. Nemen om te blazen de bibliotheek stammen uit de voorraad van glycerol, de 96-wells-platen uit de vriezer-80 ° C, verwijderen de afdichtende tape, en laat de gist bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten ontdooien.
  2. Zodra de gist heeft ontdooid, gebruikmaken van een steriele kunststof 96-pins replicator te enten van de voorraden van glycerol 160 µL van verse Ura-media met 2% glucose in 96-wells-platen en hen uit te broeden bij 30 ° C gedurende 24 h. onmiddellijk nadat de bibliotheek stammen worden gebruikt , verzegelen van de platen met tape afdichten, en deze terugsturen naar de vriezer-80 ° C.
  3. Op dezelfde dag de bibliotheek stammen (W303α) zijn ontdooid, enten de query giststam (hier, FUS in W303a) aan 50 mL YPD en 's nachts groeien bij 30 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
  4. De volgende ochtend giet de query giststam een steriele wegwerp reagens reservoir en aliquoot 160 µL van de stam van de query aan elk putje van een 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet.
  5. Met behulp van de vloeistof dispenser, afzien 160 µL van YPD media in elk putje van tien 96-wells-platen. Deze platen later gebruiken voor paring van de query giststam met de gist van de bibliotheek.
  6. Kort vortex de 96-wells-plaat met de stam van de query en vervolgens gebruik een steriele 96-pins replicator overdracht van de query op de platen van de YPD stam.
  7. Kort vortex de bibliotheek stam platen en, voor elke bibliotheek stam plaat, gebruikmaken van een nieuwe steriele 96-pins replicator overbrengen van de stammen van de bibliotheek naar de YPD platen die hebben zijn geënt met de query-stam.
    Opmerking: Cellen in glycerol verliezen hun levensvatbaarheid na meerdere dooi-freeze cycli. Terugkeer van de stammen van de bibliotheek naar de langetermijnopslag (diepvriezer-80 ° C) zo spoedig mogelijk zal houden van de bibliotheek in goede kwaliteit, en klaar voor toekomstig gebruik. Goed onderhouden, kan de voorraad glycerol worden bevroren en ontdooid ten minste 10 keer. Wij raden het ook houden van een werkend exemplaar en back-ups van de voorraad van glycerol. Wanneer de voorraad werken niet werkt, onmiddellijk werken maken een nieuwe kopie van de back-up.
  8. Incubeer de platen van de YPD bij 30 ° C gedurende 24 h. opmerking dat een pellet van gist zichtbaar in de bodem van elk putje na 24 h zijn zal.
  9. Opvulling 96-wells-platen met een minimale uitval medium met 2% raffinose, overeenkomt met de selecteerbare merkers op het plasmide in de query-stam en de bibliotheek plasmide (bijvoorbeeldhier Ura - zijn-).
  10. Gebruikmaken van een steriele 96-pins replicator gist van de YPD paring culturen aan de selectieve media overzetten. Incubeer de 96-wells-platen bij 30 ° C gedurende 48 h; alleen gist cellen die hebben gekruist en gevormde diploïde cellen en dus zowel het query-plasmide bevatten en de bibliotheek plasmide zullen kunnen groeien in deze media. Na 2 dagen, constateren dat een pellet zichtbaar aan de onderkant van de putten.

4. spotten Assay

  1. Na 48u van groei in de raffinose-bevattende selectieve media, ter plaatse de gist op agar platen.
    1. Bereiden van 2 sets van Ura-zijne-dropout platen met 2% agar met behulp van duidelijke polystyreen platen, één met 2% galactose en de andere met 2% glucose.
    2. Vortex de 96-wells-platen voor 1 min bij 1000 omwentelingen per minuut, dan ter plaatse de gist aan de Ura-zijne-dropout platen met 2% galactose en 2% agar (FUS en bibliotheek genen worden veroorzaakt) en aan de Ura-zijne-dropout platen met 2% glucose en 2% agar (FUS en bibliotheek genen onderdrukt) met behulp van een robot spotten machine, waardoor de cultuur in elk goed is bevlekt op de platen van de agar in viervoud (dat wil zeggen, de cultuur in 1 goed is gespot op 4 plekken op de agarplaat).
    3. Na het spotten van, laat de agar platen droog en plaats ze vervolgens ondersteboven in een 30 ° C incubator. Foto de agar platen elke 24 uur opnemen van een snellere/meer gist groei waarin de toxiciteit voor de query stam wordt gered of om een trager/minder groei waarin de toxiciteit voor de query stam wordt verergerd. Incubeer de platen gedurende 4 dagen.
      Opmerking: De cultuur in elk goed kan worden gespot op agar platen 1-op-1, zoals in een vorige transformatie gebaseerde methode10. Echter, de 1-tot-4 hier spotten (die kan worden gemakshalve ingesteld met de robotic spotten machine) aanzienlijk verhoogt de robuustheid van de bepaling door het verminderen van het aantal valse positieven. Positieve hits zijn alleen overwogen wanneer alle 4 kolonies van hetzelfde goed Toon een soortgelijke fenotype.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ALS-geassocieerde proteïne FUS, een RNA/DNA-bindend-proteïne, was eerder studeerde in haploïde gist7,8. Genetische screening met de transformatie gebaseerde methode ontdekt verschillende gist genen die FUS toxiciteit onderdrukken. De menselijke homolog van één van de genen van gist werd later aangetoond te worden effectief in het onderdrukken van de toxiciteit in een primaire neuronale cel en rat model ALS13

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een plasmide overexpressie scherm in gist met paring te introduceren de plasmide-bibliotheek in het model van de gist. Met behulp van deze aanpak, kunnen meerdere gist modellen van neurodegeneratieve ziekte eiwit toxiciteit worden gescreend met behulp van dezelfde collectie van gist getransformeerd met een plasmide-bibliotheek. Het moeizame proces van transformatie hoeft alleen te worden uitgevoerd zodra, na welke hoogefficiënte gist paring wordt gebruikt om de plas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de nadenkende gesprekken met leden van het Ju-laboratorium en Zhong laboratorium, en de financiële steun van de Wright State University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
zalm Sperm DNA (SS-DNA)Sigma-Aldrich  D1626
YPD bouillonResearch Products International (RPI)Y20090
Gegranuleerde AgarFisher SciBP97445
D-(+)-GlucoseResearch Products International (RPI)G32040
D-(+)-GalactoseResearch Products International (RPI)G33000
D-(+)-Raffinose PentahydraatResearch Products International (RPI)R20500
Ammonium SulfaatFisher SciA702-500
Synthetisch Ura- drop out mediumClontech630416
Gist aminozuur drop out supplement -Histidine/-UracilClontech630422
Gist Stikstof Base zonder Aminozuren en Ammonium SulfaatResearch Products International (RPI)Y20060
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher SciS67496
Lithiumacetaat, watervrijFisher SciAC268640010
Polyethyleen Glycol 3350 (PEG-3350)Spectrum Chemical PO125-12KG
96 Pin Replicator ScinomixSCI-5010-OS
Nunc OmniTrayThermo Sci140156
Corning Costar 96 well assay plate, ronde bodem met dekselFisher Sci07-200-760niet behandeld, steriel
Eppendorf Research plus Multichannel PipetteEppendorfTI1369005230-300ul volume
Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block HeatersFisher Sci88-860-023
Eppendorf MixMateEppendorf21-379-00
Eppendorf 5810R CentrifugeFisher Sci05-413-112
Avanti J-26 XPI CentrifugeBeckman393127
MultiFlo FX Multi-Mode DispenserBioTek
Rotor HDA  Singer Instruments

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
  2. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  3. Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
  4. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  5. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
  6. Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
  7. Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052(2011).
  8. Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614(2011).
  9. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
  10. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836(2011).
  11. Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
  12. Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
  13. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
  14. Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gistparingscreening van plasmidenbibliotheekFUS toxiciteitgisttransformatieopslag van glycerolstocksgroei op selectief mediumrobotische spottingagarplaat assaymodel voor neurodegeneratieve ziektenscreening van overexpressie

Gerelateerde artikelen