Methodenartikel

Eenvoudige chirurgische inductie van Conductief gehoorverlies met verificatie met behulp van Otoscope visualisatie en Gedragsclap Startle respons bij ratten

DOI:

10.3791/57993

⸱

26 oktober 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México, 2State Key Laboratory of Marine Pollution (SKLMP), City University of Hong Kong, Hong Kong, 3Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, Hong Kong, 4Department of Physics, City University of Hong Kong, Hong Kong, 5Department of Clinical Oncology, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong, 6Department of Materials Science and Engineering, City University of Hong Kong, Hong Kong

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om een repliceerbaar geleidingsverlies inductie te creëren via chirurgische trommelvlies membraan punctie en verificatie door Otoscoop visualisatie en gedrags beoordeling door Clap Startle.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conductief gehoorverlies (CHL) is een overwegend gehoorstoornis bij de mens. Het doel van het protocol is om een eenvoudige chirurgische procedure te beschrijven voor het induceren van CHL bij knaagdieren. Het protocol demonstreert CHL door trommelvlies membraan punctie. Verificatie van de CHL-chirurgie was door Otoscoop-onderzoek en gedrags beoordeling door Clap schrikreactie-respons, zowel repliceerbaar als betrouwbaar, en zijn eenvoudige methoden om gehoorverlies aan te tonen. De eenvoudige CHL-procedure is voordelig vanwege de reproduceerbaarheid en flexibiliteit van verschillende activiteiten in onderzoek naar gehoorverlies. De beperkingen van inducerende CHL door een chirurgische benadering worden geassocieerd met de leercurve om de chirurgische ingreep en het vertrouwen in Audiologisch onderzoek uit te voeren. Door een gehoorstoornis door CHL te induceren, kan men gemakkelijk de neurale manifestaties en gedrags resultaten van gehoorverlies bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prevalentie van het gehoorverlies bij kinderen en volwassenen is respectievelijk ongeveer 19,5%1 en 15,2%2 . Echter, ongeveer 39,3% van alle pasgeborenen met een abnormale Gehoorscreening krijgen geen corrigerende behandeling zoals gerapporteerd door de centra voor Ziektecontrole3. Gehoorverlies is een algemeen bestudeerde aandoening en het knaagdier is een robuust model voor het bestuderen van normale gehoor-en gehoor aandoeningen4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15. Gehoor aandoeningen zoals Conductief gehoorverlies (CHL) leiden tot een toename van de korte termijn synaptische depressie in de auditieve cortex4, wat resulteert in onlagere psychometrische hellingen geassocieerd met frequentiemodulatie detectiedrempels 5. geleidende gehoorverlies modellen door chirurgische verwijdering/verplaatsing van de malleus, trommelvlies membraan (TM) punctie of oordopje worden gemakkelijk gebruikt en maken de snelle inductie van het gehoorverlies model5,14 ,15,16,17,18. Het doel van dit protocol en de huidige methode is om een eenvoudig en reproduceerbaar CHL-model bij knaagdieren aan te tonen.

Het huidige protocol is goedkoop (≈ USD $300 met alle tools), en gemakkelijk te gebruiken voor verschillende onderzoeksactiviteiten. De rat heeft gedetailleerde beoordelingen van de anatomie van het middenoor19,20,21,22,23, chirurgische benaderingen24, modellen in otitis media25, 26,27 en TM punctie regeneratie16,17,18,28,29,30, waardoor het een ideaal model om te studeren Gehoorverlies. Hier wordt een eenvoudige CHL-inductie procedure beschreven met verificatie door Otoscoop en gedrags beoordeling met Clap schrikreactie respons bij ratten, die vervolgens kunnen worden gebruikt om extra gevolgen van gehoorverlies te onderzoeken. De CHL-procedure wordt geïnduceerd door een chirurgische punctie van de TM. Verificatie van de CHL-procedure wordt uitgevoerd door Otoscoop-visualisatie om de afwezigheid van de TM te bepalen. Gedrags beoordeling wordt uitgevoerd door een hoge decibel (dB) geluidsdrukniveau (SPL) hand-clap. Deze methode is eerder toegepast in een verscheidenheid van knaagdieren. Het is gemakkelijk te repliceren, produceert robuuste psychometrische verschillen en veranderingen in neurale fysiologische reacties4,5,16,17,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie en procedures werden goedgekeurd door de ethische comités voor onderzoek van dieren van de Universiteit van Hongkong, de University of Hong Kong en het Department of Health van de speciale administratieve regio Hongkong.

1. dieren

  1. Gebruik Sprague-Dawley (SD) ratten van twee maanden (N = 90, 200-250 g).
    Opmerking: knaagdieren werden verstrekt door de geaccrediteerde laboratorium Animal Unit van de Universiteit van Hong Kong.
  2. Houd de ratten onder een constante temperatuur van 25 °C en 60-70% vochtigheid bij de onderzoekseenheid voor laboratoriumdieren.
  3. Huis knaagdieren in 12/12-h licht/donker cycli met toegang tot voedsel en drinkwater, ad libitum.
  4. Acclimate knaagdieren in de huisvesting omgeving voor ten minste één dag voorafgaand aan CHL chirurgie.
  5. Neem het knaagdier op bij de Scruff en anesthetiseer het knaagdier met een cocktail van ketamine en xylazine (respectievelijk 80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg) via intraperitoneale injectie (Combineer 1,0 mL ketamine met 0,5 mL xylazine als eindconcentratie).
    Opmerking: gebruik een spuit van 1 mL met een 23-25G naald. Injecteer ongeveer 0,2 mL per 100 g lichaamsgewicht van de rat gedurende 30 minuten anesthesie.
  6. Voer de teen pinch om pijn sensatie te controleren en om de juiste anesthesie te bevestigen. Een reactie op diepe teen knijpen (door terugtrekking van Hind ledemaat) duidt op onvoldoende anesthesie.

2. chirurgische installatie

  1. Steriliseren van alle apparatuur in een autoclaaf of hete glazen kraal sterilisator vóór het begin van de operatie. Reinig het chirurgische gebied met 70% ethanol.
  2. Gebruik latex handschoenen en Labcoat voordat u begint met de procedure.
  3. Plaats een steriele chirurgische draperen op de schone Bank (Figuur 1a).
  4. Steriliseren micro-schaar en een Otoscoop voorafgaand aan de operatie om oorontsteking te minimaliseren (Figuur 1b).
  5. Plaats de micro-schaar en Otoscoop in het steriele gebied.
  6. Plaats het knaagdier in het chirurgische veld en in lijn met de chirurg.
  7. Ga verder met de chirurgische inductie van CHL.

3. chirurgische inductie van Conductief gehoorverlies

  1. Plaats de staart en het hoofd van het knaagdier uitgelijnd in een liggende positie, hoofd dichtst bij de chirurg.
  2. Visualiseer het linker-en rechteroor van het knaagdier onder Otoscoop om een gezond tympanisch membraan te garanderen (Figuur 2a). Evalueer zowel het rechter-als het linkeroor van elke knaagdier om de gezonde toestand te controleren voorafgaand aan de CHL-inductie.
  3. Grijp de oorhelix en verleng de uitwendige gehoorgang (d.w.z. gehoorgang, uitwendige gehoorgang, in dit auditieve kanaal) om de binnenkant te verduisterd en door diepte te verduisterd. Hier wordt het gehoorkanaal loodrecht op het oppervlak van de TM aangebracht.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de gehoor cannel nu direct parallel is en de TM een rechte hoek vormt met de as van het inbrengen van de micro-schaar. Het zal worden gevisualiseerd als een zwarte buis zonder licht. Soms moet de gehoorgang in een lichte hoek worden gekanteld, ongeveer 15 ° naar het vlakke oppervlak van de schedel. Dit zorgt ervoor dat de chirurg hand loodrecht staat op het oppervlak van de TM.
  4. Introduceer de micro-schaar in het midden van het gehoorkanaal aandacht niet te skim of Nick het weefsel van de gehoorgang en ga iets, ongeveer ≈ 5 mm van het centrum van de duisternis, voorwaarts door zachtjes door het midden van de TM.
    Opmerking: TM-punctie kan worden bevestigd door een pop-geluid wanneer de micro-schaar tips de TM prik. Het popping geluid kan worden gehoord op ongeveer ≈ 2 min 52 s in de video. Dit is geen schaar klank; Dit is een TM punctie geluid. Zoals gemeten na de analyse, is de "pop" ongeveer ≈ 20 dB SPL groter dan het achtergrondgeluid, zoals opgenomen door een microfoon met hoge frequentie. Het is niet nodig om het "pop"-geluid in deze mate te verifiëren, Otoscoop-visualisatie is voldoende. De onderzoeker moet mogelijk oefenen om ervoor te zorgen dat tijdens elke CHL-procedure een ' pop ' wordt gehoord.
  5. Open onmiddellijk de veerbelaste micro-schaar en draai drie keer na het prikken van de TM om de verplaatsing van het hoofd van de malleus weg van de TM te verzekeren (alleen als de verplaatsing van malleus gewenst is).
  6. Verwijder de micro-schaar en plaats het knaagdier onder de Otoscoop voor visualisatie.
    Opmerking: het is belangrijk op te merken dat er na de chirurgische ingreep geen significante bloeding optreedt. Euthaniseer het knaagdier en ga niet naar de gedrags beoordeling als er bloedingen optreden.
  7. Induceren van bilaterale CHL door verder te gaan zoals hierboven in het tegenovergestelde oor.

4. otoscope visualisatie

  1. Bevestig een succesvolle CHL-operatie met een Otoscoop met een kleine diameter speculum om het middenoor van de knaagdieren te visualiseren.
  2. Evalueer elke knaagdier voorafgaand aan en na de CHL chirurgische ingreep onder de Otoscoop. Zorg voor een bevestiging van Normal TM (Figuur 2a) en beschadigde TM na CHL-inductie (Figuur 2b).
  3. Postoperatieve verzorging voor het knaagdier
    1. Plaats het knaagdier in de kooi van een huis onder een warme lamp.
    2. Observeer de knaagdier post-CHL inductie tot de knaagdieren rechten zelf.
    3. Injecteer het knaagdier met glucose (dextrose/Saline) serum om het bewustzijn te herstellen en plaats knaagdieren in homecage voor herstel.
      Opmerking: gebruik een 23G naald met een 10 mL spuit om 5 mL zoutoplossing te injecteren na een CHL chirurgie.
    4. Injecteer het knaagdier via intramusculaire met anti-bacteriële Enrofloxacine 0,05 mg/kg tweemaal tijdens de herstelperiode van 24 uur.
    5. Observeer het knaagdier regelmatig op Pijngedrag of symptomen na de operatie.

5. gedrags beoordeling (validering van de CHL-inductie)-reactie van Clap schrikreactie

  1. Bevestigen van CHL (na Otoscoop bevestiging) 24 h na chirurgie met de gedrags beoordeling bestaande uit de Clap-Startle-test.
  2. Plaats de CHL geïnduceerde rat naast een normale rat in twee aparte aangrenzende kooien.
  3. Plaats de knaagdieren in een stille ruimte.
  4. Stand ongeveer 0,5 m afstand van de knaagdieren en ga naar Clap in gelijkmatig verdeelde duur een aantal keren (5 klappen werden gekozen en gespreid over 1 seconde).
    Opmerking: de Clap schrikreactie geproduceerd door de hand clap gemeten ≈ 40 dB SPL groter dan achtergrondgeluid zoals opgenomen door een hoge frequentie microfoon.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De eenvoudige CHL-procedure werd uitgevoerd op 90 ratten en uit deze groep 2 had een significante bloeding en 2 had de volgende dag geen gehoorverlies als beoordeeld door Behavioral Clap Startle. Deze vier ratten werden weggegooid. Ratten moeten worden weggegooid zoals beschreven door de redenen in de discussie als gevolg van complicaties. Inducerende TM punctie en/of verplaatsing/verwijdering van malleus (Figuur 2b) ONTLOKT CHL, wat resulteert in gedrags man...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een eenvoudige chirurgische inductie van CHL met verificatie met behulp van Otoscoop visualisatie en Behavioral Clap schrikreactie respons bij ratten. Hier demonstreren we de methode op rat en eerder is deze methode toegepast op gerbils en muizen. De methode kan gemakkelijk worden overgenomen door andere knaagdieren. Inductie van CHL maakt het mogelijk om een subtiele vorm van gehoorverlies te bestuderen die zich manifesteert in auditieve corticale veranderingen en psychopfysische gedrags bevindingen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen financiële of niet-financiële belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels gesteund door de Hong Kong Research Grants Council, het Early Career Scheme, project #21201217 to C. L., voor het project Brain Mapping geleide elektrofysiologie met toepassingen in gehoor-en lawaai vervuiling onderzoek. Wij danken de Posgrado en Ciencias Biomédicas, het Instituto de Neurobiología van de Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) México voor de Graduate Fellowship 578458 aan FAM Manno.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Latex, polyvinyl of nitril handschoenenAMMEXGebruik onbestoven handschoenen van 8-mil
Micro veerschaar (zie Fig. 1b)RWD Life ScienceS11035-088,0 cm totale lengte, met 3,5 mm snijkant, of vergelijkbare microtang. Standaard pincetten met veerwerking is voldoende
Otoscoop mini 3000HEINE D-008.70.120MStandaard LED otoscoop is voldoende
Raad of muisJAX labsElke kleine knaagdier 
Klein knaagdierkooiTecniplast1284LTwee kooien nodig om CHL knaagdier te scheiden van gehoor knaagdier. Als knaagdieren in direct contact met elkaar zijn, zullen ze elkaar verschrikken. Kooiafmetingen 365 x 207 x 140 mm, vloeroppervlak: 530 cm2/82,15 in2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shargorodsky, J., Curhan, S. G., Curhan, G. C., Eavey, R. Change in prevalence of hearing loss in US adolescents. The Journal of the American Medical Association. 304 (7), 772-778 (2010).
  2. Lucas, J. W., Schiller, J. S., Benson, V. Summary health statistics for U.S. adults: National health interview survey, 2001. National Center for Health Statistics. Vital and health statistics. 10 (218), 1-134 (2004).
  3. Gaffney, M., Green, D. R., Gaffney, C. Newborn hearing screening and follow-up: Aare children receiving recommended services? Public Health Reports. 125 (2), 199-207 (2010).
  4. Xu, H., Kotak, V. C., Sanes, D. H. Conductive hearing loss disrupts synaptic and spike adaptation in developing auditory cortex. The Journal of Neuroscience. 27 (35), 9417-9426 (2007).
  5. Buran, B. N., et al. A sensitive period for the impact of hearing loss on auditory perception. The Journal of Neuroscience. 34 (6), 2276-2284 (2014).
  6. Finck, A., Sofouglu, M. Auditory sensitivity of the Mongolian gerbil. The Journal of Auditory Research. 6, 313-319 (1966).
  7. Finck, A. Auditory sensitivity of the Mongolian Gerbil (Merionesunguiculatus). The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (60), 1579(1967).
  8. Finck, A., Schneck, C. D., Hartman, A. F. Jr Development of auditory function in the Mongolian gerbil. The Journal of the Acoustical Society of America. 46 (1A), 107(1969).
  9. Ryan, A. Hearing sensitivity of the Mongolian gerbil, Meriones Unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59, 1222-1226 (1976).
  10. Dallos, P., Harris, D., Ozdamar, O., Ryan, A. Behavioral, compound action potential, and single unit thresholds: relationship in normal and abnormal ears. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (1), 151-157 (1978).
  11. Kelly, J. B., Potash, M. Directional responses to sounds in young gerbils (Meriones unguiculatus. Journal of Comparative Psychology. 100 (1), 37-45 (1986).
  12. Heffner, H. E., Koay, G., Heffner, R. S. Behavioral assessment of hearing in mice--conditioned suppression. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8.21D (2006).
  13. Heffner, R. S., Koay, G., Heffner, H. E. Audiograms of five species of rodents: implications for the evolution of hearing and the perception of pitch. Hearing Research. 157 (1-2), 138-152 (2001).
  14. Lupo, E. J., Koka, K., Thornton, J. L., Tollin, D. J. The effects of experimentally induced conductive hearing loss on spectral and temporal aspects of sound transmission through the ear. Hearing Research. 272 (1-2), 30-41 (2011).
  15. Liberman, M. C., Liberman, L. D., Maison, S. F. Chronic conductive hearing loss leads to cochlear degeneration. PLoS One. 10 (11), e0142341(2015).
  16. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Conductive hearing loss results in a decrease in central auditory system activity in the young gerbil. Laryngoscope. 109, 1359-1371 (1999).
  17. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Effects of conductive hearing loss on gerbil central auditory system activity in silence. Hearing Research. 155, 124-132 (2001).
  18. Cook, R. D., Hung, T. Y., Miller, R. L., Smith, D. W., Tucci, D. L. Effects of conductive hearing loss on auditory nerve activity in gerbil. Hearing Research. 164, 127-137 (2002).
  19. Albuquerque, A. A., Rossato, M., Oliveira, J. A., Hyppolito, M. A. Understanding the anatomy of ears from guinea pigs and rats and its use in basic otologic research. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 75, 43-49 (2009).
  20. Li, P., Gao, K., Ding, D., Salvi, R. Characteristic anatomical structures of rat temporal bone. Journal of Otology. 10, 118-124 (2015).
  21. Judkins, R. F., Li, H. Surgical anatomy of the rat middle ear. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 117, 438-447 (1997).
  22. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. Anatomy of the rat middle ear. A study under the dissection microscope. Acta Anatomica (Basel). 112, 346-352 (1982).
  23. Albiin, N., Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E., Wirell, S. The vascular supply of the rat tympanic membrane. The Anatomical Record. 212, 17-22 (1985).
  24. Li, P., Ding, D., Gao, K., Salvi, R. Standardized surgical approaches to ear surgery in rats. Journal of Otology. 10, 72-77 (2015).
  25. Johansson, U., Hellström, S., Anniko, M. Round window membrane in serous and purulent otitis media. Structural study in the rat. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 102, 227-235 (1993).
  26. Magnuson, K., Hellström, S. Early structural changes in the rat tympanic membrane during pneumococcal otitis media. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 251, 393-398 (1994).
  27. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. The site of initial production and transport of effusion materials in otitis media serosa. A study on rat middle ear cavity. Acta Oto-Laryngologica. 93, 435-440 (1982).
  28. Shen, Y., et al. Scaffolds for tympanic membrane regeneration in rats. Tissue Engineering Part A. 19, 657-668 (2013).
  29. Wang, A. Y., et al. Rat model of chronic tympanic membrane perforation: Ventilation tube with mitomycin C and dexamethasone. International Journal of PediatricOtorhinolaryngology. 80, 61-68 (2016).
  30. Stenfeldt, K., Johansson, C., Hellström, S. The collagen structure of the tympanic membrane: collagen types I, II, and III in the healthy tympanic membrane, during healing of a perforation, and during infection. Archives of Otolaryngology--Head & Neck Surgery. 132, 293-298 (2006).
  31. Zhao, H., et al. Temporary conductive hearing loss in early life impairs spatial memory of rats in adulthood. Brain and Behavior. 8, e01004(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Trommelvliespunctieratmodelchirurgische proceduremalleusverplaatsinganesthesie via IP injectiepostoperatieve zorgverificatie van gehoorverlies

Gerelateerde artikelen