Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor de snelle virus nucleïnezuur extractie van de volbloed virus-geïnactiveerd. De winning gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit. De methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan overal worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen).

Samenvatting

De snelle diagnose van een infectie is essentieel voor de uitbraak beheer risico insluiting en de patiëntenzorg. Wij hebben eerder een methode voor de snelle bed inactivering van het Ebola-virus tijdens bloedmonsters voor veilige nucleïnezuur (nvt) tests getoond door het toevoegen van een buffer van commerciële lysis/bindende rechtstreeks in de vacuüm bloed collectie buizen. Gebruik deze bed inactivatie-aanpak, hebben we ontwikkeld een veilige, snelle en vereenvoudigde bed nb extractiemethode voor de latere detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De NA extractie gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit.

Nadat het bloed is verzameld in de buffer lysis/bindende, de inhoud door het omkeren van de buis met de hand worden gemengd en het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Magnetische glas deeltjes (MOP's) worden toegevoegd aan de buis, en de inhoud zijn gemixt door het omkeren van de buis van de collectie met de hand. De meerjarige oriëntatieprogramma's worden vervolgens verzameld aan de zijkant van de bloed collectie buis met behulp van een Paperclip Magneethouder of een magneet en een rubberen band. De meerjarige oriëntatieprogramma's zijn drie keer gewassen, en na de toevoeging van elutie buffer rechtstreeks in de collectie buis, de NAs zijn klaar voor NA proeven, zoals qPCR of lus isotherme amplificatie (LAMP), zonder de verwijdering van de meerjarige oriëntatieprogramma's uit de reactie. De nb-extractiemethode is niet afhankelijk van enige laboratoriumfaciliteiten en kan gemakkelijk worden overal gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen en ziekenhuis isolatie wijken). Wanneer deze NA-extractiemethode wordt gecombineerd met LAMP en een draagbare instrument, kan een diagnose binnen 40 min van de bloedinzameling worden verkregen.

Inleiding

Virus uitbraak situaties, wanneer patiënten zijn beperkt tot het ziekenhuis isolatie afdelingen of wanneer een snelle diagnose nodig is, is een veilige, eenvoudige en nauwkeurige point-of-care moleculaire diagnostiek absoluut noodzakelijk dat de patiënt zorg en risico insluiting. De twee recente virale uitbraken, van het Ebola-virus (EBOV) in West-Afrika (2013) en het Zika-virus in Zuid-Amerika (2015), is de belangstelling voor verbeterde point-of-care aan moleculaire diagnostische tests, zoals omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme gestegen versterking (RT-LAMP)^1,2 en recombinase polymerase versterking (RPA)^3,4. RT-LAMP én RPA zijn snelle, gevoelige en specifieke moleculaire tests die kunnen worden uitgevoerd op vereenvoudigde staalvoorbereiding. Voor de Zika-virus, heeft RT-LAMP is gecombineerd met een laterale stroom assay (LFA), die Zika-virus in monsters van volbloed niet-gezuiverd binnen 30 min^{1 detecteren kan}; echter, voor EBOV, die is ingedeeld als een risico groep 4 pathogeen en is zeer besmettelijk, de monsters moeten worden behandeld onder bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) voorwaarden en geïnactiveerd alvorens een veilige diagnostische procedures kunnen worden uitgevoerd.

Vereenvoudigde inactivatie methoden voor EBOV, zoals de toevoeging van lysis buffers naar de monster^2,3,4,5, werden gebruikt tijdens de uitbraak; echter, deze methoden vereisen behandeling onder BSL-4 voorwaarden met laboratoriumapparatuur, zoals BSL-3 bioveiligheid kasten, centrifuges, Verwarming blokken en pipetten, minimaal. Deze apparatuur is normaal niet aanwezig in isolatie wijken of in veldhospitalen. Om te overwinnen deze uitdaging, pogingen hebben gedaan voor het uitvoeren van diagnostiek in koffers³en diverse draagbare apparaten en machines zijn ontwikkelde [bijvoorbeeldeen draagbaar apparaat voor de extractie van nucleïnezuur (nvt)]⁶. EBOV-positieve monsters moeten echter nog worden geïnactiveerd voordat deze apparaten kunnen worden gebruikt.

We hebben eerder gemeld een snelle bed virus inactivatie methode voor de EBOV⁷, vacciniavirus en Koepokken virus⁸ door toevoeging van een commerciële lysis/bindende buffer gewone vacuüm bloed collectie buizen, waardoor voor de rechtstreekse overdracht van bloed van de patiënt in de inactivering buffer⁷. Deze directe en onmiddellijke inactivatie in een gesloten systeem elimineert de noodzaak voor de behandeling van de monsters met behulp van een strikte inperking, zoals BSL-4 voorwaarden⁷, en de monsters kunnen worden behandeld onder normale omstandigheden van BSL-2. Deze methode inactivatie is compatibel met verschillende nb Extractiesystemen, zoals robots en hand reiniging kits⁷; echter, deze methoden vereisen laboratoriumapparatuur, zoals robots, centrifuges en elektriciteit, die niet altijd aanwezig in Veldinstellingen of in ziekenhuis isolatie wijken.

In dit verslag beschrijven we een veilige, snelle en vereenvoudigde handmatige nb extractiemethode voor de latere moleculaire detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De nb-extractiemethode hoeft niet alle apparatuur dan een magneet/magnetische houder. Geen centrifuges, Verwarming blokken, of elektriciteit nodig zijn voor de NA extractie. Vandaar, deze methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan gemakkelijk worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen, in ziekenhuis isolatie wijken, of met lage-broninstellingen) overal. De nb-extractiemethode is snel en eenvoudig en rechtstreeks in elke stroomafwaartse nb proeven, zoals qPCR, RT-qPCR, LAMP of RT-LAMP kan worden gebruikt. Wanneer deze NA-extractiemethode wordt gecombineerd met LAMP en een draagbare batterij-gedreven isothermische instrument, kan een bed diagnose binnen 40 min van de bloedinzameling worden verkregen.

Protocol

Het Comité voor biomedische ethiek van het onderzoek, Hoofdstedelijk Gewest geïnformeerde toestemming heeft gegeven, en alle methoden die hier worden beschreven zijn vrijgesteld van een beoordeling door het systeem van het ethisch comité, volgens de Deense wet betreffende assay ontwikkelingsprojecten.

1. bereiding van bloed collectie vacuümbuizen Virus inactivering en snelle NA extractie

Let op: De buffer die wordt gebruikt voor dit protocol bevat guanidinium kaliumthiocyanaat (GITC) en een niet-ionogene oppervlakteactieve stof, die irriterende stoffen. Aangewezen laboratorium veiligheidsmaatregelen te nemen, gebruik van een kap stroom en draag handschoenen bij het hanteren van het. Elke huid- en oogcontact vermijden. Als de buffer is gemorst, moet het verontreinigde oppervlak nooit worden ontsmet direct met chloramine of natriumhypochloriet (de werkzame bestanddelen in "bleekmiddel") omdat dit mengsel tot de vorming van giftige cyanide leiden kan. Eerst, veeg omhoog de gemorste buffer met het absorberend weefsel. Volgende, reinig het oppervlak met 70% ethanol en vervolgens met water, en ten slotte gebruiken chloramine of natriumhypochloriet.

1. Ter voorbereiding van het bloed collectie vacuümbuizen, injecteren 1.6 mL van de specifieke commerciële lysis-buffermengsel in een tube 4 mL EDTA vacuüm door het deksel van de buis met behulp van een 25 G x 1 naald en een spuit met 3 mL prikken.
   Opmerking: Verwijder het deksel van de buis vacuüm niet. Het vacuüm moet worden gehandhaafd.
2. Bewaar de vacuümbuizen met de buffer bij kamertemperatuur tot gebruik.
   Opmerking: De buizen zijn stabiel gedurende ten minste 1 jaar na hun voorbereiding.

2. bereiding van Buffers NA extractie

1. Ter voorbereiding van de buffers van een NA extractie, twee 1.8 mL, twee 4.5 mL en een 3,6 mL buizen in een rack te plaatsen.
2. Toevoegen, door pipetteren, 960 µL van magnetische glas deeltjes (MOP's) om een schone 1.8 mL tube en een label met meerjarige oriëntatieprogramma's. resuspendeer de schorsing MGP volledig vóór het pipetteren.
   Opmerking: De meerjarige oriëntatieprogramma's hebben de neiging om te snel verzamelen aan de onderkant van de buis.
3. Toevoegen, waarbij eveneens, 4 mL was buffer ik tot een schone 4.5 mL koker en label als WB-1.
   Let op: Was buffer I bevat guanidinium chloride, die irriterend is. Aangewezen laboratorium veiligheidsmaatregelen te nemen, gebruik van een kap stroom en draag handschoenen bij het hanteren van het. Elke huid- en oogcontact vermijden.
4. Toevoegen, door pipetteren, 1,5 mL was buffer II tot een schone 3.6 mL koker en label als WB-2.
5. Toevoegen, door pipetteren, 3 mL was buffer III tot een schone 4.5 mL koker en label als WB-3.
6. Toevoegen, door pipetteren, 100 µL van elutie buffer tot een schone 1.8 mL koker en label als EB.
7. De aliquoted buffers bij kamertemperatuur bewaren tot gebruik.
   Opmerking: De buizen zijn stabiel gedurende ten minste 1 maand na hun opstelling.

3. de bloedinzameling van patiënten met tekenen en symptomen van een virusinfectie

Let op: Neem aangewezen laboratorium veiligheidsmaatregelen bij het verzamelen van bloed van de patiënt. Draag handschoenen en bril. Als de patiënt geïsoleerd is, volg dan de bioveiligheid niveau 4 procedures.

1. Om te verzamelen intraveneuze bloed van de patiënt, gebruiken een vlinder naald met lijst verlenging buizen en een bloed collectie vacuümbuis met een buffer van lysis/bindende Rusten de arm van de patiënt in een neerwaartse positie en plaats de collectie buis lager is dan de vlinder naald. Plaats de vlinder naald in de ader van de patiënt en hechten de bloed collectie vacuümbuis aan de small-bore extensie.
   Opmerking: Dit zal verhinderen terug-flow.
2. Meng de inhoud van de buis door de buis 5 - 10 keer na de bloedinzameling.
   Opmerking: Als gevolg van de resterende vacuüm in het bloed collectie buis met 1.6 mL lysis/bindende buffer, het volume van het monster verzameld zullen automatisch worden 1.6 mL.
3. Desinfecteer de buitenkant van de buis met behulp van 70% ethanol.
4. Incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en de volledige bloed collectie buizen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C of 37 ° C gedurende ten minste 1 maand⁷.
5. Direct de vereenvoudigde nb-extractiemethode blijven.

4. vereenvoudigde NA extractie van de volbloed

1. De inhoud van de buis door het vacuüm buis om te zuiveren NA uit de lysis/bindende buffer-geïnactiveerd verzamelde bloed, mix met de hand 5-10 x.
2. Verwijder het deksel van de buis zorgvuldig en ontladen van de deksel.
3. Giet de bereid aliquoot gedeelte van het meerjarige oriëntatieprogramma's (1 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
4. Plaats een nieuwe deksel van een ongebruikte bloed collectie buis over de buis met het monster.
5. Plaats een vinger op het deksel om te garanderen dat de buis goed is gesloten en meng de inhoud van de tube door flipping de bloed collectie buis met de hand 5 - 10 keer.
6. Plaats de buis in de magnetische houder en houden een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
7. Flip de magnetische houder met de buis een paar keer met de hand om ervoor te zorgen dat alle de meerjarige oriëntatieprogramma's worden verzameld op de kant van de buis met de magneet.
   Opmerking: De magnetische houder kan worden vervangen door een langwerpig magneet en een rubberen band.
8. Verwijder het deksel van de buis en gooi de inhoud van de tube met behulp van een wegwerp pipet of gewoon door het gieten van de inhoud in een tube van 50 mL collectie.
   Opmerking: Vermijd aërosolen uit de tube van 50 mL collectie door het sluiten van de buis met een deksel.
9. Giet de bereid aliquoot gedeelte van het WB-1 (4 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
10. Plaats het deksel op de buis en plaatsen van een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
11. Verwijder de buis van de magnetische houder, het deksel stevig aangedraaid met een vinger te houden.
    Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis.
12. Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's door flipping de bloed collectie buis met de hand 5 - 10 keer.
13. Herhaal stap 4.6-4.8.
14. Giet de bereid aliquoot gedeelte van het WB-2 (1,5 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
15. Plaats het deksel op de buis en verwijder de buis van de magnetische houder.
    Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis.
16. Plaats een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
17. Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's door flipping de bloed collectie buis voor een paar seconden met de hand.
18. Herhaal stap 4.6-4.8.
19. Giet de bereid aliquoot gedeelte van het WB-3 (3 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
20. Plaats het deksel op de buis en verwijder de buis van de magnetische houder.
    Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis.
21. Plaats een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
22. Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's door flipping de bloed collectie buis met de hand 5 - 10 keer.
23. Herhaal stap 4.6-4.8.
24. Giet de bereid hoeveelheid EB (100 µL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
25. Plaats het deksel op de buis en verwijder de buis van de magnetische houder.
    Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis.
26. Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's in de EB door te tikken op de bloed collectie buis 5 - 10 keer met een vinger.
    Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de buizen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C.
27. Overdracht één druppel (5-8 µL) van de geresuspendeerde meerjarige oriëntatieprogramma's aan de downstream NA versterking reactie mix met behulp van een 1,5 mL Wegwerp pipet (elke stroomafwaartse diagnostische NA versterking assay zoals LAMP/RT-LAMP of qPCR/RT-qPCR testen kunnen worden gebruikt).
    Opmerking: De NAs zal vasthouden aan de meerjarige oriëntatieprogramma's, dus zorg ervoor dat de meerjarige oriëntatieprogramma's te gebruiken in de stroomafwaartse NA versterking reactie. Meng de schorsing MGP vóór gebruik. Na het mengen, zal de meerjarige oriëntatieprogramma's verzamelen aan de onderkant van de buis.

Resultaten

Het protocol hier gepresenteerd is eenvoudig en efficiënt en in grote lijnen kan worden toegepast op elke moleculaire test op infectieuze volbloed monsters geïnactiveerd met de buffer lysis/bindend moeten worden uitgevoerd. De workflow voor de inactivering van het bloed en NA extractie is afgebeeld in Figuur 1, met inbegrip van de voorbereiding van bloed collectie vacuümbuizen⁷ (figuur 1A), het bloed colle...

Discussie

In dit verslag beschrijven we een veilige, snelle en eenvoudige handleiding bed nb extractiemethode voor de downstream moleculaire detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De beschreven nb-extractiemethode werd ontwikkeld om rechtstreeks op volbloed monsters verzameld in vacuüm bloed collectie buizen met de lysis/bindende buffer (Tabel of Materials)⁷worden uitgevoerd. Deze specifieke buffer inactiveert EBOV⁷ en is de kritis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)	Becton Dickinson	368861
Plus Blood Collection	Becton Dickinson	362725
23G x 1 naald	Becton Dickinson	300800
LUER LOK spuit (3 mL)	Becton Dickinson	309658
Butterfly naald met klein-kaliber verlengslang	Jørgen Kruuse A/S	121714
1% Virkon	Nomeco A/S	849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Navulling	Roche Diagnostics A/S	03246752001
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit	Roche Diagnostics A/S	3038505001
Nunc™ Biobanking en Celcultuur Cryogenic Tubes (1,8 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418
Nunc™ Biobanking en Celcultuur Cryogenic Tubes (3,6 mL)	Thermo Fisher Scientific	379189
Nunc™ Biobanking en Celcultuur Cryogenic Tubes (4,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	379146
DynaMag™-5 Magneet	Thermo Fisher Scientific	12303D
Transferpipet (3,5 mL)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1,5 mL)	Thermo Fisher Scientific	231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conische Sterile Polypropyleen Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652