Spuit-injectable Mesh elektronica voor stabiele chronische knaagdier electrofysiologie

Samenvatting

Mesh elektronica sondes naadloos integreren en stabiele, lange termijn, single-neuron ondersteuningsniveau opnemen binnen de hersenen. Dit protocol maakt gebruik van mazen elektronica voor in vivo experimenten, waarbij de fabricage van mesh elektronica, laden in naalden, stereotaxic injectie uitgangen interfacing, opname experimenten en histologie van de weefsel bevattende mesh sondes.

Samenvatting

Implanteerbare hersenen electrofysiologie sondes zijn waardevolle hulpmiddelen in de neurowetenschappen vanwege hun vermogen tot record neurale activiteit met hoge Spatio resolutie van ondiepe en diepe hersengebieden. Het gebruik ervan werd belemmerd, echter, mechanische en structurele incongruenties tussen de sondes en hersenen weefsel dat vaak leiden tot micromotion en gliosis met als gevolg signaalverwerking instabiliteit in chronische opname experimenten. In contrast, na de implantatie van ultraflexible mesh elektronica via injectie spuit, sondes de Maas vorm een naadloze, gliosis-vrije interface met de omliggende hersenweefsel waarmee stabiele volgen van individuele neuronen op ten minste een jaar tijdschaal. De gegevens van dit protocol de belangrijkste stappen in een typisch muis neurale opname experiment met behulp van spuit-injectable mesh elektronica, met inbegrip van de fabricage van mesh elektronica in een standaard fotolithografie gebaseerde proces mogelijk op vele universiteiten, laden Mesh elektronica in standaard capillaire naalden, stereotaxic injectie in vivo, verbinding van de Maas input/output aan standaard instrumentatie interfaces, ingetogen of opnamesessies, vrij te verplaatsen en histologische afdelen van hersenen weefsel met mesh elektronica. Representatieve neurale opnames en histologie gegevens worden gepresenteerd. Onderzoekers vertrouwd met dit protocol zal beschikken over de kennis moet mesh elektronica integreren in hun eigen experimenten en te profiteren van de unieke mogelijkheden van lange termijn stabiele neurale interfacing, zoals studies van veroudering processen, ontwikkeling van de hersenen en de pathogenese van de ziekte van de hersenen.

Inleiding

De ontwikkeling van instrumenten voor het toewijzen van de hersenen met single-neuron resolutie staat is van centraal belang voor Neurowetenschappen en Neurologie. Noninvasive technologieën voor neurale studies zoals elektro-encefalografie (EEG), liquor (MEG) en functionele magnetische resonantie imaging (fMRI) gebleken waardevolle voor het correleren van hersenactiviteit met gedrag in mensen^{1, 2}, maar ze missen de spatio resolutie die nodig is voor het bestuderen van de structuur en de dynamiek van neurale netwerken op hun fundamentele micrometer en milliseconde schalen, respectievelijk^3,4. Bepaalde electrocorticography (ECoG) sondes en optische beeldvorming methoden met spanning-gevoelige verfstoffen zijn erin opnemen van single-eenheid blancobepalingen activiteit in vivo^5,6, maar ze zijn over het algemeen effectief alleen in de buurt van de de oppervlakte van de hersenen, toepasselijkheid op studies van ondiepe hersengebieden te beperken. In tegenstelling, implanteerbare elektrische sondes kunnen meten single-neuron electrofysiologie in vrij bewegende dieren uit vrijwel elke regio van de hersenen zonder de noodzaak voor het labelen van de TL, waardoor ze onmisbaar voor Neurowetenschappen systemen-niveau, met name Als microfabrication technieken uit de halfgeleiderindustrie hebben geduwd telt kanaal in de honderden en duizenden^3,7,8,9. Op grond van deze mogelijkheden, hebben implanteerbare elektrische sondes vele belangrijke bijdrage geleverd aan de neurowetenschappen en Neurologie, met inbegrip van fundamentele studies van informatieverwerking in de visuele systeem¹⁰, de behandeling van neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson¹¹, en de demonstratie van de hersenen-machine interfaces (BMIs) voor geavanceerde protheses^12,13.

Echter heeft op lange termijn instabiliteit manifesteerde als spike amplitudes en unstable signalen op tijdschalen van weken tot maanden^14,15 te verlagen beperkt de toepasselijkheid van implanteerbare sondes voor de studie van betrekkelijk korte termijn verschijnselen, verlaten vragen zoals veroudering van de hersenen en ontwikkeling grotendeels onbeantwoord. De beperkingen in op de lange termijn instabiliteit zijn het gevolg van een wanverhouding tussen conventionele sondes en hersenweefsel in grootte, mechanica en topologie^{14,15,16,17,18}. In termen van omvang, terwijl de neuronale synapsen en waarin ongeveer tientallen nanometer tot tientallen micrometers in diameter¹⁹, respectievelijk zijn, traditionele sondes zijn vaak aanzienlijk groter, in het geval van silicium micro-elektrode arrays > 4 keer de grootte van een enkel neuron cel lichaam^7,8. De relatief grote omvang van deze sondes kan verstoren de natuurlijke structuur en de connectiviteit van dichte zenuwweefsel, aldus bij te dragen tot chronische immuunrespons en storing veroorzaakt de neurale circuits die bestudeerd. In termen van mechanische eigenschappen zijn traditionele sondes drastisch stijver dan de uiterst zachte zenuwweefsel waarin ze worden geïmplanteerd; zelfs "flexibele" sondes gemaakt van 10 – 20 µm dik bladen van polyimide zijn minstens 100.000 keer stijver dan hersenen weefsel^20,21. Deze komen niet overeen in Buigstijfheid veroorzaakt schuintrekken van de relatieve beweging tussen de sonde en hersenen weefsel, leidt tot onbetrouwbare single-eenheid bijhouden tijdens uitgebreide opnames en inducerende chronische gliosis op de site van de innesteling. Ten slotte sluit de topologische structuur van conventionele hersenen sondes noodzakelijkerwijs een solide volume van het weefsel. Dergelijke wanverhouding in de topologie verstoort de connectiviteit van neurale circuits, verzet zich tegen de natuurlijke driedimensionale (3D) interpenetrated verdeling van neuronen, gliale cellen en bloedvaten in de hersenen weefsel²²en belemmert 3D vervoer van signalering moleculen²³. Samen hebben deze tekortkomingen van conventionele sondes maakte hen ontoereikend is om de lange termijn compatibiliteit gezocht voor klinische toepassingen en longitudinale neurowetenschappen studies op het niveau van de single-neuron.

Om deze tekortkomingen te verhelpen, wij gestreefd naar het vervagen van de grens tussen de neurale en elektronische systemen door de ontwikkeling van een nieuw paradigma van neurale sondes "weefsel-achtige" mesh elektronica^16,21,24genoemd. Elektronica adressen overeenkomen met de bovenstaande in de topologie, grootte en mechanica problemen door te nemen (1) de structurele kenmerken van de dezelfde nanometer micrometer grootte schaal van zenuwweefsel, (2) mechanische eigenschappen die lijken op die van hersenweefsel, en (3) een 3D mesh macroporeuze topologie thats > 90% open ruimte en dus herbergt vervlechting van neuronen en verspreiding van moleculen door de extracellulaire omgeving. Mesh elektronica sondes kunnen precies worden geleverd aan specifieke hersengebieden door middel van een spuit en een naald, minimale acute schade terwijl het implanteren van zelfs in diepe brein regio's^21,25. Neuronale soma en axonen is aangetoond dat het doordringen van de open 3D mesh elektronica sonde structuur binnen weken na injectie, waardoor een naadloze, gliosis-vrije interface tussen opname van elektronica en omringende hersenen weefsel^{21 , 26 , 27}. deze unieke functies hebben ingeschakeld mesh elektronica sondes te stabiel blancobepalingen activiteiten bijhouden van de dezelfde individuele neuronen over ten minste een jaar tijdschaal²⁷. Bovendien biedt de fabricage van de elektronica van de mesh op basis van fotolithografie (PL) hoge schaalbaarheid van het aantal elektroden die kunnen worden opgenomen, met aantoonbare kanaal telt maximaal 128 elektroden per sonde met behulp van eenvoudige contact masker lithografie ²⁸ en een plug-and-play input/output (I/O) ontwerp, dat voor snelle elektrische verbinding met de perifere elektronica zonder gespecialiseerde apparatuur^{29 zorgt}.

Een breed scala van studies kan profiteren van de integratie van mesh elektronica in meting protocollen. De meeste intracortical opname experimenten kunnen profiteren van mesh elektronica minimaal invasieve implantatie procedure via injectie spuit, de drastisch verminderde immuunrespons na implantatie, en de mogelijkheid om laat gaas elektronica in de weefsel tijdens latere histologie en immunokleuring voor nauwkeurige analyse van de biologische omgeving voor elke opname-site. Chronische opname experimenten zal in het bijzonder waarde ontlenen aan het unieke vermogen van mesh elektronica voor het bijhouden van grote aantallen individuele neuronen voor maanden tot jaren. Deze mogelijkheid schept mogelijkheden voor studies met single-neuron resolutie die waren voorheen onpraktisch zijn, zoals de veroudering van de longitudinale studies van neurale circuits, onderzoeken van de ontwikkelende hersenen, en onderzoek naar de pathogenese van encefalopathieën¹⁶.

In dit protocol beschrijven we allemaal de sleutel in een typisch muis neurale opname experiment met behulp van spuit-injectable mesh elektronica stappen (Zie Figuur 1). Stappen omvatten de fabricage van mesh elektronica in een standaard PL gebaseerde proces mogelijk op vele universiteiten, laden van mesh elektronica in standaard capillaire naalden, stereotaxic injectie van mesh elektronica in vivo, aansluiting van de Mesh I/O interfaces standaard instrumentatie, ingetogen of vrij bewegend opnamesessies en histologische afdelen van hersenweefsel met mesh elektronica. Sommige onderzoekers met behulp van mesh elektronica alleen voor histologie studies wellicht niet elektrische interfacing en opnemen, in welk geval zij deze stappen kunnen overslaan. Na zich vertrouwd te maken met dit protocol, moeten onderzoekers alle noodzakelijke gebruik van mesh elektronica in hun eigen experimenten kennis hebben.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd op gewervelde dieren onderwerpen werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Harvard universiteit.

1. fabricage van Mesh elektronica

Opmerking: De procedure die wordt beschreven in deze sectie is bedoeld voor gebruik binnen een standaard Universiteit cleanroom faciliteit, zoals het centrum voor de nanoschaal systemen (CNS) aan de Harvard University. Deze faciliteit evenals soortgelijke faciliteiten zijn toegankelijk voor externe gebruikers rond de Verenigde Staten, bijvoorbeeld als onderdeel van de nationale nanotechnologie infrastructuur netwerk (NNIN) ondersteund door de National Science Foundation (NSF). In deze faciliteiten, veel van de hulpmiddelen, apparatuur en materialen die in deze sectie beschreven met toegang tot de faciliteit van de cleanroom zijn verstrekt en niet afzonderlijke aankoop zou vereisen.

Let op: Veel van de chemicaliën die worden gebruikt in de fabricage van mesh elektronica zijn gevaarlijke, met inbegrip van weerstaat, CD-26 remover PG, SU-8 ontwikkelaar en Ni etsen oplossing. De materialen veiligheidsinformatiebladen (MSDS) raadplegen voor deze chemische stoffen voor gebruik en tenuitvoerlegging en follow-up van passende veiligheidsmaatregelen te allen tijde.

1. Thermisch verdampen 100 nm van Ni op een schone Si wafer.
   Opmerking: Typische afzetting parameters zijn basis druk van 5 x 10^-7 T en snelheid van 1 – 2 Å/s. De dunne laag van Ni fungeert als een offer laag die later zal worden ontbonden om mesh elektronica van de wafer vrij te geven.
2. Gebruik de eerste PL masker (PL masker-1) om te definiëren onder passiveren van laag van mesh elektronica met SU-8 negatieve fotoresist (figuur 2A).
   Opmerking: PL is een standaard microfabrication techniek waarin ultraviolet (UV) licht op een masker gehouden over een lichtgevoelige substraat scheen is. Licht ofwel maakt onoplosbare (negatieve weerstaat) of oplosbare (positieve weerstaat) de blootgestelde gebieden op het substraat. De maskers zijn getrokken in computer aided design (CAD) software en dan meestal besteld bij een leverancier. Een masker aligner wordt gebruikt voor het uitlijnen van maskers om bestaande patronen op een substraat en hen blootstellen aan UV-licht. Fabricage van mesh elektronica vereist vier verschillende maskers (PL masker-1 t/m PL masker-4). Onze masker ontwerpen zijn beschikbaar op aanvraag of op de bron site, meshelectronics.org.
   1. Spin-jas SU-8 2000.5 negatieve fotoresist op het zegel van 4.000 toeren per minuut voor een geschatte SU-8 dikte van 400-500 nm.
   2. Zachte bak het zegel op een kookplaat voor 1 min bij 65 ° C, gevolgd door 1 min bij 95 ° C.
   3. De wafer in een masker aligner bloot van de SU-8 met PL masker-1 overeenkomt met de onderlaag mesh SU-8 te laden. Bloot op een i-lijn (365 nm golflengte) dosis van 100 mJ/cm².
   4. Post bakken het zegel op een kookplaat voor 1 min bij 65 ° C, gevolgd door 1 min bij 95 ° C.
   5. Dompel de wafer in een lade van SU-8 ontwikkelaar. Zachtjes doorroeren de oplossing gedurende 2 minuten totdat de mazenpatroon in de SU-8 volledig heeft ontwikkeld. Spoel in een lade van isopropyl alcohol voor 1 min en droge klap.
   6. Hard bak het zegel op een kookplaat bij 180 ° C gedurende 1 uur.
      Opmerking: De SU-8 is gewoonlijk harde gebakken tussen de 150 ° C en 250 ° C na ontwikkeling. De harde bak anneals ieder oppervlak inbreker die kunnen vormen tijdens het ontwikkelen en verdere crosslinks de SU-8 mechanische stabiliteit kan garanderen. Hard bakken bij 180 ° C voor de onderlaag van de SU-8 en 190 ° C voor de bovenkant SU-8 laag levert goede resultaten voor gaas elektronica.
3. Gebruik PL masker-2 metal definiëren interconnects en I/O pads (figuur 2B).
   1. Spin-coat LOR3A naar de wafer bij 4000 omwentelingen per minuut voor een geschatte dikte van 300 nm.
      Opmerking: LOR3A is een op polydimethylglutarimide gebaseerde weerstaan welke snelheden prijsonderbieding tijdens de daaropvolgende metallisatie procedure.
   2. De wafer op een kookplaat bij 180 ° C gedurende 5 minuten bakken.
   3. Spin-coat S1805 positieve fotoresist bij 4000 omwentelingen per minuut voor een geschatte dikte van 500 nm.
   4. Bak het zegel op een kookplaat bij 115 ° C gedurende 1 minuut.
   5. Laad de wafer in een masker aligner bloot de S1805 met PL masker-2 overeenkomt met het metaal interconnects en I/O pads. Bloot bij een dosis van de h-lijn (405 nm golflengte) van 40 mJ/cm².
   6. Dompel de wafer in een lade van de CD-26 fotoresist ontwikkelaar. Zachtjes doorroeren de oplossing voor 1 min totdat het metaal interconnects patroon is volledig ontwikkeld. Spoel in een lade van gedeïoniseerd water (DI) voor 1 min en droge klap.
   7. Thermisch verdampen 3 nm van Cr gevolgd door 80 nm van Au.
      Opmerking: Een basis druk van ten hoogste 5 x 10^-7 T en de afzetting tarief van 1 Å/s opleveren meestal de beste kwaliteit van de film.
   8. De wafer onderdompelen in een platte bekerglas van remover PG voor ongeveer 3 h, totdat het metaal volledig onderboden, verlaten van het metaal alleen in de gewenste interconnect en I/O pad regio's van mesh elektronica. Spoel in isopropylalcohol en droge klap.
4. PL masker-3 gebruikt om te definiëren van Pt elektroden (figuur 2C).
   1. Herhaal stap 1.3.1 via 1.3.4.
   2. De wafer in het masker aligner bloot de S1805 met PL masker-3 overeenkomt met de Pt-elektroden te laden. Bloot bij een dosis van de h-lijn van 40 mJ/cm².
   3. Dompel de wafer in een lade van de CD-26 fotoresist ontwikkelaar. Zachtjes doorroeren de oplossing voor 1 min, totdat het patroon van de elektroden Pt volledig heeft ontwikkeld. Spoel in een lade van DI voor 1 min en droge klap.
   4. Gebruik een electron beam verdamper aan borg 3 nm van Cr gevolgd door 50 nm van Pt.
      Opmerking: Typische afzetting parameters zijn een basis druk van 5 x 10^-7 T en tarief van 2 Å / s.
   5. De wafer onderdompelen in een platte bekerglas van remover PG voor ongeveer 3 h, totdat het metaal volledig onderboden, Pt verlaten alleen op de gewenste elektrode sites van mesh elektronica. Spoel in isopropylalcohol en droge klap.
5. Gebruik PL masker-4 om te definiëren van de top passiveren van laag van mesh elektronica met SU-8 negatieve fotoresist (figuur 2D).
   1. Herhaal de stappen 1.2.1 via 1.2.5, maar bloot met PL masker-4 overeenkomt met de passivating mesh toplaag van SU-8.
   2. Hard bak het zegel op een kookplaat op 190 ° C gedurende 1 uur.
      Opmerking: Deze temperatuur is 10 ° C hoger dan die voor de harde bak van de bodem SU-8 (stap 1.2.6). Deze verhoogde temperatuur doorloopt iets de onderkant SU-8, veroorzakend het om te fuseren met de bovenste laag van de SU-8 en vormen zo een enkel, continu SU-8-structuur.
6. Mesh elektronica zijn nu voltooien (figuur 2E en Figuur 3); vrij te laten van de Si-wafer door ontbinding van de Ni opofferende laag.
   1. Behandel de wafer met zuurstof plasma op 50 W voor 1 min. Dit oxideert het SU-8-oppervlak, waardoor het hydrofiele en waardoor de Maas gemakkelijk worden opgeschort in waterige oplossing.
   2. In een vlakke bekerglas, zoutzuur, ferrichloride en DI combineren bij een volumetrische verhouding van 1:1:20, respectievelijk, om een oplossing van Ni etchant te maken.
   3. Dompel de wafer in een platte bekerglas van de Ni etchant oplossing voor ongeveer 3 h totdat de mesh elektronica volledig vrijgesteld van de Si-wafer.
   4. Gebruik een pipet van Pasteur om de vrijgegeven Maas elektronica sondes van Ni etchant overbrengen in een bekerglas van 100 mL van DI. De mesh-elektronica overbrengen naar een verse bekerglas van DI, wordt ten minste 3 keer om ervoor te zorgen dat spoelen.
   5. Gebruik een pipet van Pasteur de mesh elektronica overbrengen naar een 70/30% ethanol/water-oplossing voor ontsmetting, gebruik dan de pipet om de mesh elektronica overbrengen in steriel water voor het spoelen.
      Opmerking: Na sterilisatie, de mesh-elektronica kan worden overgedragen aan andere oplossingen voor functionalization. Bijvoorbeeld, ter bevordering van cellulaire hechting, kan de mesh-elektronica worden overgedragen aan een waterige oplossing van poly-D-lysine (1 mg/mL) gedurende 24 uur.
   6. Gebruik een pipet van Pasteur te dragen van de mesh-elektronica sondes naar een bekerglas van 100 mL steriele 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) vóór injectie in vivo.

2. veilig laden van Mesh elektronica in naalden

1. De houder van de pipet als-gekocht is te stromen aan beide uiteinden open. Verzegel het einde tegenover de bevestiger circulaire schroef met epoxy, dus er geen lekkage tijdens injectie (figuur 4A is). Laat de epoxy harden voordat u verdergaat.
2. Een glazen capillaire naald invoegen door de houder van de pipet. Zet het vast in plaats met behulp van de circulaire aanscherping schroef en kegel wasmachine (figuur 4B). Een 400 µm binnendiameter (buitendiameter is 650 µm) glazen capillaire naald werd gebruikt voor dit protocol. Andere materialen van de capillaire naald (bv., metalen) en diameters kunnen worden gebruikt maar omvat wellicht wijzigingen in het ontwerp van mesh elektronica om injectiecapaciteit.
   Opmerking: Capillaire naalden variërend van 150 µm tot 1,17 mm binnendiameter (250 µm tot 1,5 mm buitendiameter) zijn gebruikt in ons laboratorium. Injectie via kleinere naalden kan worden bevorderd door het maken van de hoek van de kruising tussen de transversale en longitudinale SU-8 mesh elementen meer acute, minderen van de breedte van de elementen van de SU-8 mesh dunner SU-8 gebruikt en met behulp van een grovere (dwz., grotere eenheidscel) mesh structuur. Fotomaskers voor mazen ontworpen voor kleinere capillaire naalden beschikbaar op aanvraag of op de bron site zijn, meshelectronics.org. Glazen capillaire naalden met een binnendiameter van 400 µm en buitendiameter van 550 µm zijn ook commercieel beschikbaar. Deze verminderen de acute weefselschade veroorzaakt door injectie, terwijl behoud van compatibiliteit met netten vereisen een inwendige diameter van de 400-µm, maar ze niet voor het hier beschreven onderzoek gebruikt werden.
3. Een spuit van 1 mL hechten aan de uitlaat zijde van de houder van de Pipetteer met behulp van een 2-4 cm lengte van de capillaire buis.
4. Plaats de glazen capillaire naald af in het bekerglas van 100 mL PBS met de mesh-elektronica. Plaats het einde van de naald in de buurt van de I/O pads voor een mesh elektronica sonde en handmatig intrekken van de spuit om te tekenen van een mesh elektronica sonde in de naald (Figuur 5 en aanvullende Video 1).
   Opmerking: De I/O pads, stam interconnect regio en mesh apparaat regio zijn gemakkelijk herkenbaar zijn blote oog wanneer de mesh elektronica sondes zijn opgehangen in de oplossing. Hierdoor eenduidig laden van mesh elektronica in de naalden met de correcte oriëntatie.
5. Push-/ pull de spuit plunjer terwijl nog steeds ondergedompeld in een zoutoplossing om de positie van mesh elektronica binnen de naald te wijzigen.
   Opmerking: Ideale positionering is met de ultraflexible mesh apparaat regio als in de buurt van het einde van de nld mogelijk. Deze configuratie minimaliseert de hoeveelheid vloeistof die zal worden geïnjecteerd in de hersenen terwijl het waarborgen van dat de apparaat-regio eerst wordt geïnjecteerd en de I/O pads laatst.
6. Zorgvuldig loskoppelen de capillaire buis uit het stopcontact van de zijde van de pipet houder. Los het langzaam om te voorkomen dat het creëren van een zuigkracht die de positie van de elektronica van de mazen in de naald kon veranderen.

3. stereotaxic injectie van Mesh elektronica in levende muis hersenen

Opmerking: Muizen werden verdoofd door intraperitoneale injectie met een mengsel van 75 mg/kg ketamine en 1 mg/kg dexdomitor. De mate van anesthesie werd gecontroleerd met de methode snuifje teen voorafgaand aan begin van operatie. Lichaamstemperatuur werd gerund door het plaatsen van de muis op een warmbloedig deken van 37 ° C terwijl onder verdoving. Juiste steriele techniek werd uitgevoerd voor de operatie, met inbegrip van maar niet beperkt tot de autoclaaf alle metalen chirurgische instrumenten voor 1 h vóór gebruik, gebruik van gesteriliseerde handschoenen, een sterilisator hete kraal gedurende de operatie, het onderhoud van een steriel veld rond de chirurgische site, desinfectie van plastic instrumenten met 70% ethanol en het depilated hoofdhuid werd huid klaargestoomd met iodophor voorafgaand aan de incisie. Antiobiotic zalf rond de wond werd toegepast voor overleving operaties, na afloop van de operatie, en de muis was teruggekeerd naar een kooi dat is uitgerust met een 37 ° C verwarming pad. Muizen werden niet onbeheerd totdat ze had weer voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort. Muizen kregen buprenorfine analgesie via intraperitoneale injectie bij een dosis van 0,05 mg/kg lichaamsgewicht elke 12 uur gedurende maximaal 72 uur na de operatie. Muizen werden geïsoleerd van andere dieren die na de operatie. Muizen werden euthanized via beide intraperitoneale injectie van pentobarbital bij een dosis van 270 mg/kg lichaamsgewicht of via de transcardial perfusie (zie stap 6.1). Onderzoekers kunnen verwijzen naar Geiger, et al.. ³⁰, Kirby, et al.. ³¹en Gage, et al.. ³² voor meer informatie over knaagdieren stereotaxic chirurgie.

1. Anesthetize van de muis en repareren in een stereotaxic frame.
2. Oogbeschadigingen en/of smeermiddel toepassen door de ogen van de muis om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
3. Gebruik een tandheelkundige boor en een stereotaxic frame te openen van een craniotomy op de gewenste coördinaten op de schedel. Open een tweede craniotomy uit de buurt van de injectieplaats voor het inbrengen van een roestvrij stalen aarding schroef- of draad.
4. Fix een klemmen substraat op de schedel met tandheelkundige cement. Snijd een brede kloof van ongeveer 1 mm in de ondergrond om de betrouwbaarheid van de opvouwbare stap later in de procedure te verbeteren.
   Opmerking: Een platte flexibele kabel (FFC) teruggebracht tot een "L" vorm werkt goed (figuur 7A), hoewel vele materialen werken zou, zolang ze van de gewenste dikte voor de 32-kanaals nul insertion force (ZIF) connector zijn (ontworpen voor 0.18 ± 0,05 mm dikke kabels).
5. Monteer de pipet houder met de naald met mesh elektronica op het stereotaxic frame met behulp van een rechte hoek einde klem (figuur 4C en figuur 6A).
6. De uitlaat van de zijde van de pipet houder hechten aan een 5 mL-spuit vastgemaakt in een spuit pomp (figuur 6D) met behulp van een ongeveer 0,5 – 1 m lengte van de capillaire buis.
   Opmerking: Zorg ervoor er zijn geen luchtbellen in de capillaire buis voordat u het aansluit op de houder van de pipet. Bellen kunnen onderbreken de stroom tijdens de injectie en voorkomen dat een soepele, gecontroleerde levering van mesh elektronica.
7. Gebruik het stereotaxic frame om te plaatsen het puntje van de naald op de gewenste startlocatie binnen de hersenen.
   Opmerking: De mesh elektronica sondes die hier gebruikt zijn ontworpen met het opnemen van elektroden verspreid over een lengte van ca. 2 mm en met de eerste elektrode gelegen ca. 0,5 mm vanaf de eerste rand van de mesh-elektronica (meest linkse edge in figuur 3A). Om deze reden, moeten de stereotaxic coördinaten zijn geselecteerd zodanig dat de startlocatie 0,5 mm dieper dan de regio van de hersenen van belang is. De verspreiding en de locatie van de elektroden van de opname binnen mesh elektronica kunnen vrij worden geselecteerd tijdens het ontwerpproces masker en moeten worden geselecteerd, zodat de opname elektroden de hersenen regio('s) van belang omspannen als zij worden geïnjecteerd langs hun stereotaxic traject.
8. Plaats de camera (figuur 6B) als u wilt weergeven boven aan de Maas elektronica sonde binnen de naald van glas. Sommige software kan de gebruiker lijnen tekenen op het scherm om te markeren van het oorspronkelijke standpunt van de mesh-elektronica.
9. Het initiëren van de stroom door de spuitpomp op een lage snelheid en op Start te drukken. 10 mL/h is een typische begin debiet voor een 400 µm binnendiameter capillaire naald. Verhoog langzaam het debiet als de mesh elektronica sonde niet wordt verplaatst binnen de naald.
   Opmerking: Het is belangrijk om te minimaliseren van de hoeveelheid vloeistof die geïnjecteerd in de hersenen als dit kan schade veroorzaken aan het weefsel rondom het injectiegebied. Beste resultaten zijn behaald met injectie volumes minder dan 25 µL per 1 mm met ingespoten mesh lengte. Ideale waarden zijn minder dan de helft van dit volume; in ons laboratorium injecteren we meestal 10 – 50 µL per een lengte van 4 mm geïnjecteerd mesh.
10. Als de mesh elektronica sonde begint te verplaatsen binnen de naald, gebruik het stereotaxic frame te trekken van de naald tegen hetzelfde tarief waarmee de mesh elektronica sonde wordt wordt geïnjecteerd, met behulp van de gemarkeerde oorspronkelijke positie van mesh elektronica als een gids.
    Opmerking: Deze procedure, genoemd het beeldveld (FoV) injectie methode²⁵, zorgt voor nauwkeurige levering van mesh elektronica aan een gerichte hersenen regio zonder verfrommelen of dislocatie. Het debiet kan vaak worden verminderd zodra de mesh elektronica sonde begint zich binnen de naald. In ons laboratorium, debieten van 20-30 mL/h zijn vaak verplicht te overwinnen van de statische wrijving tussen de Maas en capillaire naald muren, maar kan vervolgens worden verlaagd tot 10 mL/h zodra de injectie proces in gang heeft gezet. Debiet en injectie volumes zijn meestal kleinere voor de kleinere diameter capillaire naalden.
11. Blijven stromen zoute en intrekken van de naald tot de naald heeft verlaten de schedel. De stroom van de spuitpomp stoppen.

4. input/output Interfacing

Opmerking: op dit punt, de mesh elektronica sonde heeft ingespoten van het gewenste startpunt binnen de hersenen langs het gekozen traject. De naald is ingetrokken en is net boven de craniotomy met de Maas elektronica interconnects variërend van de hersenen naar de naald en de I/O pads nog steeds binnen de naald (figuur 7B). Deze sectie wordt gebruikt een Printplaat (PCB; Figuur 7, Figuur 8) naar de interface naar de mesh elektronica sonde. De PCB verbindt een ZIF-connector aan op de connector van een standaard 32-kanaals versterker door middel van een isolerende substraat dat de hoofd-podium voor neurale opname experimenten wordt. De PCB is aanpasbaar aan verschillende configuraties van de hoofd-fase. Onze ontwerp-bestanden zijn beschikbaar op verzoek of vanaf de website van de resource, meshelectronics.org en kan worden gebruikt voor de aankoop van PCB's goedkoop van leveranciers van PCB fabricage en montage.

1. Zorgvuldig begeleiden de naald naar de FFC substraat klemmen met het stereotaxic frame en over de kloof, de oplossing met de spuitpomp voor het genereren van de toegestane vertraging in de Elektronika van de Maas stroomt interconnects (Figuur 7 c).
2. Zodra de naald boven het klemmen substraat en over de kloof, hervatten de stroom in een snel tempo aan het uitwerpen van de mesh-elektronica I/O pads op de klemmen substraat (figuur 7D).
3. Met behulp van pincet en een pipet voor DI, buig de I/O pads tot ca. 90° hoek als dichtbij de eerste I/O pad mogelijk.
   Opmerking: Het buigen is nodig om de pads in de ZIF-connector op een PCB in een latere stap moet worden ingevoegd. De ZIF-connector is precies dezelfde breedte als de 32 I/O pads van de mesh elektronica sonde, zodat een onvolmaakte 90° bocht, of een bocht niet die zich voordoen vlak voor de eerste I/O pad, resulteren zal in moetend afgesneden I/O pads (de meest linkse pads in figuur 7E).
4. Zodra de I/O pads zijn uitgelijnd, ontvouwen, en onder een hoek van 90° aan de stengel van de Maas, droog in plaats met zachte gecomprimeerd lucht.
   Opmerking: Mesh elektronica sondes met minder dan 32 kanalen kan worden geïnterfacet aan met de dezelfde 32-kanaals-interfacekaart. Bijvoorbeeld, onze afwerkcentrale gebruikt vaak 16-kanaals mesh elektronica sondes met 32-kanaals PCB's. Dit geeft extra ruimte binnen de ZIF-connector, gemakkelijker interfacing, en de extra geïsoleerde kanalen worden gemakkelijk geïdentificeerd als open circuits door middel van impedantie testen tijdens de opnamesessies.
5. Snijd de klemmen substraat in een rechte hoek ongeveer 0,5 – 1 mm van de rand van de I/O pads. Ook afgesneden vreemde delen van de klemmen substraat dat het inbrengen in de PCB gemonteerde 32-kanaals ZIF-connector (figuur 7F belemmeren zal).
6. Plaats van de I/O pads in de ZIF-connector op het printje en sluit de klink (figuur 7G). Gebruik meting elektronica voor het meten van de impedantie tussen de kanalen en de schroef van de grond te bevestigen succesvolle interfacing. Als de impedantie-waarden te hoog zijn, releasehandle de ZIF-connector, aanpassen van de invoegpositie en hertest tot verbinding wordt bevestigd.
7. Bedek de ZIF-connector en blootgestelde mesh elektronica interconnects met tandheelkundige cement voor bescherming. De PCB spiegelen aan de kloof in het substraat, en monteren van de PCB met cement op de schedel van de muis (Figuur 7 H).
   Opmerking: Het buigen van de FFC op de kloof de mechanische spanning die kan soms breken de Maas elektronica interconnects vermindert.
8. Laat het cement te verharden, de PCB te veranderen in een robuuste, compacte hoofd-podium voor interfacing tijdens latere opnamesessies (figuur 7I).

5. neurale opname experimenten

1. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een tailveiner of andere afdekking³³. De voorversterker PCB invoegen in de standaard versterker-connector op de hoofd-fase PCB. Gebruik een aparte kabel aan de grond van de referentie-schroef.
2. Voor ingetogen opnames, laat u de muis in de afdekking. Het opnemen van de gegevens met behulp van het data-acquisitiesysteem voor de gewenste periode (figuur 8A).
3. Voor vrij bewegende opnamen, laat u de muisknop los van de afdekking na invoegen de voorversterker PCB en aarding van de referentie-schroef. Record voor de gewenste lengte van de tijd met behulp van het data-acquisitiesysteem terwijl de muis vrij werkt (Figuur 8).
4. Aan het einde van de opnamesessie, zet u de muis terug in de afdekking, indien nodig. Verwijder de aarding draad en voorversterker, dan laat u de muisknop los terug naar haar kooi en terug te sturen naar het dier faciliteit tot de volgende vergadering van de opname.

6. histologische afdelen, kleuring en Imaging

1. Wacht tot de gewenste tijd na injectie, dan anesthetize de muis en transcardially perfuse met formaldehyde. Verwijderen, bevriezen en cryosection de hersenen in 10-µm dikke plakjes. Een gedetailleerd protocol inzake immunohistochemistry en cryosectioning van knaagdier hersenweefsel kan worden gevonden in Evilsizor, et al.. ³⁴.
   Opmerking: Hersenweefsel met mesh elektronica kan worden vastgesteld en gesegmenteerd normaal, hoewel de controle elektronica worden overgelaten binnen. Dit is een unieke vermogen in vergelijking met conventionele neurale sondes, die moet worden verwijderd voordat het segmenteren en daarom kunnen het wijzigen van het weefsel of maken het moeilijk voor het analyseren van de sonde-weefsel-interface.
2. Spoel de hersenen bevroren weefselsecties 3 keer in 1 x PBS.
3. Het blokkeren van de secties in een oplossing van 0,3% Triton X-100 en 5% geit serum in 1 x PBS. Laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur zitten.
4. Incubeer de secties met de oplossing van primaire antilichamen. Het primaire antilichaam-oplossingen gebruikt hier waren konijn anti-NeuN (1:200 verdunning), muis anti-Neurofilament (1:400 verdunning) en rat anti-GFAP (1:500 verdunning) met 0,3% Triton X-100 en 3% geit serum. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
5. Spoel de delen 9 keer voor een totaal van 40 min met 1 x PBS.
6. Incubeer de delen van de hersenen met de oplossing van secundaire antilichamen. De oplossingen van de secundair antilichaam gebruikt hier waren Alexa Fluor 488 geit anti-konijn (1:200 verdunning), Alexa Fluor 568 geit-antimuis (1:200 verdunning) en Alexa Fluor 647 geit anti-rat (1:200 verdunning). Incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
7. Spoel de delen 9 keer voor een totaal van 30 min met 1 x PBS.
8. Monteer de secties op de dia's van glas met coverslips met antifade inbedmiddel. Laat de dia's in het donker gedurende ten minste 24 uur voordat de beeldvorming.
9. Afbeelding van de dia's met een confocal microscoop met behulp van 488 nm, 561 nm, en 633 nm lasers als de excitatie-bronnen voor de Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 568 en Alexa Fluor 647, respectievelijk. Differentiële interferentie contrast (DIC) gebruiken om het imago van de mesh-elektronica op de dezelfde Microscoop voor latere overlay van de afbeeldingen en de analyse.

Resultaten

Resultaten zullen variëren afhankelijk van de diersoort in de studie, de regio gerichte hersenen, de verstreken tijd sinds injectie, het bedrag van de acute schade toegebracht tijdens de injectie, en het succes van de i / interfacing procedure, onder andere factoren. Single-eenheid blancobepalingen activiteit verschijnen niet tot 1 dag (in het geval van 150 µm binnendiameter naalden) tot 1 week na de injectie en spike amplitudes tot 4 – 6 weken variëren kunnen. Figuur 9 representatieve elektrofysiologische worden gegevens weergegeven uit een 32-kanaals mesh elektronica sonde geïnjecteerd in de hippocampus en de primaire Somatosensorische cortex van een volwassen mannelijke C57BL/6J muis. Ongeveer 300-µV amplitude lokale veld potentieel (LFPs) werden opgenomen op alle 32 kanalen en single-eenheid blancobepalingen activiteit werd opgenomen op 26 kanalen. De LFPs en geïsoleerde spikes bleef tussen 2 en 4 maanden, hetgeen wijst op een zeer stabiele interface tussen opname elektronica en neuronen over deze lange periode gelijkaardig. Figuur 10 toont representatieve resultaten van histologische afdelen en immunokleuring van hersenweefsel met mesh elektronica 1 jaar na injectie. Kleuring voor NeuN, een marker voor neurale waarin en neurofilament, een marker voor neurale axonen, blijkt weinig tot geen verlies van weefsel dichtheid op de injectieplaats, naadloze interfacing tussen het gaas elektronica en hersenen weefsel impliceren. Kleuring voor GFAP (een marker voor astrocyten) verder blijkt in de buurt van-achtergrondniveaus van astrocyten rond mesh elektronica, die aangeeft dat haar aanwezigheid weinig chronische immuunrespons lokt.

Figuur 1: stappen in een spuit-injectable mesh elektronica experiment. Dit protocol beschrijft alle belangrijke stappen in een typisch knaagdier neurale opname experiment met behulp van mesh elektronica. Experimenten meestal met zich meebrengen, in volgorde van uitvoering, (1) vervaardiging van mesh elektronica, (2) laden van mesh elektronica in capillaire naalden, (3) stereotaxic injectie van mesh elektronica in de hersenen, (4) elektrische I/O interfacing om mesh elektronica, ingetogen of vrij bewegend-opnamen (5) en (6) mazen/weefsel segmenteren en kleuring voor histologie. In sommige studies, kunnen alleen de gegevens van de histologie worden gewenst, in welk geval stappen (4) en (5) kan worden overgeslagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: schematische voorstelling afgebeeld van de fabricage-procedure voor plug-and-play mesh elektronica in de regio ultraflexible apparaat (bovenste rij), stam interconnects (middelste rij), en I/O regio (onderste rij). (A) SU-8 negatieve fotoresist (rood) is patroon met PL masker-1 om te definiëren onder passiveren van laag van elke plug-and-play mesh elektronica sonde. (B) patronen met PL masker-2 thermische verdamping en metalen lift-off definiëren Au interconnects en I/O pads (goud). (C) patronen met PL masker-3, electron beam verdamping en metalen lift-off definiëren Pt elektroden (blauw). (D) SU-8 negatieve fotoresist (rood) is patroon met PL masker-4 om te definiëren van de passivating toplaag. Openingen in de SU-8 zitten bij elke Pt-elektrode en I/O pad. (E) A voltooid gaas elektronica sonde met onderbroken vakken die de locaties die uitgebreid in de boven-, Midden- en onderste rijen aangeeft. Photomask ontwerp bestanden zijn beschikbaar op verzoek van de auteurs of van de resource site, meshelectronics.org. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: foto's en beelden van de optische Microscoop van plug-and-play mesh elektronica. (A) optische Microscoop beelden van een spuit-injectable mesh elektronica sonde met plug-and-play i/o betegeld. De sonde werd beeld na de voltooiing van de fabricage in Figuur 2 , maar voorafgaand aan de release van de Ni-gecoate substraat stappen. Gestippelde vakken komen overeen van links naar rechts tot de onderdelen van de ultraflexible apparaat regio, stam en I/O regio vergroot in C, D en E, respectievelijk. Schaal bar = 1 mm. (B) foto van een 3-inch Si wafer 20 voltooid met mesh elektronica sondes. Schaal bar = 20 mm. (C) optische Microscoop afbeelding van 20 µm diameter Pt opname elektroden in de regio ultraflexible apparaat. Schaal bar = 100 µm. (D) optische Microscoop beeld van high-density Au interconnects in de regio van de stam. Elke Au interconnect is elektrisch geïsoleerd en een enkele Pt-elektrode verbindt met een enkele I/O-pad. Schaal bar = 100 µm. (E) optische Microscoop afbeelding voor I/O pads. Elk pad bestaat uit een inklapbaar mesh-regio en een continue dunne-film regio op de stengel. Niet-geleidend SU-8 linten sluit de mesh-gedeelten van de pads samen om te helpen handhaven uitlijning. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: montage van toestellen voor het houden van capillaire naalden tijdens injectie. (A) foto van de onderdelen van het apparaat. De onderdelen bevatten (1) een glazen capillaire naald, (2) een pipet houder, (3) een circulaire schroef bevestigingsmiddel voor de houder van de pipet en (4) een kegel wasmachine voor de houder van de pipet. Items (2) t/m (4) zijn inbegrepen in aankoopprijs van de houder van een pipet. De pijl markeert de uitlaat van de pipet-houder die moet worden gelijmd gesloten met epoxy. (B) pasfoto van de houder van de pipet na montage- en plaatsingskosten van een glazen capillaire naald. De toegevoegde epoxy is zichtbaar bij de bovenste uitlaat van de houder van de Pipet (aangegeven door de pijl) en capillaire buis verbindt de pipet houder met een injectiespuit (niet afgebeeld). (C) foto van de houder van de pipet en de capillaire naald na de bijlage naar het stereotaxic frame met een rechte hoek einde klem. Schaal bars zijn 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: laden van mesh elektronica in glas naalden. (A) Schematische illustratie van de laden-procedure voor plug-and-play mesh elektronica. Een naald van glas is geplaatst in de buurt van het einde van de I/O van een mesh elektronica sonde terwijl het in oplossing is geschorst. De plunjer van de injectiespuit wordt vervolgens handmatig teruggetrokken om te tekenen in de mesh elektronica sonde. Ideale positionering is met de ultraflexible apparaat regio net binnen het einde van de naald. (B) foto's overeenkomt met (A) voor een mesh elektronica probe in een glas naald wordt geladen. Schaal bars = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: schematische van het station stereotaxic chirurgie. Een gemotoriseerde stereotaxic frame (A) met bijgevoegde Pipetteer houder wordt gebruikt om de positie van de naald in de hersenen van de gewenste regio. De positie van de naald en geladen mesh elektronica worden gecontroleerd met een objectief en aangesloten camera (B) op een computer (C) weergegeven. Precieze hoeveelheid zoutoplossing stroomt een spuitpomp (D) door de naald, waardoor nauwkeurige, beheerste injectie van mesh elektronica in de hersenen van de gewenste regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: Plug-and-play I/O procedure interfacing. (A) een FFC klemmen substraat is beveiligd met tandheelkundige cement grenzend aan de craniotomy. (B) Plug-and-play mesh elektronica stereotaxically worden ingespoten in de regio van de gewenste hersenen met behulp van de methode van de FoV. (C) de naald, met de I/O pads van de Maas elektronica sonde nog binnen, verplaatst over de FFC klemmen substraat. (D) Flow wordt hervat door de naald te werpen de I/O pads op de FFC klemmen substraat. (E) de I/O pads zijn gebogen 90 ° ten opzichte van de stengel, met de geleidende zijde naar boven worden ontvouwd, en gedroogd in plaats. (F) de FFC substraat is geknipt met een schaar een lineaire ca. 0,5 mm vanaf de rand van de I/O pads. Overmaat substraat wordt gesneden weg om het inbrengen in een 32-kanaals ZIF-connector. (G) de I/O pads zijn ingevoegd in een 32-kanaals ZIF-connector op een aangepaste PCB gemonteerd. De ZIF-connector is vergrendeld gesloten om contact met de I/O pads. (H) de klink is gecementeerd gesloten, de PCB wordt gespiegeld op de schedel en de PCB ligt vast in plaats met tandheelkundige cement. (ik) de PCB vormt een compacte headstage met een standaard versterker connector voor gemakkelijk interfacing tijdens de opnamesessies. Schaal bars = 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: ingetogen en vrij bewegende opnames. (A) foto van een mannelijke C57BL/6J muis in een afdekking tijdens een opnamesessie. Een 32-kanaals voorversterker PCB is ingevoegd in de standaard versterker-connector. (B) foto van de dezelfde muis met 32-kanaals voorversterker PCB tijdens een vrij bewegende opname-experiment. Schaal bars = 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: vertegenwoordiger neurale opname resultaten. (A) vertegenwoordiger LFP warmte kaarten uit 32-kanaals mesh elektronica sondes geïnjecteerd in de muis hippocampus en Somatosensorische cortex. Gegevens waren opgenomen, terwijl de muis vrij onderzocht zijn kooi op 2 maanden (boven) en na injectie van 4 maanden (onder). LFP amplitude is kleurgecodeerde volgens de kleurenbalk aan de rechterkant. Hoogdoorlaat gefilterde sporen (zwart) tonen blancobepalingen activiteit overlaymodus op het spectrogram voor elk van de 32 kanalen. (B) Spikes geïsoleerd na het sorteren van de gegevens die zijn uitgezet in (A). Single-eenheid blancobepalingen activiteit is aangetroffen op 26 van de 32 kanalen beide 2 maanden na injectie (boven) en 4 maanden na injectie (onder). De getallen boven elk cluster van pieken komen overeen met de kanaalnummers in (A). Dit cijfer is gewijzigd van Fu, et al.. ²⁸. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 10: vertegenwoordiger histologie resultaten. (A) schema ter illustratie van de richting van mesh elektronica binnen de horizontale (middelste deelvenster) en Sagittaal (onderste paneel) hersenen segmenten. (B) fluorescentie Microscoop afbeelding van een 10 µm dik corticale hersenen segment één jaar na injectie van een 16-kanaals mesh elektronica sonde. Het segment geweest immunostained voor NeuN (groen). (C) de hetzelfde segment van de hersenen immunostained voor neurofilament (rood). (D) de dezelfde hersenen segment immunostained voor GFAP (cyaan). (E) A samengestelde afbeelding van (B) t/m (D) toont het gaas elektronica/weefsel interface met gelabelde NeuN (groen), neurofilament (rood), GFAP (cyaan), en gaas elektronica (blauw). Schaal bars = 100 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Fu et al. ²⁷. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende Video 1: herhaalde laden en injectie van mesh elektronica in oplossing. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Alle stappen in de fabricage en het gebruik van mesh elektronica zijn belangrijk, maar enkelen staan vooral kritisch tegenover. Voor het vrijgeven van de elektronica van de maaswijdte van hun wafel, is het essentieel om te oxideren van het oppervlak te maken van de mazen gemakkelijk geschorst in waterige oplossing (stap 1.6.1). Als deze stap wordt overgeslagen en de mazen meestal op het oppervlak van het water drijven, waardoor ze moeilijk te laden in de naalden, als zij geladen worden kunnen, ze vaak aan de zijkanten van de naalden van glas vasthouden, waarvoor grote hoeveelheden (> 100 µL) voor de injectie. Falen om te oxideren van het oppervlak, voordat de release, dus houdt meestal in dat de mazen kunnen niet worden gebruikt en de fabricage moeten opnieuw uitgevoerd vanaf het begin. Een andere belangrijke stap is het buigen van de mesh-elektronica "stammen" tot ~ 90° tijdens de I/O interfacing (stap 4.3). Als de hoek wordt minder dan 90°, zal dan alle 32 I/O pads niet passen in de ZIF-connector; Sommige zullen hebben tot het einde toe de toevoeging, vermindering van het aantal aangesloten elektroden worden afgesneden. Het proces moet ook voorzichtig worden gedaan om te voorkomen dat de stengel breken.

Het ontwerp van mesh elektronica kan worden aangepast voor verschillende toepassingen door de fotomaskers wijzigen en het gebruik van de dezelfde fabricage-procedure die wordt beschreven in Figuur 2. Bijvoorbeeld, terwijl de mesh elektronica sondes gebruikt voor de registratie van de gegevens in afbeelding 9 zijn ontworpen om 32 opname elektroden span de muis hippocampus en primaire Somatosensorische cortex, kan de plaatsing van de elektroden binnen het ultraflexible net worden geselecteerd te richten op vrijwel elke hersenen regio('s) of grotere elektroden voor stimulatie kunnen worden opgenomen²⁷. Dezelfde fundamentele mesh structuur en fabricage procedure blijven behouden, maar de elektrode plaatsing en het ontwerp worden aangepast om te voldoen aan de eisen van de studie. Onderzoekers moeten voorzichtig, echter, en altijd test dat gewijzigde ontwerpen gemakkelijk kunnen worden geïnjecteerd door de beoogde naalden. Kleine aanpassingen aan de buigende mechanica van mesh elektronica kan aanzienlijke gevolgen hebben voor injectiecapaciteit. Een voorbeeld hiervan is dat een hoek van 45° tussen transversale en longitudinale SU-8 linten levert een mesh elektronica sonde die facilely kan worden geïnjecteerd maar een hoek van 90° resulteert in dat verfrommelt en klompen naalden²¹.

Het meten van de impedantie van de elektroden van de opname is nuttig voor het oplossen van problemen. Een 20-µm diameter circulaire Pt-elektrode moet een impedantie omvang in de buurt van 1 MΩ gemeten met een frequentie van 1 kHz in vivo of in 1 x PBS²⁹. Een impedantie aanzienlijk groter dan dit impliceert dat de elektrode is niet blootgesteld, zoals kan gebeuren als het wordt verontreinigd met fotoresist residu, of niet elektrisch verbonden. Dit kan zich voordoen als, bijvoorbeeld, is er stof op de foto masker tijdens PL dat resultaten in een discrepantie in de Au interconnects, of als een van de mesh I/O pads is niet gecontacteerd door de ZIF-connector pinnen tijdens I/O interfacing. Een impedantie grootte ruwweg de helft van de verwachte waarde suggereert dat het kanaal kan worden kortgesloten met de aangrenzende, het creëren van een circuit van de twee impedances van de elektrode in parallel aan elkaar. De impedantie van de gemeten waarden fungeren als leidraad bij het oplossen van problemen; gecombineerd met de optische microscopie van de mesh elektronica sondes, de bron van het probleem kan meestal worden opgespoord en dienovereenkomstig gecorrigeerd in de volgende fabricage uitvoeren of I/O interfacing poging.

Het gebruik van spuit-injectable mesh elektronica voor acute studies is beperkt in dat single-eenheid blancobepalingen activiteit meestal niet tot 1 week post injectie^{27 waargenomen wordt}, hoewel recente werk (niet uitgegeven) toont aan dat dit probleem gemakkelijk is overwonnen. Belangrijke determinanten van de tijd die nodig is om te zien de Maas stekelige activiteit zijn ontwerp, de hoeveelheid vloeistof die geïnjecteerd in de hersenen samen met mesh elektronica, en de diameter van de naald gebruikt voor injectie, zoals deze van invloed zijn op de mate van weefselbeschadiging tijdens de injectie en de snelheid van genezing. Grote injectie volumes kunnen worden verlangd als de mesh-elektronica niet behandeld met zuurstof plasma voorafgaand aan de release in Ni etchant; dat wil zeggen, als het net niet hydrofiele, kan het voldoen aan de glazen naald. Soms hebben de mazen gebreken die leiden tot het buigen van de mechanica, waardoor ze moeilijk te injecteren. Tijdens het laden van de mesh-elektronica is het belangrijk om te controleren dat mazen gaan gemakkelijk en soepel binnen de naald (zoals weergegeven in aanvullende Video 1). Als dat niet het geval is, een verschillende mesh elektronische sonde moet worden gebruikt. Beste resultaten voor naadloze neurale interfacing zullen met de ideale injectie hoeveelheid 10 – 50 µL per 4 mm met ingespoten mesh lengte bereikt worden. Meer recente resultaten met fijnere mazen elektronica sondes geïnjecteerd en/of kleinere diameter capillaire naalden (zo klein als 150 µm binnendiameter, 250 µm buitendiameter) laten zien dat stekelige eenheid kan worden waargenomen vanuit kort na de injectie (acute metingen) door langere tijden. Masker ontwerp bestanden voor deze fijnere mazen structuren zijn beschikbaar op aanvraag of op de website van de resource, meshelectronics.org. We schatten het totale rendement van onze in-vivo mesh injectie procedures gebruik van 400 µm binnendiameter (buitendiameter 650 µm) naalden op ongeveer 70%, hoewel de opbrengst dichter bij 80-90% van onze recentere werk met 150 µm binnendiameter (250 µm buitendiameter is ) naalden. De meest voorkomende redenen voor mislukking zijn (1) dat het net niet soepel, doet injecteren resulterend in hersenen oedeem van onverwacht groot injectie volumes in de hersenen, (2) mesh breuk tijdens de manuele manipulatie vereist in de I/O interface procedure, en (3) bloeden uit de beschadiging van een bloedvat tijdens de injectie. Beschadiging van een bloedvat tijdens de injectie is zeldzaam (de oorzaak van minder dan 10% van mislukkingen) en zouden kunnen worden verminderd verder met behulp van beeld-geleide operatie. We constateren ook dat beschadiging van bloedvaten een gemeenschappelijke beperking van alle procedures waarbij penetratie van het hersenweefsel is, met inbegrip van de injectie van virale deeltjes voor transfectie, implantatie van stijve hersenen sondes, en injectie van de mesh-elektronica.

Mesh elektronica sondes kunnen stabiel opnemen en bijhouden in de dezelfde individuele neuronen op ten minste maanden jaar tijdschalen en roepen bijna geen chronische immuunrespons, zoals aangetoond in Figuur 9 en Figuur 10, respectievelijk. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van Conventie diepte-elektroden, die gewoonlijk lijden afnemende spike amplitudes, unstable signalen en chronische ontsteking in de loop van langdurige opname experimenten^{14, 15}. bovendien de mesh-elektronica hebben het voordeel dat ze in het weefsel achterblijven kunnen tijdens histologische afdelen, kleuring, en imaging, in tegenstelling tot conventionele sondes, die te rigide zijn en daarom moet worden verwijderd vóór de histologie analyses. Vandaar, mesh elektronica zorgen voor de unieke mogelijkheid om immunohistochemische analyse gebruiken voor het nauwkeurig bestuderen van de cellulaire omgeving elke opname-site.

Het protocol gepresenteerd hier opent-up spannende nieuwe kansen in de neurowetenschappen. De minimaal invasieve leveringsmethode en de naadloze integratie van mesh elektronica met hersenweefsel minimaliseert verstoring van neurale circuits en voorkomt chronische immuunrespons, die zouden kunnen van de meeste soorten chronische neurale opname experimenten profiteren. Het vermogen van mesh elektronica te registreren en bijhouden van de dezelfde interne neuronen voor lange perioden zullen met name van belang zijn voor onderzoekers willen milliseconde-schaal blancobepalingen activiteit te correleren met maand - aan jaar-lange processen zoals veroudering, de pathogenese van de ziekte van de hersenen, of^16,18van de ontwikkeling van de hersenen. Daarnaast bestaan er aanzienlijke mogelijkheden tot uitbreiden en aanpassen van dit protocol, zoals het toevoegen van actieve elektronica naar het PCB hoofd-toneel voor het implementeren van functionaliteit zoals digitale multiplexing van^8,35, draadloos mededeling^35,36,^,37, en signaalverwerking³⁵, mede via injectie van stamcellen of polymeren met de mesh elektronica om hulp bij het weefsel regeneratie^{18,38, 39}, en waarin nanowire veld - effect transistors (NW-FETs) in gaas elektronica voor uiterst gelokaliseerde en multifunctionele hersenen sondes^{24,29,40,41 ,42}.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gemotoriseerde stereotactische frame	World Precision Instruments	MTM-3	Voor stereotactische muischirurgie
512-kanaals opnamecontroller	Intan Technologies	C3004	Een onderdeel van het neurale opnamesysteem
RHD2132 versterkerbord	Intan Technologies	C3314	Een onderdeel van het neurale opnamesysteem
RHD2000 3 voet ultradunne SPI-interfacekabel	Intan Technologies	C3213	Een onderdeel van het neurale opnamesysteem
Muisbegrenzer	Braintree Scientific	TV-150 STD	Standaard 1,25 inch binnendiameter; gebruikt om de muis te beperken tijdens beperkte opname sessies.
Si-wafers	Nova Electronic Materials		3" P <100>.001-.005 ohm-cm 356-406 μm Dik Prime Grade SSP Si-wafers met 2 Semi-Std. Flats & 6.000 A°±5% Natte Thermische Oxide aan beide kanten.
Fotomaskers (chroom op soda-lime glas)	Advance Reproductions		Advance Reproductions en andere leveranciers produceren fotomaskers van geleverde ontwerpbestanden. Onze fotomasker ontwerpbestanden zijn beschikbaar op aanvraag of via de resourcewebsite, meshelectronics.org. Alternatief, sommige universitaire clean rooms hebben mask schrijvers voor het maken van fotomaskers op locatie.
AutoCAD software	Autodesk Inc.		Ontwerpsoftware voor het tekenen van fotomaskers. Een gratis alternatief is LayoutEditor. Onze fotomasker ontwerpbestanden zijn beschikbaar op aanvraag of via de resourcewebsite, meshelectronics.org.
Thermische verdamper	Sharon Vacuum		Gebaten om Ni, Cr en Au te verdampen op mesh elektronica tijdens fabricage. Veel universitaire clean rooms hebben dit of een soortgelijk gereedschap.
SU-8 2000.5 negatief fotoresist	MicroChem Corp.		Negatief fotoresist gebruikt om de onderste en bovenste passivatielagen van mesh elektronica te definiëren.
MA6 masker aligner	Karl Suss Microtec AG		Gebaten om elke fotomasker op het patroon op de wafer te richten en de wafer bloot te stellen aan UV-licht. De meeste universitaire clean rooms hebben dit of een soortgelijk gereedschap.
SU-8 ontwikkelaar	MicroChem Corp.		Gebaten om SU-8 negatief fotoresist te ontwikkelen na blootstelling aan UV-licht.
LOR3A lift-off resist	MicroChem Corp.		Gebaten met Shipley 1805 fotoresist om onderuitholling te bevorderen tijdens metalen lift-off processen
Shipley 1805 positieve fotoresist	Microposit, The Dow Chemical Company		Positieve fotoresist gebruikt om metalen interconnecties en Pt-elektroden in mesh elektronica te definiëren
MF-CD-26 positieve fotoresist ontwikkelaar	Microposit, The Dow Chemical Company		Om S1805 positieve fotoresist te ontwikkelen na blootstelling in een masker aligner. Veel universitaire clean rooms hebben deze chemische stof op voorraad.
Spin coater	Reynolds Tech		Voor het coaten van wafers met positieve en negatieve resists. De meeste universitaire clean rooms hebben spin coaters.
PJ plasma oppervlaktebehandelingssysteem	AST Products, Inc.		Gebaten om het oppervlak van mesh elektronica te oxideren vóór het vrijkomen in waterige oplossing. De meeste universitaire clean rooms hebben dit of een soortgelijk gereedschap.
Elektronenstraal verdamper	Denton Vacuum		Gebaten om Cr en Pt te verdampen tijdens de fabricage van mesh elektronica. Veel universitaire clean rooms hebben dit of een soortgelijk gereedschap.
Remover PG	MicroChem Corp.		Gebaten om LOR3A en Shipley S1805 resists op te lossen tijdens metaal lift-off
Ferric chloride oplossing	MG Chemicals	415-1L	Een onderdeel van Ni etsoplossing
36% zoutzuur oplossing	Kanto Corp.		Een onderdeel van Ni etsoplossing
Glazen capillaire naalden	Drummond Scientific Co.		Binnendiameter 0,40 mm, buitendiameter 0,65 mm. Andere diameters zijn beschikbaar.
Micropipet houder U-type	Molecular Devices, LLC	1-HL-U	Gebaten om de glazen capillaire naalden vast te houden tijdens stereotactische injectie
1 mL spuit	NORM-JECT®, Henke Sass Wolf		Gebaten voor handmatig laden van mesh elektronica in capillaire naalden
Polyethyleen intrademic katheterbuis	Becton Dickinson and Company		Binnendiameter 1,19 mm, buitendiameter 1,70 mm
5 mL spuit	Becton Dickinson and Company		Gebaten in de spuitpomp voor injectie van mesh elektronica in vivo
Oogstuk camera	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Gebaten om mesh elektronica binnen capillaire naalden te bekijken tijdens injectie
ThorCam uc480 beeldverwervingssoftware voor USB camera's	Thorlabs Inc.		Gebaten om mesh elektronica binnen capillaire naalden te bekijken tijdens injectie
Spuitpomp	Harvard Apparatus	PHD 2000	Gebaten om precieze volumes oplossing door capillaire naalden te laten stromen tijdens injectie van mesh elektronica
EXL-M40 tandborstel	Osada	3144-830	Voor het boren van de craniotomie
0,9 mm boorkorrel	Fine Science Tools	19007-09	Voor het boren van de craniotomie
Hete kraal sterilisator 14 cm	Fine Science Tools	18000-50	Gebaten om chirurgische instrumenten te steriliseren
CM1950 cryosectie-instrument	Leica Microsystems		Gebaten om bevroren weefsel in secties te snijden. Veel universiteiten hebben dit of een soortgelijk gereedschap beschikbaar in een gedeelde faciliteit.
0,3% Triton x-100	Life Technologies		Gebaten voor histologie
5% geitenserum	Life Technologies		Gebaten voor histologie
3% geitenserum	Life Technologies		Gebaten voor histologie
Konijn anti-NeuN	Abcam	ab177487	Gebaten voor histologie
Muis anti-Neurofilament	Abcam