Methodenartikel

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

DOI:

10.3791/58024

⸱

29 juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish (Danio rerio) bezitten orthologues voor 84% van de genen geassocieerd te worden met ziekten bij de mens bekend. Bovendien, deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo's. Recente vooruitgang in gen bewerkingsgereedschappen zijn precieze invoering van mutaties en transgenen in zebrafish inschakelen. Ziekte modelleren in zebrafish vaak leidt tot larvale fenotypes en vroege dood die kan lastig zijn om te interpreteren als genotypen onbekend zijn. Deze vroege identificatie van genotypen is ook nodig in experimenten waarbij monster bundelen, zoals gen expressie of massa spectrometrie studies. Uitgebreide genotypische screening wordt echter beperkt door traditionele methoden, die in de meeste laboratoria alleen op volwassen zebrafish of in postmortem larven worden uitgevoerd. We hebben behandeld dit probleem door aanpassing van een methode voor de isolatie van de genomic DNA PCR-klaar uit levende zebrafish larven die zo spoedig 72 h na bevruchting (hpf) kan worden bereikt. Deze tijd en de rendabele techniek, verbeterd ten opzichte van een eerder gepubliceerde genotypering-protocol, kunt de identificatie van genotypen van microscopische fin biopsieën. De vinnen regenereren snel naarmate de larven zich ontwikkelen. Onderzoekers kunnen vervolgens te selecteren en de gewenste genotypen naar volwassenheid verhogen door gebruik te maken van deze high-throughput genotypering PCR-gebaseerde procedure.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zebravis (Danio rerio) is een gewervelde organisme gebruikte als een model voor onderzoek van de ziekte zo goed als voor preklinische testen van therapeutische hypothesen1,2,3. Deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo's4. Door de toenemende ontwikkeling van transgene roman en gene technologieën zoals zink-vinger nucleasen (ZFN)5TAL-achtige Effector nucleasen (TALENs)6,7en de geclusterde regelmatig Interspaced korte bewerken Palindromische herhaalt (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde 9 (Cas9) systeem8, de zebravis is klaar om een aanzienlijke verbetering van het inzicht van verscheidene pathologische voorwaarden. Deze technologieën zijn gebruikt voor het maken van gerichte uitsparingen in zowel somatische en germline cellen in zebrafish, efficiënt teweegbrengt genetisch gemodificeerde dieren8. Recente voorbeelden in de literatuur zijn de succesvolle ontwikkeling van genetische modellen van epilepsie en metabole aandoeningen in zebrafish3,9,10,11,12 .

Met de vooruitgang die is geboekt in de zebravis genoom bewerken, snelle en betrouwbare genotypering uitgegroeid tot een onmiskenbare snelheidslimieten stap. Identificatie van specifieke DNA-mutaties, grenzend aan de voorspelde genoom-bewerken doelsite is een essentiële fase van het protocol. Traditioneel zijn genotypering technieken door fin knippen meestal alleen uitgevoerd in jonge of volwassen zebrafish. Echter, de tijd doorgebracht verhogen zebrafish naar volwassenheid (> 2 maanden) vertragingen aanzienlijk vooruitgang in onderzoek. In veel gevallen zijn volwassenheid niet haalbaar als gevolg van het knockout van essentiële genen (bijvoorbeeld in ziekte modellering) of winst-van-functie mutaties leidt tot fenotypische schadelijk. Bovendien verschillende tests vereisen bundeling van larven, zoals de extractie van RNA of metaboliet, en dus het betrekken van eerdere behoefteanalyses van de genotypes, die kan lastig zijn wanneer slechts post hoc genotypering technieken beschikbaar zijn. Deze bovengenoemde voorbeelden wijzen op het belang van larvale genotypering technieken die tegelijkertijd nauwkeurig en volledig herstel en normale ontwikkeling van het larven inschakelen. Vroege fase zebrafish genotypering momenteel niet op grote schaal worden gebruikt; Dit wordt weerspiegeld door recente publicaties van ziekte modellen waarin larvale genotypen zijn geïdentificeerd met behulp van post mortem genotypering in plaats van genotypering voorafgaande aan de uitvoering van het experiment12,13,14. In deze paper wordt een larvale fin clip strategie gepresenteerd ter verbetering van tevoren vastgelegde genotypering procedures.

In het verleden leven strategieën dienst proteïnase K spijsvertering aan genotype zebrafish larven hebben geleid tot variabele polymerase kettingreactie (PCR) efficiëntie15. Hoewel een meer onlangs gepubliceerd microscopische staart biopsie techniek verstrekt meer belovende resultaten16, waren wij en andere groepen niet in staat om de hoge efficiëntie en DNA herstel gemeld door de auteurs te reproduceren. Een grote tegenslag voor het protocol beschreven door Wilkinson et al. 16 zou de overdracht van het weefsel van de staart aan de PCR-buis. Als gevolg van de microscopische grootte is het moeilijk om ervoor te zorgen dat de fin is behoorlijk opgehaald en afgeleverd door pipetteren. Om deze barrière, hebben we een verbeterde protocol voor genotypering grote aantallen levende zebrafish larven met bijna 100% rendement9ontwikkeld. Met behulp van een microscalpel, is het puntje van de staart van de fin verwijderd en op een stuk papier van de filter geplaatst. Het stuk filtreerpapier met het weefsel kan worden gemakkelijk gevisualiseerd en correct geplaatst in een PCR-buis. Genomic DNA-extractie wordt vervolgens uitgevoerd, gevolgd door PCR versterking van de regio van belang naar genotype het model. De voordelen van deze methode zijn een hoog rendement van PCR, een laag valse positieve tarief en een laag sterftecijfer. Bovendien is genotypering van grote aantallen embryo's mogelijk met behulp van dit protocol. Het protocol hierin beschreven kunt fin-knippen van honderden larven binnen 2-3 uur met behulp van deze aanpak en een correcte identificatie van gegenotypeerde vis en staart regeneratie binnen twee dagen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd en zijn overeenkomstig de richtsnoeren van de verzorging van de dieren die door de Canadese Raad op Animal Care en de Universiteit van Ottawa dierenverzorgers commissies.

1. voorbereiding

  1. Prepareer het oppervlak van de dissectie door taping een 9 cm petrischaal deksel met autoclaaf tape over de binnenkant. Plaats deze onder een stereomicroscoop.
  2. Plaats van 3-5 dagen na bevruchting (dpf) zebrafish larven in een Petri schotel en anesthetize in ˜1.5 mM tricaïne in 1 x E3 embryo media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, pH 7,2).
  3. Het einde van een P1000 pipette uiteinde met een paar van schaar of een scheermesje afgesneden met een diameter van 2 mm voor een 3 dpf larve met minimale stress.

2. de fin knippen van zebravis larven

  1. Pak een narcose larve met behulp van de gewijzigde P1000 micropipet en plaatsen van de larve van de zebravis op een geplaatste autoclaaf tape op het deksel van de petrischaal.
  2. Verwijder overtollige tricaïne oplossing rond de larve die met behulp van een micropipet. Het gebied moet zo droog mogelijk met succes afdeling en ophalen van de fin maar nog nat om overleving.
  3. Met behulp van een micro scalpel, sectie de caudal fin onder een stereomicroscoop zoals aangegeven in Figuur 1, zoals beschreven in Wilkinson et al.16. Tijdens de insnijding van een gestage neerwaartse druk binnen de site van de kloof pigment van de caudal fin, distale op de grens van de bloedsomloop (figuur 1A) van toepassing. Zachte druk om te voorkomen beschadiging van de chorda van toepassing.
  4. Visualiseer de verdeelde fin onder de loep en plaatst het stuk op de top van het uiteinde van het microscalpel blad (figuur 2A). Plaats de microscalpel met van de vin op het oppervlak van een klein stukje filtreerpapier.
    Opmerking: Als gevolg van de aanwezigheid van melanocyten in de transected weefsel, deze stap maakt het mogelijk de visualisatie van de fin als een kleine zwarte vlek (figuur 2B).
  5. Met behulp van schaar en pincet (figuur 2C), overdracht het filtreerpapier met de vin aan een 96-Wells PCR plaat, met 25 μL van 50 mM NaOH oplossing per putje (figuur 2D).
  6. Voorbereiden van een flat-96-Wells bodemplaat, nummering van de put volgens het etiket van de PCR-plaat. Met behulp van de gewijzigde P1000 pipet gevuld met 200 µL van vers 1 x E3 embryo media, zorgvuldig verzamelen de larve van de zebravis met zachte druk. Afzien van de larve in de weefselkweek 96-wells-plaat, in hetzelfde goed nummer als de PCR-plaat (figuur 2E).
  7. Zorg ervoor dat het koffiefilter is goed ondergedompeld in de oplossing (figuur 2F). Reinig het mes van de microscapel en pincet tussen elke snede ter voorkoming van kruisbesmetting door dompelen het in 70% EtOH oplossing. Veeg het mes met schone papier weefsel/doekje.
  8. Herhaal stap 2.1-2.7 totdat alle embryo's hebben zijn afgekapt.
  9. Bewaar de larven in de 96-wells-plaat bij 28 ° C totdat de genotypen hebben geïdentificeerd.
    Opmerking: De embryo media hoeft niet te worden gewijzigd, aangezien het protocol kan gemakkelijk worden afgerond in minder dan 2 dagen. Als meer tijd nodig is, is het raadzaam een verandering van de media.

3. genomic DNA-extractie

  1. Het zegel van de 96-Wells PCR plaat en centrifuge de monsters bij 1.000 x g gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen dat alle papieren van de filters zijn ondergedompeld in de NaOH-oplossing.
  2. Warmte voor lysis van de weefsels, de monsters in een thermocycler bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door afkoeling tot 4 ° C gedurende 10 minuten.
  3. Voeg 6 l 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 aan elk monster. Vortex.
  4. Kort centrifugeren de plaat bij 1.500 x g, gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Gebruik 1.5 μL van de bovendrijvende substantie van DNA per PCR-reactie.
  6. De voorbereiding van een PCR te genotype de larven, zoals weergegeven in tabel 1-2.
    Opmerking: Dit protocol werd getest voor twee toepassingen: multiplex PCR reacties onthullen het genotype met agarose gel9en heteroduplex smelten assay (HMA) onthullen de genotypen met behulp van polyacrylamide-gel elektroforese (pagina)17.

4. alternatieve Genomic extractie met behulp van een chelaatvormers hars

  1. Volledige stap 2.5 door filtreerpapier met de geknipte fin toe te voegen aan een 96-Wells PCR plaat, met 30 μL van 5% chelaat hars (met gekoppelde iminodiacetate ionen copolymeer van styreen-divinylbenzeen).
    Opmerking: Dit soort hars wordt vaak gebruikt voor lysis van de weefsel en voorbereiding van gebruiksklaar voor PCR DNA in een snelle en efficiënte wijze18.
  2. Stappen 2.6-2.8 zoals aangegeven.
  3. Zegel van de 96-Wells PCR plaat en kort centrifugeren van de monsters moet ervoor zorgen dat alle filterpapier wordt ondergedompeld in de chelaatvormers hars.
  4. Warmte voor lysis van de weefsels, de monsters in een thermocycler bij 95 ° C gedurende 15 minuten gevolgd door afkoeling tot 4 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: Deze stap maakt het mogelijk lysis en de daaropvolgende binding van de polar harsparels naar cellulaire componenten terwijl DNA en RNA in oplossing blijven.
  5. Kort centrifugeren de monsters de harsparels pellet te verkrijgen van het DNA in de opschorting.
  6. Stappen 3.5-3.6 genotypering procedure wilt uitvoeren.

5. toepassing 1: Multiplex PCR, gevolgd door analyse van het Agarose Gel

  1. Tabel 1, stellen een multiplex PCR-reactie om de discriminatie tussen homozygoot mutanten, heterozygoten en WT larven. Gebruik een 96-Wells thermische cycler om uit te voeren van de PCR reacties met behulp van de fietsen voorwaarden beschreven in tabel 3.
    Opmerking: De PCR reacties kunnen ook worden uitgevoerd in elke andere conventionele PCR thermische cycler. In het volgende voorbeeld beschrijft de strategie van de PCR gebruikt door Pena, et al.. 9 om aldh7a1 WT en de mutant allelen 5-bp invoeging in dezelfde multiplex reactie te identificeren.
  2. Bereiden van een 1% agarose gel in natriumboraat buffer, gekleurd met 1 x GelRed.
    Opmerking: 20 x natriumboraat buffervoorraad is gemaakt van 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL ddH2O, pH aangepast tot 8,5 met 76 g boorzuur en vervolgens afgerond op 2 L eindvolume met behulp van ddH2O.
  3. De gel in 1 x natriumboraat buffer voor 15 min op 250 V worden uitgevoerd. De om proces te vergemakkelijken, indien mogelijk, gebruik een gel systeem dat compatibel is met meerdere kanalen pipets om hogere doorvoer mogelijkheden door het verminderen van de tijd om te laden van monsters.
  4. Het imago van de gel onder ultraviolet (UV)-licht dat discriminatie van de verschillende genotypen.

6. toepassing 2: Heteroduplex Assay smelten

  1. Bereiden pagina 12% gels met behulp van de plaat van 1,5 mm spacer en de 15-monsters kammen. Bereiden van twee pagina gelen met behulp van 12.21 mL van ddH2O, 2,52 mL van 10 x 10 mL van 30% acrylamide, Tris/boraat/EDTA (FSME), 250 μL van 10% ammoniumnitraat persulfate (APS) en 20 μL van tetramethylethylenediamine (TEMED). 1 x TBE buffer gebruiken (0.089 M Tris-HCl, 0.089 M boorzuur en 0,002 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) als het uitvoeren van de buffer.
  2. Verwarm de PCR producten bij 94 ° C gedurende 5 min.
  3. Koel de buizen op ijs of in de thermocycler gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  4. 10 μL per PCR monster en 8 μL van moleculair gewicht marker laden.
  5. De pagina uitvoeren bij 150 V in 1 x TBE met behulp van een verticale elektroforese systeem voor 1 uur of totdat de markering molecuulgewicht bijna bereikt de lijn van de voet van de glasplaat.
  6. Het imago van de gel onder UV-licht dat discriminatie van de verschillende genotypen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De efficiëntie van de protocoll werd aangetoond door genotypering de nakomelingen van een heterozygoot Kruis (aldh7a1+/ ot100, hier weergegeven als aldh7a1+/-) ()figuur 3A- C)9. De mutant aldh7a1ot100-allel heeft een 5-basenpaar (bp) inbrengen in de eerste codering exon van de zebravis aldh7a1 gen die tot frameshift en verlies-van-fun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen het uitgeven hulpmiddelen hebben gewerkt om juist mutaties en transgenen in zebrafish in de afgelopen jaren5,,6,,7,8. Bij het uitvoeren van ziekte modelleren in zebrafish, zijn vroege larvale of juveniele fenotypen vaak waargenomen9,12,13,14. Het hier gepresenteer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank de zeldzame ziekte modellen en mechanisme (RDMM) Network (gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) en het genoom Canada). CK wordt ondersteund door een UROP scholarship award (Universiteit van Ottawa). DLJ wordt ondersteund door een Vanier Canada Graduate beurs. IAP wordt ondersteund door een Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) postdoctoral fellowship award. De auteurs bedanken de Genetics Society of America voor het verlenen van toestemming voor publiceren van dit protocol en het gebruiken van een aanpassing van de aanvullende figuur 5 van Pena, et al..

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PetrischaaltjeCorning430167
MicroscalpelWorld Precision Instruments500249
StereomicroscoopNikonSMZ1500
Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatSigma-AldrichE10521
96-wells Tissue-cultuurplaatCostar3595
96-wells PCR-plaatFisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Tris base Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% Chelex 100 natriumvormSigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
BoorzuurSigma-AldrichB6768
Sub-Cell Model 192 systeemBio-Rad 1704508
30 % Acrylamide/Bis Oplossing, 37,5: 1Bio-Rad 1610158
GoTaq Green Master Mix, 2XPromegaM7123
papierdoekjes (Kimwipes® wegwerpdoekjes)Sigma-AldrichZ188956
1kb-plus moleculair gewichtsmarker Thermo ScientificSM1343
Nuclease vrij water Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 systeem (high-throughput agarose gel systeem)Bio-Rad 1704508
Verticaal gelelektroforese systeem Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  2. Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
  3. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
  4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  5. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  6. Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  7. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
  8. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  9. Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
  10. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410(2013).
  11. Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
  12. Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
  13. Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
  14. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
  15. Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
  16. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
  18. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
  19. Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GenotyperingsprotocolHigh throughput PCRnatriumhydroxide lysechelating resin extractiemultiplex PCR assayagarosegelelektroforesepolyacrylamidegelanalyse

Gerelateerde artikelen