Methodenartikel
Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.
Zebrafish (Danio rerio) bezitten orthologues voor 84% van de genen geassocieerd te worden met ziekten bij de mens bekend. Bovendien, deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo's. Recente vooruitgang in gen bewerkingsgereedschappen zijn precieze invoering van mutaties en transgenen in zebrafish inschakelen. Ziekte modelleren in zebrafish vaak leidt tot larvale fenotypes en vroege dood die kan lastig zijn om te interpreteren als genotypen onbekend zijn. Deze vroege identificatie van genotypen is ook nodig in experimenten waarbij monster bundelen, zoals gen expressie of massa spectrometrie studies. Uitgebreide genotypische screening wordt echter beperkt door traditionele methoden, die in de meeste laboratoria alleen op volwassen zebrafish of in postmortem larven worden uitgevoerd. We hebben behandeld dit probleem door aanpassing van een methode voor de isolatie van de genomic DNA PCR-klaar uit levende zebrafish larven die zo spoedig 72 h na bevruchting (hpf) kan worden bereikt. Deze tijd en de rendabele techniek, verbeterd ten opzichte van een eerder gepubliceerde genotypering-protocol, kunt de identificatie van genotypen van microscopische fin biopsieën. De vinnen regenereren snel naarmate de larven zich ontwikkelen. Onderzoekers kunnen vervolgens te selecteren en de gewenste genotypen naar volwassenheid verhogen door gebruik te maken van deze high-throughput genotypering PCR-gebaseerde procedure.
De zebravis (Danio rerio) is een gewervelde organisme gebruikte als een model voor onderzoek van de ziekte zo goed als voor preklinische testen van therapeutische hypothesen1,2,3. Deze dieren hebben een korte generatietijd, zijn eenvoudig te verwerken, weer een reproductieve hoog, lage kosten, en zijn gemakkelijk vatbaar voor genetische manipulaties door microinjection van DNA in embryo's4. Door de toenemende ontwikkeling van transgene roman en gene technologieën zoals zink-vinger nucleasen (ZFN)5TAL-achtige Effector nu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd en zijn overeenkomstig de richtsnoeren van de verzorging van de dieren die door de Canadese Raad op Animal Care en de Universiteit van Ottawa dierenverzorgers commissies.
1. voorbereiding
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De efficiëntie van de protocoll werd aangetoond door genotypering de nakomelingen van een heterozygoot Kruis (aldh7a1+/ ot100, hier weergegeven als aldh7a1+/-) ()figuur 3A- C)9. De mutant aldh7a1ot100-allel heeft een 5-basenpaar (bp) inbrengen in de eerste codering exon van de zebravis aldh7a1 gen die tot frameshift en verlies-van-fun.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Gen het uitgeven hulpmiddelen hebben gewerkt om juist mutaties en transgenen in zebrafish in de afgelopen jaren5,,6,,7,8. Bij het uitvoeren van ziekte modelleren in zebrafish, zijn vroege larvale of juveniele fenotypen vaak waargenomen9,12,13,14. Het hier gepresenteer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
De auteurs bedank de zeldzame ziekte modellen en mechanisme (RDMM) Network (gefinancierd door de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) en het genoom Canada). CK wordt ondersteund door een UROP scholarship award (Universiteit van Ottawa). DLJ wordt ondersteund door een Vanier Canada Graduate beurs. IAP wordt ondersteund door een Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) postdoctoral fellowship award. De auteurs bedanken de Genetics Society of America voor het verlenen van toestemming voor publiceren van dit protocol en het gebruiken van een aanpassing van de aanvullende figuur 5 van Pena, et al..
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Petrischaaltje | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscoop | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-wells Tissue-cultuurplaat | Costar | 3595 | |
| 96-wells PCR-plaat | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 natriumvorm | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boorzuur | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 systeem | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Oplossing, 37,5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| papierdoekjes (Kimwipes® wegwerpdoekjes) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus moleculair gewichtsmarker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease vrij water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 systeem (high-throughput agarose gel systeem) | Bio-Rad | 1704508 | |
| Verticaal gelelektroforese systeem Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen