Methodenartikel

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/58034

⸱

16 augustus 2018

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen voor het bestuderen van het menselijk brein. Een opkomende technologie om dit probleem te verhelpen is het gebruik van drie dimensionale (3D) neurale celculturen, betiteld als 'organoids' of 'spheroïden', voor de langetermijnbewaring van intercellulaire interacties met inbegrip van extracellulaire celadhesie-moleculen. Echter, deze cultuur-systemen zijn tijdrovend en niet systematisch gegenereerde. Hier, we detail een methode om snel en consistent produceren 3D cocultures van neuronen en astrocyten van menselijke pluripotente stamcellen. Eerste, vooraf gedifferentieerde astrocyten zijn neuronale voorlopercellen losgekoppeld en geteld. Vervolgens cellen worden gecombineerd in de bol-vormende gerechten met een Rho-Kinase inhibitor en op specifieke verhoudingen tot bollen van reproduceerbare grootte. Na verscheidene weken van cultuur als drijvende bollen, zijn cocultures ('Asteroïden') ten slotte gesegmenteerd voor immunokleuring of verguld op multielectrode arrays synaptic dichtheid en de sterkte te meten. In het algemeen verwacht wordt dat dit protocol 3D neurale bollen die volwassen cel-type beperkt markeringen weergeven, functionele synapsen vormen en spontane synaptic netwerkactiviteit barsten vertonen zal opleveren. Samen, toelaat dit systeem drug screening en onderzoek naar mechanismen van ziekte in een geschikter model ten opzichte van enkelgelaagde culturen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyten zijn een zeer overvloedige gliale celtype binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) met een scala aan functionele verantwoordelijkheden buiten structurele steun. Door middel van de secretie van oplosbare synaptogenic factoren en componenten van de extracellulaire matrix (ECM), astrocyten steun bij de oprichting en clustering van volwassen synapsen tijdens ontwikkeling1. Ze ook spelen een cruciale rol in het behoud van de gezondheid en de plasticiteit van synapsen t/m extracellulaire signalering2,3,4,5, en bijdragen aan de stabiliteit op lange termijn van homeostatische omgevingen door het reguleren van extracellulaire kalium en glutamaat, evenals de secretie van energie substraten en ATP6,7,8. Ten slotte, ze kunnen bijdragen tot de transmissie door het beïnvloeden van extrasynaptic stromingen9, en niet indirect invloed kunnen uitoefenen op de activiteit via andere celtypes zoals het bevorderen van myelinisering10. Belangrijker, omdat abnormaliteit of disfunctie van astrocyten tot veel neurologische syndromen en volwassen Neuropathologie leiden kan, is er een duidelijke behoefte aan het opnemen van astrocyten naast neuronen binnen gemanipuleerde neurale netwerken in volgorde voor een betere model van het endogene hersenen milieu. Een wezenlijk kenmerk van astrocyten is hun vermogen om de dynamische interacties vorm met neuronale synapsen1,11,12. Bij het ontbreken van glia vormen de neuronen een beperkt aantal synapsen, die in het algemeen ook functionele looptijd13 ontbreekt.

Menselijke astrocyten morfologische, transcriptionele en functionele kenmerken vertonen die — zoals toegenomen omvang en complexiteit van vertakkende, evenals soortspecifieke genen-dat zijn niet gerecapituleerd in knaagdieren12,14, 15. Dientengevolge, studies met behulp van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide neurale cellen hebben worden geaccepteerd als een middel van CNS-gerelateerde ziekten in vitro onderzoeken terwijl het ontwikkelen van nieuwe therapieën, letsel modellen en cultuur paradigma's16 ,17. Bovendien toestaan hPSCs de studie van menselijke synapse formatie en functioneren zonder de behoefte aan primaire weefsel18,19.

Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen van de menselijke hersenen. Er is behoefte aan een geschikt platform om te recapituleren zijn synaptic netwerken met hifi en reproduceerbaarheid. Onlangs, belang is gebleken bij de productie van 3D cultuur systemen (algemeen bekend als 'organoids,' 'spheroïden', of 'mini hersenen')20 tot complexe driedimensionale (3D) model structuren op mobiele en macro niveau. 3D cultuur systemen behouden ECM en cel-cel interacties die normaal afwezig of beperkt tijdens typische 2D coculture paradigma's21,22. Een overvloed aan technieken bestaan voor het kweken van 3D neurale spheroïden23,24,25; echter veel vereisen lange cultuur perioden (maanden tot jaren) voor spontane ontwikkeling en behoud van de laag, met de gebruiker vertonen zeer weinig controle over de output.

Hier, we illustreren een systematische methode om snel en consequent bioengineer Neurale interacties tussen meerdere celtypen (vooraf gedifferentieerde neuronen en astrocyten) afgeleid van hPSCs door het monteren van cellen in het gebied cocultures ('Asteroïden')26 die recapituleren mens-specifieke morfologische complexiteit van 3D. Gelijkmatig verspreide neurale subtypen dat volwassen eigenschappen overneemt na verloop van tijd en kunnen worden vertoond of vehiculumcontrolegroep in een high-throughput manier genereert deze high-density neurale systeem. We laten zien voor de eerste keer dat menselijke astrocyten synaptic netwerkactiviteit burst in deze 3D cocultures induceren. Dit protocol is bovendien gemakkelijk aan te passen voor het genereren van bollen van verschillende maten, te gebruiken van cellen die zijn opgegeven met verschillende regionale identiteiten van de CNS, en te bestuderen van interacties van meerdere andere celtypes zoals gewenst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cel cultuur en bereiding van het reagens

Opmerking: De protocollen in deze sectie zijn geschreven in de volgorde waarin ze worden weergegeven in het differentiatie-protocol (sectie 2). Zie de Tabel van materialen voor materialen en catalogus nummers.

  1. Gecoate platen voorbereiden celkweek.
    1. Verdun extracellulaire matrix (ECM) coating oplossing met DMEM/F12 media te bereiden een 1 mg/mL stockoplossing. Aliquot de verdunde ECM in 30 conische buizen van elk 3 mL stockoplossing en onmiddellijk worden opgeslagen in de-20 ° C. Resuspendeer voor een werkoplossing, 3 mL ECM voorraad in 33 mL pre gekoeld DMEM/F12 media, brengt het totale volume aan 36 mL voor een concentratie van 80 µg/mL.
    2. Jas 1 mL per putje van een 6-well cel cultuur plaat met ECM werkende oplossing. Voeg een extra 1 mL DMEM/F12 per putje (indien nodig) om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de put volledig bedekt is. Laat de gecoate 6-well cel cultuur platen zitten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur vóór gebruik.
      Opmerking: Gecoate platen kunnen worden opgeslagen in de incubator of bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.
  2. Bereiden media formuleringen, groeifactoren en kleine moleculen.
    1. Toevoegen om te bereiden 500 mL van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) middellange27, 20 x en 500 x supplementen volgens de instructies van de fabrikanten.
    2. Ter voorbereiding van 500 mL van neurale medium (NM), toevoegen heparine aan een definitieve concentratie van 2 mg/mL, 1 x antibiotica/antimycotic oplossing, 1 x B27 supplement of 1 x N2 aanvulling op een 500 mL fles DMEM/F12 met L-glutamine supplement als eerder gedetailleerde28.
    3. Ter voorbereiding van een 10 mM (1, 000 x) stockoplossing van Rho-Kinase Inhibitor Y27632 (Y), 10 mg poeder toevoegen in 3 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter steriliseren, monster, en opgeslagen bij-20 ° C. Gebruik op een 10 µM werken concentratie in de media.
    4. Ter voorbereiding van een 20 mM (10, 000 x) stockoplossing van SB431542, 10 mg poeder toevoegen in 1.3 mL dimethylsulfoxide (DMSO). Ter voorbereiding van een 2 mM (1, 000 x) stockoplossing van DMH1, 10 mg poeder toevoegen in 13,1 mL DMSO. Filter steriliseren, monster, en opslaan van elke oplossing bij-20 ° C. Gebruik telkens in een 2 µM werken concentratie in de media (NM + SB431542 + DMH1).
      Opmerking: Dit protocol raadt 2 µM werken concentraties van beide SB431542 en DMH1 op basis van onze opmerkingen en verslagen van anderen29 waarin wordt verklaard dat deze concentratie effectief neurale inductie van hPSCs bevordert. Hogere concentraties zijn ook gemeld30. Bovendien, met alternatieve media, heeft het ook aangetoond dat kleine moleculen niet nodig voor hoge neurale conversie31 zijn. Zo werken concentraties is afhankelijk van de alternatieve cel cultuur omgevingen en optimale concentraties moeten worden getest door individuele onderzoekers.
    5. Ter voorbereiding van de individuele 100 µg/mL (10, 000 x) voorraadoplossingen van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor-2 (FGF2), voeg 1 mg van elk in 10 mL PBS + 0,1% BSA. Aliquot EGF en FGF2 oplossingen in 50 µL aliquots voorraad en opslaan bij-80 ° C. Gebruik telkens in een 10 ng/mL werken concentratie in de media; bijvoorbeeld, voeg 5 µL EGF en 5 µL FGF2 aan 50 mL NM (EGF, NM + FGF2).
    6. Ter voorbereiding van een stamoplossing van doxycycline hydrochloride (Dox), eerst los poeder in DMSO tot 100 mg/mL en opgeslagen bij-20 ° C. Verder verdunnen om een 2 mg/mL (1, 000 x) stockoplossing in PBS en winkel bij-20 ° C. Gebruik bij 2 µg/mL werken concentratie in de media; bijvoorbeeld, voeg 50 µL Dox aan 50 mL NM (NM + Dox).
      Opmerking: Opnieuw niet bevriezen van oplossingen na het ontdooien.

2. productie van neurale subtypen van menselijke geïnduceerde pluripotente cellen (hPSCs)

Opmerking: Alle celculturen moeten worden gehandhaafd in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 ° C. Deze culturen zijn gehandhaafd op kamer zuurstofniveaus, al lagere niveaus kunnen worden gebruikt.

  1. Genereren en onderhouden van Astrocyt progenitoren (hAstros) van hPSCs.
    Opmerking: Deze sectie bevat een korte en vereenvoudigde differentiatie-protocol. Voor een gedetailleerde beschrijving (met vorming van embryoid lichaam, rozet selectie en regionale patronen stappen) verwijzen naar de eerder beschreven protocol28 (figuur 1A, gestippelde groene doos).
    1. De clusters van het zaad van hPSCs (figuur 1B) op ECM-gecoate 6-Wells-platen (zie stap 1.1) met hPSC medium + Y 2 mL per putje. Feed de stamcellen elke dag tot ze ongeveer 50% confluente en split zo nodig.
      1. Als u wilt splitsen hPSCs, voeg 1 mL van passaging reagens putjes en gecombineerd na 1 min. Incubate cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten, voeg 1 mL van hPSC medium, en splitsen van aggregaten 1:10 op nieuwe ECM-gecoate putten in 2 mL zuiver hPSC medium + Y per putje.
    2. De stamcellen handhaven totdat ze ongeveer 50% heuvels, dan verandering media naar NM + SB431542 + DMH1 voor het opwekken van neurale differentiatie (dag 0). Wanneer cellen zijn ongeveer 95% heuvels, 1:6 gesplitst in nieuwe ECM-gecoate putten in hetzelfde medium.
    3. Op dag 14, de cellen met detachement oplossing en transfer naar een niet-gecoate kolf met Y ter bevordering van de vorming van aggregaten te distantiëren.
      Opmerking: De toevoeging van Y wordt gebruikt ter bevordering van de celvorming overleving en bol maar is niet inbegrepen tijdens elke feed.
    4. Voor de generatie van neuronale voorlopercellen en neuronen (hNeurons), deze dag-14 cellen worden gebruikt zoals hieronder beschreven. Alternatief, gebruik maken van deze cellen op latere tijdstippen uit enkelgelaagde of bol culturen voordat neuronale rijping plaatsvindt of gliogenesis begint.
      Opmerking: Standaard produceert dit protocol dorsal-corticale astrocyten. Echter kunnen Astrocyt subtypen regionaal worden opgegeven door de toevoeging van patronen van morphogens indien gewenst28,32,33. Retinoïnezuur (RA) kan worden toegevoegd om caudalize cellen in het ruggenmerg fenotypen, terwijl sonic hedgehog (SHH), geslepen agonist (SAG), of purmorphamine ventrale fenotypen zal produceren.
    5. Voor de generatie van Astrocyt progenitoren en astrocyten bij spontaan gevormde 3D aggregaten (hAstrospheres), ga naar NM EGF + FGF2 en wekelijkse (of als nodig om te zorgen voor stabiele pH)-feed als eerder gedetailleerde34.
      1. Zachtjes distantiëren hAstro aggregaten met detachement oplossing wanneer donkere centra weergeven en verwijder bollen die spontaan koppelen. Breken bollen zachtjes eenmaal per week om bol gezondheid te behouden en om te voorkomen dat necrotische kernen.
        Opmerking: Niet meer dan 5 min van behandeling met detachement oplossing.
      2. Na 4-6 maanden van expansie, bevestigen bevriezen cel identiteit en ofwel in cryopreservatie medium (volgens de instructies van de fabrikant) of alternatieve opslag voorwaarden voor behoud op lange termijn in vloeibare stikstof, of het gebruik onmiddellijk voor experimenten.
    6. Om te ontdooien een bevroren voorraad van hAstrospheres, ontdooien snel een flesje bij kamertemperatuur, transfer de inhoud naar een lege 15 mL conische buis en centrifugeer bij 300 x g gedurende 1 min. zorgvuldig gecombineerd supernatant wassen met DMEM/F12 en herhaal voor een totaal van twee wash stappen. Voeg aan de maatkolf van een T25 met een totaal volume van 6 mL NM + EGF + FGF2 + Y (of schaal omhoog zo nodig).
  2. Genereren en onderhouden van afleidbare neuronen (iNeurons) van hPSCs.
    1. Zaad transgene hPSCs (met een stabiele doxycycline-afleidbare neurogenin 2 transgenic35) op ECM-gecoate 6-Wells-platen met hPSC medium + Y 2 mL per putje (zoals hierboven beschreven voor niet-transgene lijnen). Feed dagelijks met 2 mL per putje totdat ze zijn klaar om op te heffen op 70% confluentie media. Cellen splitsen, zoals beschreven in stap 2.1.2.
    2. Wanneer cellen zijn ongeveer 35% confluente, voeg NM + Dox om differentiatie in iNeurons. Handhaven als een enkelgelaagde cultuur met NM + Dox voor 2 dagen voordat u verdergaat met stap 3.2.
      Opmerking: Cellen zal de overgang naar de neuronale voorlopercellen maar zal niet nog uitbreiden neurites (Figuur 1 c).

3. voorbereiding en het onderhoud van de 3D bol Cocultures

  1. HAstros van 3D aggregaten in suspensie (zoals beschreven in stap 2.1.5.1) te distantiëren.
  2. HNeurons of iNeurons van een 2D enkelgelaagde distantiëren.
    1. Verwijder media uit 6-well plaat en voeg 500 µL van detachement oplossing aan elk putje met enkelgelaagde culturen. Incubeer bij 37 ° C voor 5 min. zachtjes Voeg 2-3 mL DMEM/F12 voor de gekoppelde cellen verwijderen.
    2. Verzamelen van cellen en media in een conische tube van 15 mL en centrifuge bij 300 x g gedurende 1 min. Aspirate het supernatant, voeg 1 mL verse media en Pipetteer omhoog en omlaag zachtjes met een 1.000 µL micropipet om de schorsing van een enkele cel.
  3. Formulier 3D bollen met behulp van de microwell cultuur platen.
    1. Plaat voor te bereiden door toevoeging van 0,5 mL van de anti-naleving van de spoeldouche oplossing aan elk putje van de plaat van de microwell. Centrifugeer plaat bij 2.000 x g gedurende 5 min. spoeldouche oplossing van Aspirate, voeg 1 mL DMEM/F12 aan elk putje te wassen, en opnieuw gecombineerd.
      Opmerking: Zorg altijd ervoor dat de centrifuge tijdens het gebruik is evenwichtig.
    2. Tellen elk celtype met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Voeg de gewenste verhouding van gedissocieerde hAstros en hNeurons of iNeurons aan elk putje in een totaal volume van 2 mL van NM + Y (inclusief Dox als iNeurons worden gebruikt). Centrifugeer plaat bij 100 x g gedurende 3 min en terugkeren naar de incubator.
      Opmerking: 24-well microwell platen (Zie de Tabel van materialen) bevat 300 microwells per putje. Het toevoegen van een minimum van 6 x 105 cellen (voor bollen van 2 x 103 cellen) en een maximum van 6 x 106 cellen (voor bollen van 2 x 104 cellen) in 2 mL zuiver media per putje. Gebruik van een bepaalde hoeveelheid cellen voor levensvatbare sferen met een specifieke dichtheid binnen dit bereik, en delen door 300 voor het berekenen van het aantal cellen per bol. Alternatieve sfeer vormen van methoden en instrumenten kan ook gebruikt worden indien gewenst. Volg de instructies van de fabrikant van voor aanvaardbare marges van de cel dichtheden.
    3. Toestaan dat cellen zelf monteren in dichtbevolkte verpakt sferen binnen microwell platen in de komende 2 dagen (figuur 2A). Vervang 50% media als de cultuur is geel.
      Opmerking: Slechts de helft media uit te wisselen en Pipetteer voorzichtig bij het verwijderen en het toevoegen van media om niet te storen van de bollen. Bollen kunnen verheffen van microwells en smelten samen met hogere kracht.
    4. Na 2 dagen, bollen zachtjes uit microwells met een 1.000 µL micropipet (Figuur 1 d) te verwijderen. Licht toepassen kracht onderin microwells met media te verwijderen elke extra zelfklevend sferen. Laat de bollen vestigen in een conische tube van 15 mL, gecombineerd de oude media en nieuwe media toevoegen.
  4. Opzetten van de spinner kolf bioreactor systeem voor de vorming van 3D bollen.
    1. Reinigen van het oppervlak van een magnetische roer plaat met 70% ethanol, plaats deze in een cel cultuur incubator. Autoclaaf individuele spinner kolven te steriliseren.
    2. Bollen met een minimum van 50-60 mL media toevoegen aan elke maatkolf spinner (Figuur 1 d, inzet). Plaats de kolf op de plaat van de magnetische roer vastgesteld op 60 rpm. Cultuur bollen in spinner kolven totdat ze klaar voor het verzamelen van gegevens zijn.
      Opmerking: Minimaal 3 weken in cultuur is nodig voor de synapse formatie. Indien de spinner kolf bioreactor systeem niet gewenst is, kunnen bollen in stationaire omstandigheden in de cel cultuur kolven of gerechten worden gekweekt. Bollen mogen ook worden ingesloten in ECM of hydrogel.

4. meting van de levende Synaptic fysiologie met Multielectrode Arrays (MEA's)

  1. MEA's voorbereiden celkweek.
    1. Schoon oppervlak van elke MEA met 1 mL wasmiddel voor 1 h. spoelen met steriel gedeïoniseerd water (DI), spoel met 70% ethanol te steriliseren, en dan lucht droog in bioveiligheid kabinet onder UV-licht.
      Opmerking: MEA's kunnen worden opgeslagen in DI water bij 4 ° C onder steriele omstandigheden tot gebruik.
    2. Bereid een 0,5 mg/mL oplossing van poly-ornithine (PLO) door het oplossen van 50 mg PLO in 100 mL boorzuur buffer. Coat het oppervlak van elke MEA met 1 mL van de PLO te maken de oppervlakte hydrofiele en Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 4 h. verwijderen de PLO, wassen van het oppervlak met DI water, voeg 1 mL voor ECM (zie stap 1.1.1), en Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur.
    3. Verwijder ECM en plaats van bollen in 1,5 mL van media op een oppervlak van MEA, ervoor te zorgen dat de bollen zijn geplaatst op de top van de elektrodenserie (figuren 3A, 3A'). Mogelijk te houden voor 2 dagen. Wijzig de helft van de media elke 2-3 dagen (of zo nodig vaker), ervoor te zorgen dat de bollen niet worden verstoord.
      Opmerking: Toevoeging van groeifactoren kan verbeteren cultuur overleving en rijping.
  2. Het meten van elektrische activiteit van neurale bollen.
    1. Opzetten van een multielectrode array (MEA) systeem met een headstage voor temperatuurgevoelig. Een softwareprogramma maakt met een 5 Hz high-pass-filter, een 200 Hz low-pass filter en een Prikker drempel van 5 x standaarddeviatie (SD).
    2. Plaats de MEA op headstage en record spontane elektrische activiteit (figuur 3BB'). Ruwe gegevens, met inbegrip van spike frequentie en amplitude voor statistische analyse opslaan.
      Opmerking: Een perfusie-systeem kan worden gebruikt met de MEA toevoegen farmacologische agenten of stroom van verse media voor langdurige opnames. Extra post-processing van pieken kan worden uitgevoerd als gewenste36,37.

5. meting van de synaptische dichtheid met immunocytochemie

  1. Voorbereiden van de reagentia.
    1. Om een 500 mL stockoplossing van 4% paraformaldehyde (PFA), voegt u 400 mL 1 x PBS aan een bekerglas van glas of een roer-plaat in een geventileerde kap. Roer bar en warmte toevoegen aan 60 ° C terwijl roeren; niet koken. 20 g PFA poeder toevoegen aan de verwarmde PBS-oplossing en breng de pH op 6,9 door langzaam toevoegen van 1 N NaOH ontkleuring.
      Opmerking: 4% PFA oplossing kunnen aliquoted en opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal een maand.
    2. 20 g of 30 g van sacharose toevoegen aan 100 mL PBS te maken van 20% en 30% oplossingen van sacharose, respectievelijk.
    3. Voeg 1 mL afwasmiddel tot 10 mL PBS te bereiden van een stamoplossing van 10%. Omkeren van meerdere keren te homogeniseren.
    4. Voeg 250 µL van 10% wasmiddel stockoplossing (eindconcentratie van 0,25%) en 500 µL van geit en ezel Sera (eindconcentratie van elk 5%) tot 10 mL PBS te bereiden de primaire blokkeerbuffer.
    5. Voeg 100 µL van geit en ezel Sera (eindconcentratie van 1% elk) tot 10 mL PBS te bereiden de secundaire buffer met blokkerend.
  2. Voorbereiding van de monsters.
    1. Breng de bollen in een conische tube van 15 mL, hen te vestigen op de onderkant van de buis in staat stellen en de oude media gecombineerd. Spoel bollen met 500 µL van PBS, laat regelen, en gecombineerd PBS. Voeg 500 µL van 4% PFA (of genoeg ter dekking van de bollen) en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
    2. De PFA gecombineerd en zachtjes spoel tweemaal met PBS. Toevoegen van 20% sacharoseoplossing en Incubeer bij 4 ° C gedurende enkele uren of 's nachts. Zorgvuldig gecombineerd toe te voegen 30% sacharoseoplossing, en Incubeer bij 4 ° C gedurende enkele uren of 's nachts.
      Opmerking: Monsters kunnen worden bewaard bij 4 ° C in PBS of sacharose voor maximaal 1 week voordat u verdergaat met de volgende stap. Zo niet snijden, handhaven als 3D bollen (figuur 4A-C) in een tube van 1,5 mL en gaat u verder met stap 5.3.
    3. Als het snijden van de bollen, zorgvuldig overbrengen bollen een insluiten cryogene schimmel op de top van droogijs. De 30% sacharoseoplossing gecombineerd en langzaam giet weefsel oplossing in de mal te embedding totdat het volledig het monster dekt, het vermijden van luchtbellen. Wacht tot oplossing bevriest en opslaan bij-80 ° C tot de cryostaat snijden.
    4. Met behulp van een cryostaat bij-20 ° C, segment de ingesloten blokken in 30 µm secties (of desgewenst) en transfer naar glas dia's. Bewaren bij-80 ° C tot klaar om vlek.
  3. Immunokleuring de bollen.
    1. Een overzicht van de randen van de dia's met een hydrofobe PAP pen om te voorkomen dat vloeibare morsen. Het bereiden van primaire en secundaire blokkerende oplossingen met antilichamen (Zie de Tabel van de materialen). 500 µL van primaire blokkeerbuffer toevoegen aan elke dia of de buis en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    2. De vloeistof afzuigen, 500 µL van verse primaire blokkeerbuffer met verdunde primaire antilichamen toevoegen aan elke dia of de buis en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Verwijder primair antilichaam oplossing en 3 x met PBS voor elke 10 min wassen.
    3. 500 µL van secundaire buffer met blokkerend met verdunde secundaire antilichamen toevoegen aan elke dia of de buis en Incubeer bij 4 ° C voor 1 h. secundair antilichaam oplossing verwijderen en 3 x met PBS voor elke 10 min wassen.
      Opmerking: Een lijst van aanbevolen antilichamen worden verstrekt in de Tabel van materialen. Andere antilichamen of kleurstoffen kunnen worden gebruikt als gewenste. TL voorbeelden om aan te steken (stap 5.3.3 verder) niet blootstellen.
    4. Voeg 50 µL oplossing ontkleuring te dekken van het oppervlak zorgvuldig plaatst een dekglaasje aan op de dia, het vermijden van bubbels te monteren. Laat de dia's bij kamertemperatuur gedurende 24 uur drogen en bewaren bij 4 ° C.
  4. Het imago van de dia's.
    1. Gebruik een fluorescente microscoop confocal of twee-foton met een 63 X olie onderdompeling doelstelling naar afbeelding pre en post synaptic eiwit overvloed en colocalization binnen de segmenten van de bol (Figuur 4 d). Een 20 X of 40 X doelstelling gebruiken om te visualiseren morfologische kenmerken van de hAstros.
    2. Open fluorescentie-afbeeldingsbestanden met ImageJ software. Tellen pre-en post synaptische puncta handmatig met behulp van de mobiele teller plug-in, met behulp van een onbevooroordeelde tellen methode als de eerder gedetailleerde38of met alternatieve methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wanneer goed uitgevoerd, zal dit protocol omschreven populaties van functionele cocultures van astrocyten28,33,34 en neuronen35 gegenereerd op basis van hPSCs (figuur 1A-1C), produceren als gedetailleerde eerder26 en hier beschreven in stap 2.1-2.2. Deze stapsgewijze procedure, met het gebruik van micro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we een systematische methode voor de productie van 3D bollen van neurale cocultures. De bollen zijn samengesteld uit astrocyten en neuronen, die onafhankelijk zijn afgeleid van hPSCs. Hoewel nog niet de focus van dit protocol, kan de generatie van pure populaties van astrocyten van hPSCs28 is een cruciale stap en technisch uitdagende indien dat gebeurt zonder voorafgaande ervaring. Deze eerste stap in de generatie van deze synaptic micro schakelingen moet worden uitgevo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zouden graag bedanken Dr. Erik Ullian (UCSF) voor intellectuele input over het ontwerp van deze procedures, Dr. Michael Ward (NIH) voor technisch advies over iNeuron differentiatie, en Saba Barlas voor voorlopige beeldanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6 well plateFisher Scientific08-772-1B
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLDetachment solution
AggreWell plateStemcell Technologies34850
Anti-Adherence Rinsing SolutionStemcell Technologies7010Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/antiThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Media Supplement
BrainPhys neuronal mediumStemcell Technologies5790Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslipsNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologies7930Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042With GlutaMAX supplement
DMH-1Stemcell Technologies73634HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 μM
Donkey serumLampire Biological Laboratories7332100Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox)SigmaD3072-1mlHAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 μg/mL
Epidermal growth factor (EGF)PeprotechAF-100-15Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF)Peprotech100-18BWorking concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solutionSouthern Biotech0100-01
Glass slidesFisherbrand22-037-246
Goat serumLampire Biological Laboratories7332500Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counterLife TechnologiesAMQAX1000
HeparinSigmaH3149-50KUWorking concentration: 2 mg/mL
Magnetic plateDLAB8030170200
Matrigel membrane matrixCorning354230ECM coating solution. Working concentration: 80 μg/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 SystemMultichannel SystemsMEA2100
Mounting solution
N2Thermofisher17502048Media Supplement
OCTTissue-Tek4583Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold)Scientific Device Laboratory9804-02
Paraformaldehyde (PFA)Acros Organics169650025HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poly-l-ornithine (PLO)SigmaP3655-100MGWorking concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slipsFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y)Tocris1254Working concentration: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234Working concentration: 2 μM
Spinner flasksFisher Scientific4500-125
SucroseFisher ChemicalS5-3Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture FlaskOlympus Plastics25-207Vented caps
T75 Culture FlaskOlympus Plastics25-209Vented caps
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADetergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal mediumStemcell Technologies5940Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplementsStemcell Technologies5940Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100SigmaX100-500MLDetergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blueInvitrogenT10282
Antibodies
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Secondary antibody
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Secondary antibody
EzrinThermofisherMA5-13862Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAPChemiconMAB360Primary antibody; astrocytes
GFPAvesGFP-1020Primary antibody; astrocytes
Glt1Gift from Dr. Jeffrey Rothsteinn/aPrimary antibody; astrocytes
HomerSynaptic Systems160 011Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2Synaptic Systems188 004Primary antibody; neurons
PSD95Abcamab2723Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100Abcamab868Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1Synaptic Systems106 103Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3)CovanceMMS-435PPrimary antibody; neurons

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106(2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474(2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626(2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286(2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181(2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423(2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D neurale coculturenastrocyt neuron cocultuurvorming van synaptische circuitsanalyse met multielektrodenmatrixneurale inductieprotocolcel dissociatietechniekmethode voor sfeervormingimmuunkleuringsanalysespontane netwerkbursts

Gerelateerde artikelen