Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Summary

In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.

Abstract

De mechanische eigenschappen van de kern bepalen haar reactie op mechanische krachten gegenereerd in cellen. Omdat de kern moleculair continu met het cytoskelet is, zijn methoden nodig om de sonde van het mechanische gedrag in Adherente cellen. Hier bespreken we de directe werking sonde (DFP) als een instrument om het geweld zich rechtstreeks wenden tot de kern in een levende aanhangend cel. We hechten een smalle micropipet aan de nucleaire oppervlak afzuigen. De micropipet is vertaald uit de buurt van de kern, waardoor de kern te vervormen en te vertalen. Wanneer het herstel kracht gelijk aan de zuigkracht is, de kern wordt verbroken en elastisch ontspant. Omdat de zuigdruk precies bekend is, is de kracht op het nucleaire oppervlak bekend. Deze methode is gebleken dat de nano-schaal krachten volstaan om te vervormen en vertalen van de kern in Adherente cellen, en geïdentificeerd cytoskeletal elementen waarmee de kern krachten weerstaan. De DFP kan worden gebruikt voor het ontleden van de bijdragen van cellulaire en nucleaire componenten nucleaire mechanische eigenschappen in levende cellen.

Introduction

Ziektebeelden zoals kanker impliceren wijzigingen aan nucleaire vorm en structuur^1,2, die over het algemeen vergezeld gaan van een 'verzachtende' van de kern^3,4. Nucleaire weerstand aan mechanische vervorming in het algemeen gekenmerkt door een kracht naar geïsoleerde kernen⁵.

De kern in cellen is het moleculair verbonden met het cytoskelet door de Linker van Nucleoskeleton en het cytoskelet (LINC) complexe^6,,^7,,^8,9. Dientengevolge, is de kern mechanisch geïntegreerd met het cytoskelet en, door middel van cel-substraat verklevingen, de extracellulaire matrix. Mechanisch sonderen de kern binnen Adherente cellen kan inzicht geven in deze mechanische integratie. Methoden voor het manipuleren van de kernen in levende cellen omvatten micropipet aspiratie^10,11, en atomic force microscopie^12,13,14. We onlangs beschreven een directe kracht-sonde (DFP) toepassing van mechanische krachten direct bij de kern in een levende aanhangend cel¹⁵.

We schetsen hier, de procedure voor het gebruik van een systeem van microinjection dat is vaak beschikbaar in microscopie faciliteiten toe te passen een bekende, nano-schaal mechanische kracht direct op de kern in een aanhangend cel. Een femtotip (0,5 µm diameter micropipet tip) is gemonteerd en aangesloten op het systeem van microinjection door een buis. De tip, geplaatst in een hoek van 45° ten opzichte van het oppervlak van de cultuur schotel, is verlaagd tot grenzend aan het nucleaire oppervlak. De buis is vervolgens verbroken en opengesteld voor de sfeer, die wordt gemaakt van een negatieve zuigdruk op het nucleaire oppervlak en bezegelt het uiteinde van de micropipet tegen de nucleaire oppervlak. Door middel van vertaling van de micropipet tip, is de kern vervormd en uiteindelijk (afhankelijk van de omvang van de uitgeoefende kracht), los van de micropipet. Dit detachement treedt op wanneer herstel (weerstand) krachten, uitgeoefend door de celkern en cel, gelijk de zuigkracht toegepast door de micropipet. Analyse kan worden uitgevoerd door het meten van de verplaatsing van de kern, de lengte stam (vergelijking 1) of de stam van de ruimte (figuur 1A).

Protocol

1. voorbereiding cellen van Imaging

Opmerking: De directe werking sonde (DFP) kan worden gebruikt voor elk celtype aanhangend. Hier, worden NIH 3T3 muis fibroblasten gebruikt als de cellijn model voor dit protocol.

1. Cultuur NIH 3T3 fibroblast cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% donor runderserum en 1% penicilline-streptomycine op een 35-mm glazen bodem schotel tot gewenste confluentie. Houden cellen bij 37 ° C en 5% CO₂.
   1. Zorg ervoor dat alle gerechten van de onderkant van de 35-mm glas met 5 µg/mL fibronectine (of soortgelijke ECM eiwit), vóór het zaaien van NIH 3T3 cellen voor imaging jas.
      Opmerking: De cellen moeten worden volledig verspreiden en aanhangend op de schotel voor het experiment. Er zijn niet alle beperkingen op het gebied van confluentie DFP de methode werken.
2. Wassen onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, de cellen tweemaal met PBS gevolgd door een enkel wassen met volledige groeimedium.
3. Voeg 3 mL van volledige groeimedium aan de glazen bodem schotel.

2. microscopie en beeldacquisitie

Opmerking: Een omgekeerde fluorescentie Microscoop (of equivalent) met micromanipulator op de zijarm, volgens de aanbevelingen van de fabrikant geïnstalleerd. De Microscoop moet ook worden uitgerust met een milieu kamer om de temperatuur bij 37 ° C, en 5% CO₂ niveau te handhaven. Er is ook een micromanipulator en microinjector gekoppeld aan de Microscoop vereist. Een olie-immersie 40 x / 1.3 nb of 60 x / 1,49 NB (of gelijkwaardige doelstellingen) worden aanbevolen voor de experimenten. De Microscoop moet worden gemonteerd op een vibratie isolatie tafel.

Figuur 1 . Nucleaire vervorming en het concentreren van de Microscoop
A. maximale nucleaire vervorming en ontspanning van nucleaire vervorming. Voor de berekening maximale nucleaire vervorming, waren de rug randen van de nucleaire vormen eerst viel samen om te corrigeren voor de vertaling van misvormde nucleus. De vorm van de kern op het moment van micropipet tip detachement was die op de aanvankelijke nucleaire shape worden bedekt voordat trekken. Het verschil in ruimte tussen de twee shapes werd gemeten als Δeen₁. De maximale nucleaire vervorming werd gedefinieerd als ΔA₁ gedeeld door de oorspronkelijke nucleair gebied. Ook een tweede parameter, ΔA₂, kan worden gedefinieerd door te bedekken de eindtoestand steady nucleaire vorm na micropipet detachement op de oorspronkelijke nucleaire vorm. B. richten de cel in een vliegtuig en verplaats het brandvlak tot vliegtuig B te vinden de tip van micropipet. Tijdens imaging, werd de micropipet vertaald naar rechts (richting van oranje pijl). Dit cijfer is gewijzigd van Neelam et al. ¹⁵. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

1. Inschakelen van de microinjector per protocol van de fabrikant.
2. Met behulp van een onderdompeling olie druppelaar, toepassing een druppel van onderdompeling olie op de top van het objectief.
3. Klem de schotel strak in de schotel-houder en de houder van de schotel op het podium te laden.
   Opmerking: De cellen moeten op 37 ° C en 5% CO₂ gedurende het gehele experiment worden gehouden.
4. Pas de hoogte van de doelstelling om de cellen in focus (vliegtuig A, figuur 1B).
5. Verplaats het stadium van de Microscoop te vinden van een cel van belang.
6. Draai de joystick op het micromanipulator om de pipet houder naar de bovenste positie. Laad de 0,5 µm diameter tip micropipet op de houder van de pipet.
   1. Om te voorkomen dat de cel adhesie aan de micropipet, vooraf behandelen de micropipet tip met 0,3 mg/mL PLL-g-PEG oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Testen op hechting door de micropipet aan de kern zonder enige zuigdruk aan te raken, en dan het vertalen van de micropipet uit de buurt van de kern. Het gebrek aan hechting kan worden onderscheiden van een compleet gebrek aan nucleaire vervorming en vertaling.
      Opmerking: Volg vervaardiging suggesties te openen van het pakket.
7. Het objectieve brandvlak boven vlak A en de bovenkant van de cel naar vliegtuig B verhogen door de fijne controle aan te passen (figuur 1B, zie stap 2.4).
8. Stel de micromanipulator op grof controle. Breng langzaam het micropipet tot vliegtuig B door te kijken voor het silhouet van de micropipet, totdat de micropipet volledig in focus komt.
9. Zodra de micropipet tip in focus is, stel de micromanipulator op fijne controle.
10. De doelstelling van het equatoriale vlak van de cel (vliegtuig A, figuur 1B) lager en lager van de micropipet tot ongeveer 15 µm boven vlak A (figuur 1B, onderbroken micropipet).
11. De compensatie druk (P_c) instellen op de microinjector aan de gewenste druk; Wacht enkele seconden voor de druk om te stabiliseren.
    Opmerking: De optimale druk instelpunt hangt zowel celtype en de specifieke doelstellingen van het experiment. Voor de meeste gevallen zou 300 hPa een goed uitgangspunt.
12. Zorg ervoor dat de micropipet niet met behulp van de Clean -instelling op het paneel van micromanipulator en controleren om ervoor te zorgen dat er luchtbellen ontstaan uit de micropipet tip is verstopt.
13. Breng de tip in de cel door de micropipet geleidelijk te verlagen tot de tip is de nucleaire oppervlak licht aanraken.
    Opmerking: Wanneer de micropipet te verlagen, het silhouet van de micropipet tip zal duidelijk worden als het komt in focus. Voordat de micropipet de kern raakt, het verhogen van de objectieve focus en uitlijnen van de micropipet tip bij nucleus (dezelfde x-y-coördinaat, hogere z-plane). Terugkeer van de focus terug naar het equatoriale vlak van de kern (vliegtuig A, figuur 1B) en geleidelijk lager de micropipet tip.
14. Maak een afdichting tussen het uiteinde van de micropipet en het kernmembraan door los te koppelen van de druk-levering-buis uit het systeem van microinjection, waardoor het openen van het uiteinde van de buis van de micropipet aan de sfeer. Deze stap maakt een negatieve druk gelijk is aan P_c op het nucleaire oppervlak.
15. Verwerven van beelden met de microscopen afbeelding collectie software. Een avi-acquisitie (video) of nd-acquisitie (afbeeldingen) in de afbeelding collectie software instellen.
    Opmerking: Voor elke imaging software verwerven, real-time video imaging of instellen time-lapse afbeelding overnames met een korte tijdsinterval.
16. Schakelen om de overeenkomstige TL imaging kanaal (dat wil zeggen, GFP, RFP, etc.) en imaging beginnen.
17. Vertalen van het micropipet uiteinde van het lichaam van de cel (aan de rechterkant, figuur 1B) totdat de kern is losgekoppeld van de micropipet.
    Opmerking: Trek de tip langs de positieve x-richting (naar rechts in het gezichtsveld). Het trekken tarief kan worden geprogrammeerd en gecontroleerd door de computer of de joystick handmatig kan worden verplaatst. Hebben we niet gevonden geen correlatie tussen het trekken tarief en nucleaire vervorming¹⁵ suggereren een voornamelijk elastische reactie te dwingen.

3. de gegevensanalyse

1. Beeld analyses uitvoeren met het enige fundamentele beeld-verwerkende software beschikbaar. De omvang van de nucleaire vervorming kan worden gekwantificeerd door de lengte stam (Ɛ) of de stam van de ruimte (figuur 1A). Kwantificeren van lengte stam met behulp van vergelijking 1, waar L en L₀ vertegenwoordigen de lengtes van de kern op maximale vervorming en de aanvangspositie, respectievelijk.
   (Vergelijking 1)

Results

Figuur 2A toont het dwingen van een NIH 3T3 muis fibroblast nucleus. Zoals de tip micropipet is vertaald naar het recht, de kern vervormt en uiteindelijk het micropipet uiteinde losgekoppeld. De stam van de lengte van de kern wordt gezien om te verhogen met toenemende zuigkracht (figuur 2B). De voorste rand van de kern (micropipet trekken van de rand) vormt een nucleaire uitsteeksel en de afvallende flank wordt verplaatst van de ...

Discussion

Het meten van de mechanische integratie van de kern met het cytoskelet is een uitdaging voor de meest actuele methoden, zoals micropipet aspiratie¹⁶, omdat ze beide geïsoleerde kernen (waar de kern is van het cytoskelet ontkoppelde) vereisen of kernen in zwevende cellen (waar de extracellulaire krachten, zoals tractie krachten, zijn afwezig is). Kracht is vereffend met de nucleus door biaxial stam toe te passen op cellen aanhanger naar een membraan^17,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	uit productie genomen, huidig equivalent model: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Huidig model FemtoJet 4i
Plan Fluor olie-immersie 40x	Nikon	NA
Apo TIRF olie-immersie 60x	Nikon	NA
Donor Runder Serum (DBS)	ThermoFisher Scientific	16030074	NIH 3T3 serum
Dulbecco's Modificatie van Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 medium
Penicilline-Streptomycine	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 medium supplement
Immersieolie Type LDF Niet-fluorescerend	Nikon	77007	Immersieolie voor objectieflens