Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te phycobiliprotein inhoud in de cyanobacterium Synechocystis een spectrofotometrische methode kwantitatief te bepalen. De extractiemethode werd ook met succes toegepast op andere cyanobacteriën en algen stammen; wegens verschillen in pigment absorptiespectra is het echter noodzakelijk is om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk onderzoek.

Samenvatting

Dit is een simpel protocol voor de kwantitatieve bepaling van phycobiliprotein in het model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteïnen zijn de belangrijkste onderdelen van de phycobilisomes, het grote licht-oogst antennes in cyanobacteriën en verschillende taxa van de algen. De phycobilisomes van de Synechocystis bevatten twee phycobiliproteïnen: phycocyanin en allophycocyanin. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte en betrouwbare methode voor de kwantitatieve bepaling van zowel phycocyanin en allophycocyanin in dit model cyanobacterium. We vergeleken de verschillende methoden van phycobiliprotein extractie en spectrofotometrische kwantificering. De extractie procedure zoals beschreven in dit protocol was ook met succes toegepast voor andere cyanobacteriën stammen zoals Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., en Nostoc sp., alsmede over de rode algen Porphyridium cruentum. Echter de coëfficiënten uitsterven van specifieke phycobiliproteïnen van verschillende taxa kunnen verschillen en het is daarom aangeraden voor het valideren van de methode spectrofotometrische kwantificering voor elke één stam individueel. Het protocol vereist weinig tijd en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de wetenschap van het leven van de standaard aangezien het vereist alleen standaard uitrusting.

Inleiding

fPhycobiliproteins zijn wateroplosbaar pigment-eiwitcomplexen die belangrijke componenten van de antennes licht-oogst in prokaryotische cyanobacteriën (Cyanophyceen) en diverse eukaryotic taxa (Glaucophyta, Rhodophyta vertegenwoordigen , en Cryptophyta)¹. Ze ontstaan voornamelijk supramoleculaire complexen genaamd phycobilisomes en ze zijn meestal gekoppeld aan het oppervlak van de fotosynthetische membranen op de stromale kant, met uitzondering van Cryptophyta, waar de phycobiliproteïnen zijn gelokaliseerd in de thylakoïde lumen². Vier soorten phycobiliproteïnen up-to-date zijn geïdentificeerd: de kern-allophycocyanin, en de perifere phycocyanin, phycoerythrin en phycoerythrocyanin¹. Als de belangrijkste licht-oogst complexen vormen phycobilisomes een van de cruciale factoren van algen en cyanobacteriën massa culturen productiviteit. Het is aangetoond dat phycobilisomes afkappen biomassa accumulatie onder sterke licht³kunt verbeteren. Aan de andere kant onder bescheiden of lage bestralingssterkte resulteerde de antenne truncatie in groeicijfers en biomassa accumulatie vermindering^3,4. Phycobiliproteïnen worden commercieel gebruikt als voedsel kleurstoffen, geneesmiddelen en additieven in de cosmetische industrie, en als fluorescentie sondes met toepassingen in stroom cytometry, fluorescerende immunoassay en fluorescentie microscopie⁵.

Dit protocol is gericht op de kwantitatieve bepaling van phycobiliproteïnen in het model cyanobacterium Synechocystis. Blauwalgen zijn de vroegste Oxygene fotosynthetische autotrophs; ze hebben de vorming van de aardse biosfeer voor meer dan 2,4 miljard jaar⁶. Ze spelen een cruciale rol in wereldwijde biogeochemische cycli van koolstof, stikstof, zuurstof en andere elementen. Onder cyanobacteriën, een eencellige stam Synechocystis een unieke positie verworven omdat het was de eerste cyanobacterium met het hele genoom sequenced^7,8, het is natuurlijk gassamenstelling door exogene DNA⁹, en voert het stabiele en relatief snelle groei^10,11. In Synechocystis, het kernonderdeel van antenne, allophycocyanin, is gekoppeld aan de integraal membraaneiwitten en de bijgevoegde phycocyanin bevindt zich in de periferie van de membraan thylakoïde.

Verschillende methoden voor de winning van de phycobiliprotein en kwantificering worden vergeleken in dit protocol. De definitieve extractiemethode werd succesvol toegepast voor Synechocystis, alsmede voor andere cyanobacteriën stammen, met inbegrip van Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., en Nostoc sp., en het was ook succesvol toegepast op rode algen Porphyridium cruentum. Daarom is de methode ontwikkeld in dit protocol kan worden beschouwd als een universele methode voor de extractie van de phycobiliprotein. Hoewel sommige van de geteste extractiemethoden in hogere totale proteïne opbrengsten resulteerde, de hier beschreven extractiemethode mits de hoogste phycobiliprotein levert samen met de laagste hoeveelheid chlorofyl een residu in de phycobiliprotein extract. Vermindering van de hoeveelheid chlorofyl een was essentieel voor de juiste phycocyanin en allophycocyanin spectrofotometrische kwantificering.

De phycobiliprotein absorptiespectra kan aanzienlijk verschillen tussen verschillende algen en cyanobacteriën soorten^{12,13,14,15,16,17} en zelfs onder de verschillende stammen van een enkele cyanobacteriën geslacht¹⁸. Dus, de specifieke golflengten en absorptie coëfficiënten zoals gebruikt voor de bepaling van phycocyanin en allophycocyanin in Synechocystis gelden niet in het algemeen aan andere stammen. Bovendien bevat geen Synechocystis phycoerythrin en phycoerythrocyanin die worden in sommige andere algen en cyanobacteriën gevonden kan. Met het oog op de bepaling van phycobiliproteïnen in stammen dan Synechocystis, is het aanbevolen om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk evalueren.

Hoewel het protocol bevat twee langere stappen ('s nachts vriesdrogen van de cellulaire pellets en 1 uur eiwit extractie), is de tijd van de totale arbeid voor de kwantificering van phycobiliproteïnen niet dan 2 uur.

Protocol

1. cyanobacteriën teelt

1. Cultiveren van Synechocystis cellen in conische kolven of in photobioreactors^10,19 in gebufferde BG11 middellange²⁰ te handhaven een pH van < 10 (bijvoorbeeldmet behulp van 17 mM HEPES¹⁰).
   Opmerking: Standaard teelt omstandigheden vereisen een gecontroleerde temperatuur (meestal 30 ° C, de optimale temperatuur is 35 ° C)²¹, verlichting (meestal een witte licht met een intensiteit tot 800 µmol [fotonen] / [m²·s])²¹, en een CO levering van de ₂ (in de flat-panel photobioreactor van 400 mL, is de groei verzadigen van CO₂ -concentratie 1.700 ppm)²¹.
2. Om te bepalen van de dichtheid van de cultuur, het meten van de extinctie van de cultuur spectrophotometrically op 730 nm (OD₇₃₀) met behulp van een cuvet met een lichtpad van 1 cm. u kunt ook de cellen onder een microscoop met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel tellen teller.

2. monsters voorbereiding

1. Werken onder lage bestralingssterkte om te voorkomen dat de aantasting van de phycobiliprotein.
2. Oogst 3 x 1 mL cultuur schorsing safe-lock buizen. Gebruik triplicates voor de schatting van technische fouten in de meting. Voor het uitvoeren van de bemonstering van de cultuur onder steriele omstandigheden, oogsten van de cellen in een laminaire kap en volgen van de goede praktijken van de arbeids- en veiligheid.
3. Centrifugeer de cellen bij 15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 minuten aandacht besteden aan de evenwichtige centrifugerotor. Na het centrifugeren, gooi het supernatant. Zorg dat u niet te verstoren de pellet.
4. Zet de monsters in een vriezer. Voor langdurige opslag, houden de monsters bij-80 ° C. Dit is noodzakelijk om te voorkomen dat de aantasting van de phycobiliprotein. -20 ° C is op korte termijn opslag, voldoende.
5. Freeze-Dry de monsters 's nachts. Voor een juiste freeze-drying proces, houden de temperatuur van de condensor freeze-dryer onder-60 ° C en de druk in de freeze-droger kamer ongeveer 1 hPa.
6. Na het beëindigen van de freeze-drying cyclus, sluit u de buis zo spoedig mogelijk om te voorkomen dat de reabsorptie van water uit de lucht.

3. cel homogenisering en pigmenten extractie

1. Vier stuks glaskralen (met een diameter van 2 mm) toevoegen aan elke Monster buis en sluit de buizen.
   Opmerking: Wanneer het deksel van de buis van de safe-lock gebruikt voor homogenisering te dun is, het kan breken tijdens de homogenisering; Daarom worden alleen safe-lock buizen met sterke deksels aanbevolen voor dit protocol.
2. Meng de monsters met de glasparels voor 15 s op een homogenizer bij laboratorium temperatuur.
   Opmerking: Een goed gehomogeniseerde monster is verspreid over de gehele binnenzijde van de safe-lock buizen.
3. Voeg 1 mL PBS buffer (pH 7.4), precooled tot 4 ° C, om de monsters te uittreksel van phycobiliproteïnen.
   Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de monsters op het ijs om te voorkomen dat de afbraak van de uitgepakte eiwitten. Dit is van cruciaal belang.
4. Meng de monsters met PBS gedurende 5 s op de homogenizer bij laboratorium temperatuur.
   Opmerking: Na het mengen, de monsters zijn groenachtig.
5. Na het mengen, houd de monsters op ijs voor 60 min. Cover het ijsbad met een deksel om te voorkomen dat de aantasting van de pigmenten.
6. Centrifugeer na 60 min van phycobiliprotein extractie, de monsters bij 15.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten aandacht besteden aan goed het evenwicht van de centrifugerotor.
   Opmerking: Na het centrifugeren, het supernatant heeft een cyaan-blauwe kleur.

4. Phycobiliprotein kwantificering

1. Kalibreren voor de spectrofotometrische meting, de spectrofotometer aan de basislijn met behulp van de PBS-buffer als een leeg.
2. Zodra de spectrofotometer is gekalibreerd, negeren de PBS van een spectrofotometer cuvette en Pipetteer het supernatant met uitgepakte phycobiliproteïnen in plaats van met de afgedankte buffer.
3. Kwantificeren van de concentratie van phycobiliprotein spectrophotometrically, met een breedte van de gleuf van 0,5 nm.
   1. Meet de extinctie van de phycocyanobilins in phycocyanin en allophycocyanin tegen de PBS buffer leeg op 615 nm (een₆₁₅) en 652 nm (een₆₅₂), respectievelijk, en meet de extinctie van de cellulaire puin op 720 nm (een₇₂₀).
   2. Bereken de concentratie Bennett en Bogorad¹²van phycocyanin en allophycocyanin volgens de vergelijkingen (1) en (2):
      
      
      Opmerking: Een₆₁₅, een₆₅₂en een₇₂₀ moeten aanpassen aan het bereik van de lineaire absorptie van de spectrofotometer valt. Eventueel verdunnen het monster met PBS buffer.
4. Berekenen van de concentratie van pigment in de originele exemplaren. De concentratie pigment in de steekproef komt overeen met de resultaten van vergelijkingen (1) en (2) wanneer cultuur 1 mL en 1 mL van de extractie-buffer worden gebruikt voor de analyse. In het geval van het gebruik van verschillende volumes van cyanobacteriën monsters en/of PBS buffer, moet de definitieve pigment-concentratie worden berekend volgens vergelijking (3):
   (3)
   Opmerking: In geval van een normalisatie phycobiliprotein inhoud per cel drooggewicht, de definitieve pigment-concentratie moet worden berekend volgens vergelijking (4) (4)

5. de bepaling van de cel droge gewicht (optioneel)

1. Weeg drie lege safe-lock buizen op analytische saldi.
   Let op: Het is essentieel dat de safe-lock buizen droog zijn. In het geval van het opslaan van drogen de buizen in een vochtige omgeving, de buizen voor enkele uren in een bevriezing van de droger alvorens met een gewicht van hen. Manipuleren van de buizen voorzichtig en alleen met poedervrije gehandschoende handen om te voorkomen dat ieder contact tussen het materiaal en het researcher's vingers. Houd alle houders en centrifugeer schoon om te voorkomen dat de overdracht van enig materiaal aan de buizen.
2. Monster 1 x 15 mL van de cultuur schorsing aan 15 mL conische buis.
3. Centrifugeren van de suspensie van de cultuur in de 15 mL conische buisjes bij 4000 x g bij laboratorium temperatuur voor 10 min. saldo de centrifugerotor met drie extra 15 mL conische buizen, elk met 15 mL water. Werp 12 mL van het supernatans dat na het centrifugeren.
4. Resuspendeer de pellet in het resterende supernatant en breng 3 x 1 mL van het mengsel drie 1.5-mL safe-lock buizen met een pipet. In het geval dat wat restjes van de pellet blijven in de conische buis 15 mL, voeg 1,5 mL gedeïoniseerd water aan de conische buis, vortex of schud de buis te resuspendeer de resterende pellet en 3 x 0,5 mL van het mengsel aan de drie 1.5-mL safe-lock buizen (al containi ng 3 x 1 mL van de pellet) met een pipet.
   Nota: De pellet te verdelen over drie 1.5-mL safe-lock buizen zal toestaan de schatting van een technische fout van het droge gewicht meten.
5. Centrifugeer de cellen in 1.5-mL safe-lock buizen bij 15.000 x g bij laboratorium temperatuur voor 5 min. saldo de centrifugerotor met een extra 1.5-mL safe-lock buis waarin 1 mL water. Na het centrifugeren, gooi het supernatant.
6. Zet de monsters in de vriezer. Voor langdurige opslag, houden de monsters bij-80 ° C; voor de korte termijn opslag is-20 ° C voldoende.
7. Freeze-Dry de monsters 's nachts. Voor een juiste freeze-drying proces, houden de temperatuur van de condensor bevriezen droger lager dan-90 ° C en de druk in de freeze-droger kamer ongeveer 1 hPa.
8. Na het vriesdrogen, sluit de buizen en wegen van de monsters op analytische saldi.
   Opmerking: De waarde van het droge gewicht kan worden gebruikt voor de normalisatie van de inhoud van de phycobiliprotein per cel drooggewicht.

Resultaten

Voor de eerste methode tests, was Synechocystis als batch culturen in conische kolven op een shaker gekweekt in BG11 teelt middellange²⁰ (aangevuld met 17 mM HEPES) bij 25 ° C, onder een warm wit licht met een intensiteit van 50 µmol (fotonen) / (m ²·s) en met 1% CO₂ in de kweken atmosfeer. Tijdens de teelt, de culturen werden bemonsterd safe-lock buizen en gecentrifugeerd (15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 ...

Discussie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en reproduceerbare methode voor de kwantificering van phycobiliprotein inhoud in de model cyanobacterium Synechocystis. Verschillende methoden van cel homogenisering, eiwit extractie en phycocyanin en allophycocyanin kwantificering worden vergeleken, en het laatste protocol is een combinatie van de optimale stappen van elke één procedure. Als representatieve gegevens, was de inhoud van phycobiliproteïnen gekwantificeerd in Synechocystis cellen onder toeneme...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Synechocystis sp. PCC 6803	Institut Pasteur, Paris, Frankrijk	6803	Cyanobacteriumstam
Roti-CELL PBS	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Duitsland	9143.1	Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes	Eppendorf, Hamburg, Duitsland	30120086	Safe-lock buisjes 1,5 ml
VWR 80-Place Storage System	VWR International, Radnor, Pennsylvania, VS	30128-282	Houders voor safe-lock buisjes
RAININ 100 µl -1000 µl	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, VS	17014382	Pipet
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8	Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, VS	30389272	Pipet tips
Rotina 420R	Hettich, Kirchlengern, Duitsland	4701	Gekoelde centrifuge voor 1,5 ml safe-lock buisjes en 15 ml kegelvormige centrifuge buisjes
LCexv 4010	Liebherr, Bulle, Zwitserland	9005382197172	Koel- en vrieskast -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, VS	EXF24086V	Vrieskast -80 °C
CoolSafe	LaboGene, Lillerød, Denemarken	7.001.000.615	Vriesdroger
UV-2600	Shimadzu, Kyoto, Japan	UV-2600	Spectrofotometer
Hellma absorptie cuvettes, semi Micro	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS	Z600288	VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0,75-1,5 ml, spectraal bereik 200-2500 nm
Silamat S6	Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein	602286WU	Homogenisator
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS	Z273627	Glazen kraal met diameter 2 mm
CPA225D-0CE	Sartorius AG, Göttingen, Duitsland	SECURA225D-1OBR	Analytische weegschaal
C-Phycocyanin from Spirulina sp.	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS	P2172	Phycocyanine standaard
Allophycocyanin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS	A7472	Allophycocyanine standaard
Bicinchoninic Acid Kit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS	BCA1, B9643	Complete kit voor totale eiwitbepaling
AlgaeTron	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Tsjechië	AG 130-ECO	Kweekkamer voor E. kolven, met regelbare licht- en atmosfeer
Fotobioreactor	Photon System Instruments Ltd., Drásov, Tsjechië	FMT-150	Kweekapparatuur voor cyanobacteriën en algen met volledig regelbare omgeving
Cellometer	Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, VS	Auto M10	Celteller
Corning 15 mL centrifuge tubes	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, VS	CLS430791	15 ml Centrifuge buis voor droog gewicht bemonstering
Herasafe KS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, VS	51024579	Laminaire stroomkap