Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58077

⸱

16 november 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

In dit artikel

Samenvatting

Het aantal nieuwe biomaterialen ontworpen voor het herstellen van grote bot laesies groeit voortdurend met als doel het verbeteren bot genezing en het overwinnen van de complicaties geassocieerd met bot transplantatie. Hier presenteren we een multidisciplinaire strategie voor preklinische biocompatibiliteit testen van biomaterialen voor bot reparatie.

Samenvatting

Grote non-adhesie botbreuken zijn een belangrijke uitdaging in de orthopedische chirurgie. Hoewel de auto- en allogene bottransplantaten uitstekend geschikt zijn voor de genezing van dergelijke laesies, zijn er mogelijke complicaties met hun gebruik. Dus, materiële wetenschappers ontwikkelen synthetische, biocompatibel biomaterialen om deze problemen. In deze studie presenteren wij een multidisciplinair platform voor de evaluatie van biomaterialen voor bot reparatie. We expertise uit bot biologie en immunologie te ontwikkelen van een platform met inbegrip van in vitro osteoclast (OC) en osteoblast (OB) testen en in vivo Muismodellen van bot reparatie, immunogeniciteit en allergeniciteit gecombineerd. We laten zien hoe uit te voeren van de experimenten, het samenvatten van de resultaten, en het verslag over biomaterial biocompatibiliteit. In het bijzonder, we getest OB levensvatbaarheid, differentiatie, en mineralisatie en OC levensvatbaarheid en differentiatie in de context van β-tricalciumfosfaat fosfaat (β-TCP) schijven. We zijn ook getest met een β-TCP/collageen (β-TCP/C) schuim die een commercieel beschikbare materiaal gebruikte klinisch voor bot reparatie in een kritische en middelgrote calvarial bot defect muismodel om te bepalen van de effecten op de vroege fase van het bot genezing. We geëvalueerd in parallelle experimenten, immuun en allergische reacties in muizen. Onze aanpak genereert een profiel van de biologische verenigbaarheid van een bot-biomaterial met een aantal parameters nodig voor het voorspellen van de biocompatibiliteit van biomaterialen gebruikt voor bot genezing en het herstel bij patiënten.

Inleiding

Bot reparatie is een complex proces dat met de vorming van het hematoom, ontsteking begint, callus vorming en vervolgens het remodelleren van1,2. Bot regeneratie potentiële is echter beperkt tot de omvang van de bot fractuur1,3. Bijvoorbeeld grote botbreuken, veroorzaakt door trauma, kanker of osteoporose kunnen niet genezen en non-adhesie botbreuken worden genoemd. Deze letsels bot vereisen vaak behandeling ter bevordering van gezonde fysiologische bot reparatie en regeneratie. Momenteel, autograft en allograft bot transplantatie is de aanpak van keuze4 met 2,2 miljoen bot vervanging procedures jaarlijks5. Hoewel deze procedures een hoog slagingspercentage hebben, kunnen er complicaties, bijvoorbeeld, beperkte beschikbaarheid van bot, infectie, donor site morbiditeit en afwijzing4. Nieuwe alternatieven voor weefselengineering bot worden gezocht om deze uitdagingen.

Het ontwerp van biomaterialen op basis van natuurlijke of synthetische polymeren, Biokeramiek of metalen in combinatie met cellen en bioactieve moleculen is op de stijging-6. Ons huidige begrip van fysiologische bot genezing en genezing in de context van biomaterialen is afhankelijk van meerdere factoren zoals de mechanische eigenschappen en meerdere lokale en systemische factoren, met inbegrip van cellen uit de omloop en de breuk site7 ,8,9. Biomaterialen voor bot regeneratie gericht op de bevordering van osteogenicity en Osseointegratie10 en zijn een ideale biocompatibel, biologisch afbreekbaar en poreuze (bevordering van cel migratie, zuurstof en voedingsstoffen). Ze moeten ook sterk genoeg ter ondersteuning van de site van de fractuur ter verlichting van de pijn. Daarnaast zijn inflammatoire factoren vereist het helende proces in te leiden. Echter als de biomaterial buitensporige ontstekingen en allergische reacties induceert, kan dit beperken of hinderen van bot genezing11,12. Een interdisciplinaire benadering is dus nodig om te evalueren van biomaterialen ontwikkeld voor bot reparatie.

In deze studie presenteren wij een preklinische evaluatie van representatieve materialen, 1) Orthovita Vitoss schuim die een commercieel beschikbare poreus Bottransplantatievervanging bestaande uit tricalciumfosfaat is samengesteld uit nanometer middelgrote pure β-tricalciumfosfaat fosfaat (β-TCP) deeltjes en boviene collageen Type 1 (C) (β-TCP/C schuim) en 2) β-TCP schijven. Hier, we illustreren biocompatibiliteit testen van deze primaire osteoblast (OB) met biomaterialen en osteoclast (OC) testen, een in vivo model van bot reparatie, immunologische eenbeoordeling bestaande uit in vitro T lymfocyten proliferatie en cytokine productie, en in vivo immunogeniciteit en allergeniteit, als eerder gemeld13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De procedures werden gedaan met BALB/c muizen na alle richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het Oostenrijkse Ministerie van onderwijs, wetenschap en onderzoek en zijn goedgekeurd door de Commissie over de ethiek van het Oostenrijkse Ministerie van onderwijs, wetenschap en onderzoek.

1. primaire muisknop OB cultuur

  1. OB isolatie van neonatale muis snuituil met behulp van enzymatische spijsvertering
    1. 1 – 2 daagse oude neonatale pups (60 in totaal) euthanaseren door onthoofding en plaats de hoofden in een petrischaal met steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Houd het hoofd door de achterkant van de nek, en snijd de huid weg met behulp van steriele schaar. Incise de calvarium door het piercing (ongeveer 0,1-0,3 mm) met een schaar, die vervolgens worden ingevoegd onder de calvarium aan de achterkant van het hoofd aan de basis van de schedel en snijd langs de calvarial rand lateraal vanaf de achterkant naar voorkant boven de oren en dan abov e de neusrug (Figuur 1).
    3. Incubeer ontleed snuituil met 8 mL van een filter gesteriliseerde spijsvertering oplossing (300 eenheden/mL collagenase type IV en 2.14 eenheden/mL dispase II opgelost in α-minimum essentiële medium (α-MEM)) in een conische buis van 50 mL bij 37 ° C gedurende 10 minuten in een schudden incubator op 200 shakes /min.
    4. De eerste wordt weggeworpen en herhaal de procedure spijsvertering driemaal met 8 mL van de oplossing van de spijsvertering. Verzamelen van de bovendrijvende substantie met de cellen die na elke stap van de spijsvertering en toevoegen aan een conische tube van 50 mL. Bewaar de conische tube van 50 mL met de cellen in een bad met ijs water totdat het spijsvertering (ongeveer 40 min) is voltooid.
    5. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant (met een pipet van Pasteur gekoppeld aan een vacuümpomp) en resuspendeer in 40 mL bot groeimedium (BGM) met α-MEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), en 1% penicilline-streptomycine oplossing. Voeg vervolgens 10 mL van de celsuspensie aan 4 weefselkweek platen (10 cm).
    6. Cultuur de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot samenvloeiing (2-3 dagen).
    7. Bij samenvloeiing, gecombineerd het oude medium en de weefselkweek platen een keer met 1 x PBS (37 ° C) wassen. Dan de PBS gecombineerd en voeg 2 mL 1 x trypsine oplossing met 0,5% ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) om elke 10 cm weefselkweek plaat.
    8. Incubeer de platen 4 cultuur bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 min en controleer vervolgens de platen met een omgekeerde lichte Microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen worden losgekoppeld van de plastic. Breng alle cel schorsingen (totaal 8 mL) aan een conische tube van 50 mL, met 10 mL verse BGM. Wassen elke plaat met 5 mL verse BGM en overdracht aan de dezelfde conische tube van 50 mL.
    9. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 16 mL verse BGM. 16 nieuwe 10 cm weefselkweek platen (verdelende 1:4) met 9 mL BGM voor te bereiden. 1 mL van de celsuspensie toevoegen aan elke plaat.
    10. Herhaal stap 1.1.6. naar 1.1.8.
    11. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 10 mL verse BGM. Cellen tellen en bereken de concentratie van de cel.
      Opmerking: Deze procedure genereert ongeveer 7,5 – 8.3 x 105 cellen/pup.
    12. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer bevriezen gemiddeld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO), α-MEM 40% en 50% FBS. Breng 2 mL cryovials voor een totaal van 2 x 106 cellen per flacon 1,5 mL van de celsuspensie.
    13. Flash bevriezen de flesjes in vloeibare stikstof voor langdurige opslag in een tank met vloeibare stikstof. Gebruik de cellen binnen een jaar om de volledige functionaliteit. Deze primaire OBs gebruiken voor de evaluatie van de proliferatie (stap 1.2), differentiatie (ALP testen: stap 1.4., 1.5.) en mineralisatie (stap 1.6.) in aanwezigheid van de biomaterialen. Deze cellen gebruiken voor de rijping van bot-merg-afgeleide OC precursoren in co-cultuur (stap 2.3).
  2. OB proliferatie assay
    1. Vooraf Incubeer 14 mm diameter β-TCP schijven in 1 mL van BGM in een 24-well schorsing cultuur plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u primaire OBs. gebruik standaard weefselkweek platen voor besturingselementen toevoegt en schorsing cultuur platen de biomaterial monsters Vermijd cel gehechtheid aan de plastic.
    2. Het medium van de pre-incubatie gecombineerd en vervolgens resuspendeer primaire muisknop OBs in BGM. In een 24-well schorsing cultuur bord en voor de controlegroep, 4.4 x 104 OBs/cm2 naar de vooraf bebroede β-TCP schijven toevoegen in een 24-well weefselkweek plaat (1 mL/putje). OBs zal hechten aan de weefselkweek plaat of de biomaterial.
    3. Incubeer gedurende 14 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. Tijdens de incubatietijd, wijzig het medium elke 2-3 dagen en voeg 1 mL verse BGM aan elk putje.
    4. Om te beoordelen OB proliferatie, overbrengen in de β-TCP-schijven op dag 7 en 14 nieuwe putten uit te sluiten van de signalen van de cellen die zijn geteeld op de schorsing cultuur plaat.
    5. Het oude medium gecombineerd, Voeg 0,5 mL van BGM (37 ° C) en Incubeer de platen van de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Voeg vervolgens 55 µL van 10 x cel proliferatie reagens (1:10 verdunning) rechtstreeks in de cultuur goed. Lege cellen, drie putten met 0,5 mL van BGM en 55 µL van het 10 x cel proliferatie reagens te bereiden. Incubeer alle platen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
    6. Trekken en 150 µL van het supernatans van elk putje overboeken naar een 96-Wells zwarte plaat en lezen van fluorescentie met excitatie bij 560 nm en emissie bij 590 nm. Aftrekken van de lege lezingen uit de lezingen van de steekproef.
  3. OB differentiatie en mineralisatie testen
    1. Vooraf Incubeer 14 mm diameter β-TCP schijven in 1 mL van BGM in een 24-well schorsing cultuur plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u de OBs. gebruik standaard weefselkweek platen voor besturingselementen toevoegt en schorsing cultuur platen voor de biomaterial monsters te vermijden cel gehechtheid aan de plastic.
    2. Het medium van de pre-incubatie gecombineerd en vervolgens resuspendeer primaire muisknop OBs in BGM. In een 24-well schorsing cultuur plaat en voor de controlegroep, 8,8 x 104 OBs/cm2 naar de vooraf bebroede β-TCP schijven toevoegen in een 24-well weefselkweek plaat (1 mL/putje). OBs zal hechten aan de weefselkweek plaat of het biomaterial monster.
    3. Vervang de BGM met 1 mL van osteogenic mineralisatie medium (MM) met van BGM, 50 µg Mo/mL ascorbinezuur en 5 mM β-glycerophosphate 24 h na toevoeging van de OBs en incubeer gedurende 14 dagen bij 37 ° C en 5% CO2. Het medium elke 2-3 dagen met 1 mL vers bereide MM aan elk putje wijzigen.
  4. OB differentiatie beoordeeld door alkalische fosfatase (ALP) activiteit van cel lysates
    1. Voor het meten van ALP activiteit op dag 7 na toevoeging van MM, gecombineerd het kweekmedium uit de putten en daarna wassen met 1 mL steriele 1 x PBS (37 ° C). Zorgvuldig gecombineerd de PBS zodat de gekoppelde cellen blijven op de weefselkweek plastic of biomaterial en het bevriezen van de platen bij-80 ° C.
    2. Na 24u (of maximaal 2 weken), ontdooien het besturingselement weefselkweek plaat en de biomaterial vering cultuur plaat bij kamertemperatuur (RT) voor te bereiden voor lysis van de OB. Breng de β-TCP-schijven in een nieuwe schorsing cultuur plaat uit te sluiten van de cellen die zijn gekoppeld aan de plaat voor de biomaterial monsters. Voeg 75 µL per putje van de 1 x lysis van de cel buffer aan beide platen. Schud de platen gedurende 5 minuten op een shaker op 400 shakes/min.
    3. Breng de cel lysate in een tube van 0,5 mL microcentrifuge en centrifuge op 300 x g voor 6 min op RT verwijderen van puin. 50 µL van het monster cel lysate supernatans toevoegen aan een 96-Wells zwarte plaat en voeg vervolgens 50 µL van een oplossing, bestaande uit 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfaat (DiFMUP) fluorogenic substraat opgelost in 2 x ALP buffer (pH 10) per putje. Twee lege putten met 100 µL van een oplossing van 1:1 met 1 x cellysis-buffermengsel en 2 x ALP buffer ingesteld.
    4. 8 referentiemonsters met 100 μl per putje met de 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) variërend van 0,5 tot 200 μM, opgelost in 1:1 met 1 x cellysis-buffermengsel en 2 x ALP buffer voor het genereren van een standaard referentie-curve voor te bereiden.
    5. Incubeer de zwarte plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten en lees vervolgens de fluorescentie met de excitatie op 358 nm en emissie bij 455 nm. De lege lezingen van de referentiemonsters of monster lezingen van elkaar aftrekt.
    6. Normaliseren van de ALP enzymactiviteit van de cel lysates met de totale hoeveelheid eiwit met behulp van een colorimetrische bepaling voor eiwitconcentratie. Bereiden bovien serumalbumine (BSA) eiwit referentie standaarden op een bereik van 0,05 tot 2,5 µg/µL opgelost in 1 x lysis van de cel buffer voor het genereren van een standaard curve.
    7. Het monster cel lysates en BSA eiwit normen in duplicaten voorbereiden. Voeg 5 µL van het monster cel lysate of 5 µL van BSA eiwit standaard in een 96-wells-plaat en voeg vervolgens 25 µL van het reagens A' en 200 µL van het reagens B. Set van twee lege putten met 5 µL van 1 x lysis van de cel buffer. Incubeer de platen bij RT gedurende 15 minuten en vervolgens lees de absorptie bij 690 nm. De lege lezingen van de referentiemonsters of monster lezingen van elkaar aftrekt.
  5. OB differentiatie beoordeeld door kleuring van ALP in celkweek
    1. ALP in gekweekte OBs vlek op dag 7 na de toevoeging van MM op een besturingselement weefselkweek plaat en de biomaterial in een schorsing cultuur plaat.
    2. Gecombineerd het kweekmedium uit de putten en 0,5 mL 1 x PBS (37 ° C) te vervangen. De PBS gecombineerd en monteren van de cellen door broeden ze in 0,5 mL 10% gebufferd formaline op RT voor 1 min.
    3. De 10% gebufferd formaline met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd en Voeg 0,5 mL was buffer (0.05% Tween20 in 1 x PBS).
    4. Ontbinden van een 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat/nitro blauwe tetrazolium (BVIE/NBT) substraat tablet in 10 mL ultrazuiver water en vortex totdat volledig is opgelost. De oplossing moet worden beschermd tegen licht en gebruikt binnen 2 uur.
    5. Het was buffer gecombineerd en vervang met 0,5 mL BVIE/NBT substraat oplossing en Incubeer de plaat duikt met RT in het donker gedurende 10 minuten Aspirate de kleurstofoplossing en vervang met 0,5 mL was buffer.
    6. Breng de gekleurde β-TCP-schijven in een nieuwe put en scannen van de ALP-gekleurde platen met een conventionele flatbed-scanner naar record ALP kleuring.
  6. OB mineralisatie beoordeeld door kleuring met Alizarine rood S (ARS)
    1. Het kweekmedium de putjes met primaire OBs 14 dagen na de toevoeging van MM gecombineerd en spoel tweemaal met 0,5 mL 1 x PBS op RT. Aspirate de PBS en monteren van de cellen door toevoeging van 0,5 mL van de 10% gebufferd formaline-oplossing op RT gedurende 10 minuten.
    2. De 10% gebufferd formaline met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd en tweemaal met 0,5 mL ultrazuiver water wassen.
    3. Toevoegen aan de vaste OBs, 0,25 mL kleurstofoplossing 40 mM ARS (pH 4.2) opgelost in ultrazuiver water en Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 10 minuten op een shaker op 100 shakes/min.
    4. De kleurstofoplossing met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd en spoel met 1 mL ultrazuiver water. Herhaal deze stap 5 – 10 keer verwijderen aspecifieke kleuring.
      Opmerking: De spoeldouche oplossing mag geen kleur.
    5. Gecombineerd het ultrazuiver water en voeg 1 mL koude PBS. Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 10 minuten op een shaker op 100 shakes/min.
    6. Gecombineerd de PBS, de gekleurde β-TCP schijven overbrengen in een nieuwe put en de platen te scannen met een flatbed-scanner naar record mineralisatie.
    7. Voeg 0,25 mL 10% cetylpyridinium chloride-oplossing en de plaat duikt met RT gedurende 15 minuten op een shaker op 100 shakes/min te uittreksel van de ARS kleurstof uit te broeden.
    8. Het supernatant overbrengen in een tube 1,5 mL en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 5 min op RT.
    9. 10% cetylpyridinium chloride oplossing aan de extracten met een verdunningsverhouding van 1:10-1:20 toevoegt en de monsters (300 µL) in een 96-wells-plaat met inbegrip van twee lege putten met slechts 10% cetylpyridinium chloride.
    10. 7 ARS referentie standaarden variërend van 4 tot 400 µM door verdunning van de 40 mM ARS kleurstofoplossing (pH 4.2) met 10% cetylpyridinium chloride-oplossing voor het genereren van een standaard curve voor te bereiden.
    11. Voeg 300 µL van de norm in duplicaten naar de 96-wells-plaat.
    12. Lees de extinctie van de monsters, lege cellen, en verwijst naar de normen op 520 nm.
    13. De lege lezingen van de referentiemonsters of monster lezingen van elkaar aftrekt.

2. muis OB-OC co cultuur voor het afleiden van volwassen OCs

  1. Voorbereiding en sterilisatie van boviene corticaal bot segmenten
    1. Schoon segmenten van het bot van het omliggende weefsel en verwijder de trabecular botten en beenmerg.
    2. Het bot bij 50 ° C gedurende 24 uur drogen.
    3. Snijd het bot in kleinere stukjes en snijd het in reepjes (ongeveer 300-350 µm dik) met behulp van een low-speed zag met een mes van de diamant.
    4. Snijd de plakjes van 300 – 350 µm in kwadratische schijven (1 cm2).
    5. Voor de reiniging van de bot schijven (1 cm2), plaatst u deze in een afsluitbare glazen ampul en vul met gedestilleerd water. Breng de gevulde glazen ampul in een ultrasoonbad en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
    6. Giet af het gedestilleerd water, voeg 70% ethanol en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min.
    7. Giet af de 70% ethanol en vervangen door 100% ethanol.
      Opmerking: Bewaar het been segmenten in 100% ethanol bij 4 ° C voor maximaal 4 weken.
    8. Het been segmenten met UV-licht gedurende 15 minuten aan elke kant onder steriele omstandigheden te bestralen. Bewaren de gesteriliseerde bot segmenten in een steriele cultuur plaat op RT tot verder gebruik.
  2. Isolatie van het beenmerg OC precursoren
    1. Euthanaseren naïef 8 – 12 week oud BALB/c muizen met behulp van een intraperitoneaal (i.p.) injectie van een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
    2. Isoleren van het beenmerg OC precursoren van muis dijbeen en tibiae.
    3. Verwijderen van de benen met een steriele schaar van het dichtstbijzijnde punt naar het lichaam in het heupgewricht, snij van de ledematen in de gewrichten van knie- en enkel en verwijder het zachte weefsel met een steriel scalpel en pincet. De epifyses afgesneden. Spoelen en het merg met 1mL BGM in een 6 cm steriel petrischaal met behulp van een naald van de 27G gekoppeld aan een 1mL spuit te verkrijgen van een celsuspensie op te schorten.
    4. De celsuspensie toevoegen aan een conische tube van 50 mL en was na de 6 cm petrischaal met 5 mL BGM en overdracht aan de dezelfde conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 350 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in OC differentiatie medium (DM) met BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamine D3 en 1 µM prostaglandine E2 (1 mL/putje).
      Opmerking: Één BALB/c muis voorziet in voldoende aantal OC precursoren één 24-well cultuur plaat.
  3. Voorbereiding van muis OB-OC co cultuur met biomaterial
    1. Incubeer vooraf 14 mm diameter β-TCP schijven of runderen bot segmenten (1 cm2) in 1 mL van BGM in een 24-well schorsing cultuur plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur voordat u de cellen toevoegt.
      Opmerking: Boviene bot segmenten zijn een controlegroep fysiologische substraat voor het bestuderen van OC differentiatie in het bijzijn van biomaterialen.
    2. Toevoegen van 8,8 x 104 cellen/cm2 van primaire OBs geschorst in BGM op de biomaterialen of het besturingselement bot in een 24-well schorsing cultuur bord of op een bord 24-well weefselkweek. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
      Opmerking: OBs koppelen aan de plastic of de biomaterial of runderen bot.
    3. Voeg vers geïsoleerd beenmerg OC voorlopers van de 24 h gekweekte primaire OBs en cultuur bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 dagen. Vervang het medium met vers bereide OC DM om de andere dag. Vervolgens vlek OCs voor tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) te evalueren OC differentiatie.
  4. OC differentiatie beoordeeld door val kleuring
    1. Karakteriseren van volwassen multinucleaire OCs, verkregen uit stap 2.3.3, gecombineerd het kweekmedium uit het besturingselement weefselkweek plaat en de biomaterial plaat voor de cultuur van de opschorting en voeg 1 mL 1 x PBS (37 ° C). De PBS gecombineerd en monteren van de cellen door ze aan het broeden in 1 mL 10% gebufferd formaline-oplossing bij RT gedurende 10 minuten.
    2. De 10% gebufferd formaline-oplossing met een eenmalig gebruik Pipetteer gecombineerd Voeg 1 mL 1 x PBS op RT. Repeat deze stap drie keer, gecombineerd de PBS, vervangen door 1 mL TRAP buffer (pH 5) en Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    3. De TRAP buffer gecombineerd en voeg 1 mL aceton en 100% ethanol van 1:1. Incubeer de plaat duikt met RT voor 30 s. snel aspirate de aceton-ethanol oplossing met een pipet voor eenmalig gebruik en volledig droog de platen op RT.
    4. Voor de val kleurstofoplossing, bereiden een 10 mg/mL stockoplossing van de naftol-AS-MX fosfaat in N, N-dimethylformamide, Los 0,6 mg/mL snel rode violet zout in TRAP buffer en 0,1 mL van de stockoplossing naftol-AS-MX fosfaat aan 10 mL snel rode violet zout toevoegen in de buffer van de TRAP.
    5. Voeg 1 mL kleurstofoplossing TRAP en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 10 min, dan de TRAP kleurstofoplossing gecombineerd en voeg 1 mL ultrazuiver water om te stoppen met de reactie.
    6. Overdracht van de β-TCP schijven en boviene bot segmenten na kleuring in een nieuwe goed, observeren rood gekleurd OCs met behulp van een lichte Microscoop (vergroting: 10 X) en TRAP + volwassen OCs met drie of meer kernen opsommen.

3. kritieke en middelgrote muis Calvarial Defect Model

  1. Subcutaan injecteren van 0,1 mg/kg buprenorfine (SC) in 8 - weken oude BALB/c muizen voor analgesie.
  2. Anesthetize van de muizen met een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine i.p., een gel of zalf toevoegen aan de ogen houd ze vochtig en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende de gehele procedure te voorkomen hypothermie. Beoordelen de verdoving diepte door teen en staart snuifje.
  3. Scheren van de vacht op de bovenkant van het hoofd tussen de oren en reinig het oppervlak met 7,5% Povidon jodium oplossing en 70% ethanol.
  4. Maak een incisie middellijn Sagittaal op de bovenkant van de schedel tussen de oren met een steriel scalpel bloot de calvarium en het bindweefsel van de pericranium boven het rechter pariëtale bot verwijderen door het schrapen met een scalpel.
  5. Een kritische en middelgrote defect in het rechter pariëtale bot met behulp van een steriele dentale trephine met een diameter van 4 mm (2000 rpm) onder constante irrigatie met normale zoutoplossing notch het rechter pariëtale bot te snijden door de ectocortex en enkele endocortex te maken.
  6. Gebruiken om te voorkomen dat schade aan de dura mater, een kleine periosteal lift te doorbreken van de resterende endocortex, zorgvuldig het calvarial bot verheffen verwijderen met pincet. Het daaruit voortvloeiende gebrek moet circulaire en ongeveer 3,5 mm diameter.
  7. Vul het calvarial defect met vooraf doorweekt (steriele 1 x PBS op RT) β-TCP/C schuim met pincet.
  8. Het juiste aantal leeftijd-matched, schijnvertoning negatieve controles met een lege defect voor te bereiden.
  9. Zetten, zodat de biomaterial op zijn plaats, 0,5 µL van weefsel lijm aan de rand van het gebrek op twee tegenovergestelde punten.
  10. Sluit de huid met een niet-absorbeerbare hechtdraad.
  11. Reinig alle chirurgische instrumenten met de koude sterilant voorwaarden te handhaven steriele alvorens de volgende chirurgie uit te voeren op een narcose muis.
  12. Voor post chirurgische behandeling, plaatst u de dieren op een droge en schone verwarmingsplaat bij 37 ° C op het gebied van chirurgie voor adequaat toezicht tijdens de herstelperiode. Volgen van de ademhaling, de lichaamstemperatuur en de kleur van de slijmvliezen en de ogen elke 10 minuten totdat ze wakker.
  13. Breng de bediende bewuste muizen in een kooi met voedsel en water gescheiden van de andere dieren tot volledig herstel. 0,1 mg/kg buprenorfine injecteren s.c. voor post chirurgische pijnstillende therapie tweemaal per dag gedurende 72 h. terugkeer volledig hersteld muizen naar hun kooien.
  14. Euthanaseren om te bepalen van de effectiviteit van de biomaterial, de muizen i.p. met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
  15. Decapitate in 8-12 weken na implantatie, de euthanized muis met een scherpe schaar.
  16. Moeilijke situatie het hoofd van de onthoofde muis in 30 mL 4,5% gebufferd formaline oplossing voor 1-2 weken te garanderen van volledige penetratie van de fixeerspray in het weefsel.
  17. Breng de hoofden in 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 ° C voor maximaal één jaar.
  18. Gebruik micro berekend tomografie (microCT) of gestandaardiseerde undecalcified histologische technieken te evalueren bot regeneratie. Het is mogelijk om te gebruiken microCT scannen op postmortem monsters op hoge resolutie (90 kV, 4 min) in 2D en 3D Sagittaal en frontale vliegtuigen.
  19. Voor undecalcified histologie, uitdrogen van de hoofden in oplopende rangen van ethanol en insluiten in glycol methylmethacrylaat.
  20. Knip glycol methylmethacrylaat-embedded blokken met een diamant zagen en slijpen van de secties met een dikte van ongeveer 80-100 µm.
  21. Evalueren Levai Laczko gekleurd been secties om nieuwe bot vorming14vast te stellen.

4. in Vitro immuunresponsen

  1. Euthanaseren naïef 8 - weken oude BALB/c muizen i.p. met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
  2. Plaats de muis op de rechterkant, scheren van de vacht aan de linkerzijde en reinigen van de huid over de linkerkant van de buik met 70% ethanol.
  3. Maak een 10 mm lang en een 1 mm diep ingesneden in de huid van de muis op de linkerzijde posteriorly na de ribben in de maag met behulp van steriele schaar.
  4. Open de huid en dan bloot het buikvlies. Maken van een 10 mm lang en minder dan 1 mm diep ingesneden in de buikvlies, met behulp van schaar onder steriele omstandigheden.
  5. Druk op de maag proximally bloot van de milt te maken.
  6. Houd de milt zachtjes met steriel pincet en verwijder deze door het snijden van het weefsel en de vaartuigen die hieronder het zijn toegevoegd.
  7. Plaats de intact milt in een tube van 50 mL met 10 mL koude 1 x steriel PBS.
  8. Maak een suspensie van eencellige door het hakken van de milt met 2 steriel pincet of de dia's 2 steriele glas.
  9. Verwijderen puin door het passeren van een steriele 40 µm cel zeef met koud 1 x PBS met behulp van de zuiger van een injectiespuit 1 mL.
  10. Centrifugeer de eencellige schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een conische tube van 50 mL, gecombineerd en verwijder het supernatant. Vervolgens resuspendeer de pellet cel in 5 mL lysis-buffermengsel van rode bloedcellen (RBC).
  11. Incubeer de celsuspensie voor 14 min op RT en stop de reactie door toevoeging van 45 mL medium Roswell Park Memorial Instituut (RPMI).
  12. Centrifugeer de cellen na de lysis van de cel bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en vervolgens Verwijder het supernatant.
  13. Resuspendeer splenocytes in RPMI medium met 10% warmte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline-streptomycine-oplossing, 0,1% gentamicine, ß-mercaptoethanol 0,2% en 1% niet-essentiële aminozuren.
  14. Vooraf Incubeer β-TCP/C schuim in een steriele 96-Wells cultuur plaat met RPMI medium gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 voordat cel zaaien.
  15. Splenocytes toevoegen op milliliters gestelde getallen, bijv., 1.25 x 105, 2.5 x 105 en 5 x 10,5berichten aan putjes in een weefselkweek 96-wells-plaat met RPMI medium en additieven, met of zonder het vooraf bebroede β-TCP/C-schuim.
  16. Toevoegen van 10 µg/mL concanavalin een (Con A) opgelost in medium voor een totaal van 100 µL per putje aan de juiste putjes en vervolgens Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 72 uur.
  17. Celproliferatie van de maatregel met een bromodeoxyuridine (BrdU) test. 10 µL per putje van BrdU labeling oplossing op 48u van celkweek toevoegen en vervolgens de plaat voor een aanvullende 24 h uit te broeden.
  18. Bij 72 h, het supernatant verzamelen en opslaan bij-20 ° C tot verder gebruik.
  19. Voeg 200 µL per putje van de fixatie oplossing aan elk putje en vervolgens Incubeer gedurende 30 min op RT. Aspirate de fixatie-oplossing. Voeg 100 µL per putje van de werkoplossing voor anti-BrdU antilichaam en incubeer gedurende 90 min.
  20. De antilichaam-oplossing gecombineerd, spoel de putjes drie keer met 200-300 µL per putje oplossing te wassen en verwijder de wassen-oplossing.
  21. Voeg 100 µL van substraat oplossing en incubeer gedurende 3 – 10 min op de RT, dan meet de extinctie bij 450 nm.
  22. Meten van interferon-γ (IFN-γ) in de verzamelde supernatant met behulp van een standaard ELISA, interleukine-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2) en Interleukine-4 (IL-4).

5. high Throughput intraperitoneaal Model

  1. Anesthetize van de vrouwelijke 6-8-weekse oude BALB/c muizen met een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine i.p. en een gel of zalf toevoegen aan de ogen houd ze vochtig en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende de gehele procedure te voorkomen hypothermie. Beoordelen de verdoving diepte door teen en staart snuifje.
  2. Scheren van de abdominale vacht en reinig met 7,5% Povidon jodium oplossing en 70% ethanol.
  3. Maken van een 8 mm lange middellijn incisie via de huid langs de linea alba. Maken een kleine snede in het buikvlies met behulp van een scalpel.
  4. Plaats steriele PBS β-TCP/C schuim transplantaties (2 x 2 x 2 mm3) gedrenkt in de peritoneale holte of zonder toegevoegd materialen voor de leeftijd-matched sham controle muizen.
  5. Suture van het buikvlies en huid met absorbeerbare en niet-absorbeerbare hechtdraad, respectievelijk.
  6. Reinig alle chirurgische instrumenten met de koude sterilant voorwaarden te handhaven steriele alvorens de volgende chirurgie uit te voeren op een narcose muis.
  7. Voor post chirurgische behandeling, plaatst u de dieren op een droge en schone verwarmingsplaat bij 37 ° C op het gebied van chirurgie voor adequaat toezicht tijdens de herstelperiode. Volgen van de ademhaling, de lichaamstemperatuur en de kleur van de slijmvliezen en de ogen elke 10 minuten totdat ze wakker.
  8. Breng de bediende bewuste muizen in een kooi met voedsel en water gescheiden van de andere dieren tot volledig herstel. Volledig herstelde muizen terug naar hun kooien.
    Opmerking: Deze procedure induceert minimale pijn. Post chirurgische pijnstillende therapie is meestal niet nodig. Als de bediende 0.1 mg/kg buprenorfine dieren vertonen tekenen van pijn, injecteren s.c. of een andere geschikte pijnstillende drug voor verlichting van pijn.
  9. De muizen 7 dagen na implantatie, met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine i.p. euthanaseren
  10. Bij 7 dagen na implantatie, lavage de peritoneale holte met behulp van een 1 mL syringe met een 25 G naald voor een totaal van 3 mL koude PBS door het hoofd van de muis ingedrukt en invoegen van de naald in het linker onderste buik Kwadrant en gericht proximally.
    Opmerking: De peritoneale vloeistof vrij moet zijn van de RBC.
  11. Centrifugeer de peritoneale lavage vloeistof bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verzamelen de peritoneale vloeistof te bewaren bij-20 ° C voor ELISA metingen van IL-1β, IL-2, IL-4 en cytokinen.
  12. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS peritoneale cellen met behulp van trypan blauw op een hemocytometer tellen.
  13. Cytocentrifuge de celsuspensie op 5 x 105 cellen op glas dia's, zodat de dia's te droog en vlek voor een gedifferentieerde cel tellen.
  14. Met behulp van een lichte Microscoop, een minimum van 300 cellen in totaal tellen en macrofagen, eosinofielen en neutrofielen lymfocyten te onderscheiden.

6. subchronische subcutane Model

  1. Vrouwelijke 6 – 8 week oud BALB/c muizen met een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine i.p. anesthetize, gel of zalf toevoegen aan de ogen houd ze vochtig en plaatst u de muisaanwijzer op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende de gehele procedure te voorkomen hypothermie. Beoordelen de verdoving diepte door teen en staart snuifje.
  2. Plaatst u de muisaanwijzer op zijn rug, de buik vacht scheren en schoon het geschoren oppervlak met 7,5% Povidon jodium oplossing en 70% ethanol.
  3. Maken van een 8 mm lange middellijn incisie via de huid langs de linea alba van de buik met behulp van een scalpel en vervolgens implantaat PBS gedrenkt biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) onder de huid of geen materialen voor de leeftijd-matched sham controle muizen toe te voegen.
  4. Sutuur (geologie) de huid met een niet-absorbeerbare hechtdraad.
  5. Reinig alle chirurgische instrumenten met de koude sterilant voorwaarden te handhaven steriele alvorens de volgende chirurgie uit te voeren op een narcose muis.
  6. Voor post chirurgische behandeling, plaatst u de dieren op een droge en schone verwarmingsplaat bij 37 ° C op het gebied van chirurgie voor adequaat toezicht tijdens de herstelperiode. Volgen van de ademhaling, de lichaamstemperatuur en de kleur van de slijmvliezen en de ogen elke 10 minuten totdat ze wakker.
  7. Breng de bediende bewuste muizen in een kooi met voedsel en water gescheiden van de andere dieren tot volledig herstel. Volledig herstelde muizen terug naar hun kooien.
    Opmerking: Deze procedure induceert minimale pijn. Post chirurgische pijnstillende therapie is meestal niet nodig. Als de bediende 0.1 mg/kg buprenorfine dieren vertonen tekenen van pijn, injecteren s.c. of een andere passende pijnstiller.
  8. Als u klaar bent om de site van implantatie te onderzoeken, euthanaseren de muizen i.p. met een oplossing van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine.
  9. Acht weken na implantatie, accijnzen de implantatie-site met het omliggende weefsel (1 cm2).
  10. Het weefsel hersteld in 4,5% gebufferd formaline oplossing 's nachts inbedden in paraffine en snijd in 4 µm secties.
  11. Vlek 4 µm paraffine-ingebedde weefselsecties met haematoxyline en eosine (H & E) voor de ontsteking of Masson van trichrome voor collageen afzetting en fibrose.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te beoordelen van β-TCP voor de doeltreffendheid ervan als een biomaterial voor bot reparatie, we gebruikten in vitro en in vivo screeningmethoden. Ten eerste, we gemeten de OB-reacties op de schijven van de β-TCP vergeleken met basislijn middellange alleen besturingselementen. Figuur 2 toont de levensvatbaarheid van de OB naar aanleiding van β-TCP schijven op 7 en 14 dagen van cultuur. Levensvatbaarheid van de cellen gemeten vanaf metabo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier, laten we een multidisciplinaire aanpak voor de preklinische beoordeling van biocompatibiliteit voor representatieve biomaterialen ontwikkeld voor bot regeneratie en reparatie. We testten de reacties van OBs, OCs, en de helende reactie van in vivo in een kritische bot defect model in muizen, alsmede in vitro en in vivo immuunrespons. We gericht om aan te tonen hoe de testen werken en de gegevens en conclusies die zijn afgeleid van het onderzoek van de biomaterialen samen te vatten. We late...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoeksproject heeft financiering ontvangen van de Europese Unie zevende kaderprogramma (KP7/2007-2013) onder subsidie overeenkomst nr. 263363.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biomaterialen
β-tricalciumfosfaat schijven (β-TCP, 14 mm)Schijven werden gesinterd in een vuurvaste oven bij een temperatuur van 1150 °C. Een gedetailleerde beschrijving van de productie is te vinden in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples werden UV-belicht (15 min voor elke kant) voordat ze in celculturen werden gebruikt.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam)Orthovita2102-1405
Muis osteoblasten cultuur
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4Los 200 mM glycine, 2 mM magnesiumchloride, 2 mM zinkchloride op in ultrapuur water en pas aan tot pH 10.
Botengroeimedium (BGM)α-MEM + 10% hitte-geïnactiveerd FBS + 1% penicilline/streptomycine
Cellyse buffer: CyQuant cellyse buffer 20x concentraatThermo ScientificC7027Verdun de geconcentreerde cellyse buffer stock 20-voudig in ultrapuur water. 
Celviabiliteitsreagens: Presto Blue celviabiliteitsreagensInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Collageenase type IV uit clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
DC-eiwit assay kit IIBio Rad5000112DC-eiwit assay kit bevat reagens A, reagens B, reagens S en BSA voor de referentiestandaard. Voor reagens A', voeg 20 µL reagens S toe aan 1000 µL reagens A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Sterischeel DMSO voor gebruik. 
Dispase II (neutrale protease, graad II)Roche4942078001
EnzCheck Fosfatase Assay Kit voor alkalische fosfatase activiteit Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Fosfatase Assay Kit bevat 6,8-difluoro-4-methylumbelliferylfosfaat (DiFMUP), N,N-dimethylformamide en 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarine (DiFMU). 
Fetaal bovien serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formaline oplossing neutraal gebufferd 10%Sigma-AldrichHT501128
GlycineSigma-AldrichG8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridine) chloride monohydraatSigma-AldrichC9002
L-Ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnesiumzout hydraatSigma-AldrichA8960
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-AldrichM2670
MEM alpha medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Osteogene mineralisatie medium (MM)α-MEM + 10% hitte-geïnactiveerd FBS + 1% penicilline-streptomycine + 50 µg/mL ascorbinezuur + 5 mM β-glycerofosfaat
Penicilline-streptomycine  Sigma-AldrichP4333
Fosfaatgebufferde saline 1x (PBS) pH 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsine-EDTA (0,5%), geen fenolrode (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Verdun de geconcentreerde stockoplossing 10-voudig in 1x PBS. 
Tween20Sigma-AldrichP1379
Ultrapuur water: Cell cultuur water pyrogeenvrijVWRL0970-500
WasbufferVoeg 0,05% Tween20 toe aan 1x PBS.
ZinkchlorideSigma-Aldrich1.08816
β-Glycerofosfaat dinatriumzout hydraatSigma-AldrichG5422
24-well suspensie cultuur plaatGreiner bio-one662102
24-well weefsel cultuur plaatGreiner bio-one662160
50 mL conische buisGreiner bio-one227261
96-well zwarte plaatGreiner bio-one655076
96-well transparante plaatGreiner bio-one655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Incubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Eenmalig filterunit FP30/0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Voor steriele filtratie van enzymoplossing.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro microplaat lezerTecan
Microcentrifugebuis: Eppendorfbuis safe-lock 0,5 mLVWR20901-505
Microcentrifugebuis: Eppendorfbuis safe-lock 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbitaal en horizontaal) Edmund Buehler 
Schuddende incubator GFL3032GFL 3032
Eenmalige pijp: serumpijpGreiner bio-one612301
Steriele instrumenten (schaar, pincet, gebogen forceps)
Weefselcultuur plaat (10 cm)Greiner bio-one664960
Muis osteoblast-osteoclast co-cultuur
1α,25-Dihydroxyvitamin D3Sigma-Aldrich

Referenties

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BiomaterialenbotregeneratieosteoblastviabiliteitosteoclastdifferentiatieAlizarin Red S kleuringkritisch groot calvariadefectb ta tricalciumfosfaatin vitro assaysin vivo muismodellenimmunogeniciteitstestsallergeniciteitsevaluatie
Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.