Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Samenvatting

Studies in dynamische veranderingen in eiwit vertaling vereisen gespecialiseerde methoden. Hier onderzochten we veranderingen in nieuw-gesynthetiseerd eiwitten in reactie op de ischemie en reperfusie met behulp van het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis in combinatie met Polysoom profilering. Om verder te begrijpen de dynamische veranderingen in eiwit vertaling, wij gekenmerkt de mRNAs die werden geladen met cytosolische ribosomen (polyribosomes of polysomes) en ook teruggewonnen mitochondriale polysomes en vergeleken van mRNA en eiwit verdeling in de hoogrenderende breuken (vele ribosomen gekoppeld aan mRNA), laag-efficiëntie (minder ribosomen aangesloten) waaronder ook mitochondriaal polysomes, en de niet-vertalen van breuken. miRNAs kunt ook koppelen aan mRNAs die worden vertaald, waardoor de efficiëntie van de vertaling, onderzochten we de verdeling van de miRNAs over de fracties. De verdeling van mRNAs, miRNAs en eiwitten werd onder basale geperfundeerd voorwaarden, aan het einde van 30 min van globale neen-flow ischemie en na 30 min van reperfusie onderzocht. Hier presenteren we de gebruikte methoden voor het bereiken van deze analyse — met name de benadering van optimalisatie van eiwit extractie uit het verloop van de sucrose, als dit is niet beschreven voordat — en enkele representatieve resultaten opleveren.

Inleiding

Het hart komt tegemoet aan de schade van ischemie (I) en reperfusie (R) op een dynamische wijze. Er is echter weinig inzicht in acute wijzigingen in de eiwitsynthese tijdens de reactie. Om aan te pakken dit, wij profiteerde van de gevestigde methode van Polysoom¹ ter identificatie van wijzigingen in eiwit overvloed die overeenkomen met herverdeling van ribosomen en translationeel regelgevende factoren van cytosol te polysomes, profilering en de stijging van de nieuw samengestelde eiwitten (OvN's). In de omgeving van I / R, de toename van nieuwe eiwitsynthese plaatsvindt in een tijdsbestek dat strookt met de transcriptie van nieuwe mRNAs²; Bovendien is verschil tussen mRNA uitdrukking niveaus en eiwit overvloed gerapporteerde³geweest. Om deze redenen, die wij hebben gekozen voor het analyseren van de wijzigingen in de dynamische Proteoom, zoals blijkt uit eiwit vertaling. Om dit te doen, we mRNA te kwantificeren in de Polysoom breuken, en analyseren van de samenstelling van eiwit in de Polysoom breuken. Ten slotte, omdat microRNAs (miRs) beschikbaarheid van mRNAs vertaaldienst reguleren en met de efficiëntie van eiwit vertaling^{4,5 interfereren kan}, onderzochten we de verdeling van miRs in de Polysoom-fracties, zich te concentreren op de reactie op ik / R.

We kozen de geïsoleerde Langendorff perfusie muismodel en geoogste weefsel onder basale voorwaarden voor continue perfusie, na 30 min global neen-flow ischemie en na 30 min van ischemie gevolgd door 30 min van reperfusie te gebruiken. We solubilized het hartweefsel en gescheiden polysomes over een helling van sacharose, gevolgd door Proteoom analyse en selectieve opsporing van mRNAs en miRNAs door PCR en microarray, respectievelijk. Deze combinatie van methoden vertegenwoordigt een krachtige aanpak voor het begrip van de dynamische Proteoom, waardoor gelijktijdige opsporing van mRNA, miRNA, en OvN's, evenals de herverdeling van regelgevende eiwitten, miRNA en mRNA tussen de fracties van het nontranslating, lage-efficiëntie polysomes en hoog rendement polysomes (Zie Figuur 1). Inzicht in de dynamische regulering van dit proces zal worden uitgebreid door de verdere analyse van fosforylering van belangrijke regelgevende factoren zoals eIF2α of mTOR. Deze individuele stappen worden nu in detail beschreven.

Protocol

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Cedars-Sinai Medical Center.

1. Langendorff perfusie van het hart van de muis

1. Langendorff perfusie van muis hart met ischemie en reperfusie
   1. Beheren van intraperitoneaal pentobarbital natrium 70 mg/kg tot de volwassen muis (8-week-oud, man, C57BL6/j). Bevestig diepe verdoving door gebrek aan terugtrekking tot teen snuifje.
   2. Anticoagulate met intraperitoneaal heparine 500 U/kg.
   3. Open de borst via sternale insnijding. Open het middenrif en snijd langs de grens van de ribben aan de anterieure axillaire as. Vervolgens snijd de anterieure axillaire as tot de voorpoot om volledig open de thoracale kooi. Na, het visualiseren van het hart, de oplopende aorta klem met een tang en snel accijnzen het hart. De dood is te wijten aan exsanguination. Plaats van het hart in koude Krebs (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO₃ 2,1 g/L, KH₂PO₄ 0.16 g/L, MgSO₄ 0.141 g/L, glucose 2 g/L en CaCl₂ 0.373 g/L).
   4. De aorta cannulate met een bot-tip naald en perfuse het hart retrogradely met Krebs oplossing in constante druk modus.
   5. Na een periode van stabilisatie van 15 min, door het hart te onderwerpen aan een globale neen-flow ischemie gedurende 30 minuten gevolgd door reperfusie voor 30 min.
   6. Oogst harten na 15 min basislijn perfusie, na 30 min ischemie, of na 30 min reperfusie. Trim uit de atria en module-freeze het weefsel in vloeibare stikstof.
   7. Bewaren bij-80 ° C tot gebruik

2. de weefsels homogenisering, solubilisatie en Sucrose dichtheid kleurovergang sedimentatie

1. Kleurovergang voorbereiding
   1. Bereiden van 2 oplossingen (15% en 50%) van 100 mL sacharose, mengen van 4 mL NaCl, 2,5 M;
      0,8 mL MgCl₂ 1,25 M; 1 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 15 g of 50 g van sacharose (voor 15% en 50%, respectievelijk); ultrazuiver water tot 100 mL; en xyleen cyanol (0,02 mg/mL) kleur van de 15%-oplossingligttussen
   2. Filteren van elke oplossing (0,22 µm filters)
   3. De dag die het verloop gebruikt wordt, 40 mL van elk sacharoseoplossing bereiden en cycloheximide toevoegen aan elke oplossing te bereiken van de uiteindelijke concentratie van 100 µg/mL
      1. Een kleurovergang maker gebruiken om te bereiden een mix tussen de 15% en 50% sucrose-oplossingen
      2. Vul het linker compartiment met 5 mL van de 15% sacharose verloop
      3. Vul de juiste compartiment met het kleurverloop 50 gewichtspercenten sacharose
      4. De kraan open en zet de pomp aan het roer van de twee kleine compartimenten met magneetroerder
      5. Gebruik een buis verbonden met de tweede kraan toe de gemengde sacharoseoplossing te stromen in een ultra-centrifugeren buis met dunne wanden. Eindvolume zullen ongeveer 10 mL.
   4. Houden van de hellingen bij 4 ° C (overnachting, indien nodig, maar niet langer)
2. Homogenisering van hartweefsel
   1. Meng vers of bevroren hart met een polytron in gefilterde lysis-buffermengsel (gewijzigd voor sacharose kleurovergang fractionering) met 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 0,4% NP-40. Cycloheximide 100 µg/mL bewaken Polysoom structuur, 0.1 U RNase remmer en proteaseinhibitor cocktail (1 tablet voor 50 mL) bevatten.
   2. Incubeer de lysate op ijs 15 min.
   3. Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C tot onoplosbare materiaal verwijderen en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
   4. Reserveren 50 µL voor bepaling van de eiwitten, RNA isolatie en RNA integriteit analyse (Zie Figuur 2).
   5. Het supernatant (500-100 µL) van de laag op de top van de hellingen en de buizen met lysis-buffermengsel in evenwicht te brengen.
3. Sedimentatie en verzameling van breuken
   1. Ultracentrifugatie voor 120 min op 37.000 rpm bij 4 ° C in een swingende emmer rotor uitvoeren. Volgens de fabrikant, dit komt overeen met 228,000 x g op maximale straal.
   2. Verzamelen van elk verloop als 17 breuken (rond 600 µL elke fractie) in microcentrifuge buizen met continue monitoring van absorptie bij 254 nm (OD₂₅₄).
   3. Programma van de Fractie collector als volgt:
      1. Gooi de eerste 3 min van collectie (overeenkomend met de vloeistof opgenomen in de buizen voor de kleurovergang)
      2. Van 4 tot 19 min, verzamelen de breuken op de snelheid van 1 mL/min bij 17 breuken.
   4. Plaats de breuken op ijs zodra elk is verzameld. Bevriezen monsters bij-80 ° C, als ze niet onmiddellijk worden verwerkt. Een typische UV densitometric overtrek van het verloop is als het is verzameld afgebeeld in Figuur 1.

3. isolatie en analyse van mRNAs van Polysoom en Nontranslating breuken

1. Extractie van mRNA
   1. Ontdooi de breuken op ijs, alsof zij flash-bevroren na collectie
   2. Breng 200 µL van elke breuk aan een verse buis
      Opmerking: Bij deze stap twee of meer opeenvolgende breuken kunnen worden samengevoegd samen. Het moet zorgvuldig gebeuren na het analyseren van de OD₂₅₄ grafiek, zodat Polysoom en niet-Polysoom breuken niet krijgen gemengd.
   3. Voeg 10 ng van luciferase RNA als interne controle aan elk monster voor normalisatie doel.
      Opmerking: Luciferase inleidingen moeten worden gebruikt als een interne controle te normaliseren van de resultaten.
   4. Voeg 700 µL van RNA extractie reagens (monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat; Zie Tabel van materialen) aan elke buis. Meng goed en Incubeer de buizen voor 5 min op RT (kamertemperatuur).
   5. Toevoegen van 140 µL chloroform en vortex voor 15 s. Incubate voor 2-3 min op RT.
   6. Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten staan bij 12.000 x g bij 4 ° C.
   7. Zorgvuldig overbrengen in de bovenste waterfase een nieuwe buis.
   8. Aangezien de RNA-inhoud van de fracties niet hoog is, toevoegen aan elke buis 10 µg glycogeen als drager.
   9. 350 µL isopropanol toevoegen aan elke buis. Meng goed en Incubeer bij-20 ° C gedurende 1 uur te verhogen van het rendement.
   10. Centrifugeer gedurende 15 min bij 12.000 x g bij 4 ° C.
   11. Verwijder het supernatant en toevoegen van 700 µL ethanol 75% om te wassen van de RNA-pellet.
   12. Centrifugeer gedurende 5 min bij 7.500 x g bij 4 ° C.
   13. Verwijder van ethanol en laat de lucht van de pellet 10 – 15 minuten drogen.
       Opmerking: Overdreven drogen de RNA-pellet voorkomt u dat de volledige solubilisatie in water.
   14. Resuspendeer de pellet RNA in 50 μl van RNase-vrije ultrazuiver H₂O.
   15. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij 55 ° C.
   16. 2 μL van elk monster te gebruiken voor het meten van de kwaliteit en de kwantiteit van de uitgepakte RNA en slaan de rest bij-80 ° C.
2. Omgekeerde transcriptie en qPCR
   1. Gebruik 4 μL van omgekeerde transcriptie cDNA synthese kit (Zie Tabel of Materials) voor een 20 μL reactie. Bereiden de supermix volgens het aantal monsters. Overdracht van het vereiste volume aan elke buis en 5 μL van de input RNA aan elke buis toe te voegen. Dit volume kan worden gecorrigeerd om relevant zijn voor het bereik van de arbeidsvoorwaarden van Taq polymerase.
   2. Incubeer de buizen in een thermische cycler met het volgende programma dat door de fabrikant aanbevolen: 5 min bij 25 ° C, 20 min omgekeerde transcriptie gedurende 20 minuten bij 46 ° C, en reverse-transcriptase inactivatie voor 1 min bij 95 ° C.
   3. QPCR met de geoptimaliseerde programma voor elk paar inleidingen worden uitgevoerd.
      Opmerking: Voor het detecteren van de aanwezigheid van bepaalde mRNAs in breuken, gelijk volume van elke fractie (van de geïsoleerde RNA) moet worden gebruikt voor omgekeerde transcriptie.
3. Analyse van de resultaten
   1. De Ct-waarde van het betrokken gen en de luciferase gebruiken voor het berekenen van de delta Ct-waarden
   2. Elke fractie delta Ct waarde wordt uitgedrukt als het percentage van de totaalwaarde van mRNA opgenomen in alle breuken visualiseren van de verdeling van de mRNA in de verschillende fracties (tabel 1)

4. isolatie en analyse van miRNAs van Polysoom breuken en Nontranslating breuken

1. Winning van mRNA en miRNA
   Opmerking: Dit protocol volgt instructies van de fabrikant, met een paar veranderingen.
   1. Ontdooi de glycogeen en het besturingselement spike-in. Houd op ijs.
   2. 700 µL van miRNA extractie reagens aan 200 µL van gebundelde monster toevoegen.
   3. Voeg 1 µg/µL van glycogeen en meng het met behulp van de pipet. Incubeer het gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Voeg 3,5 µL van 1.6 x 10⁸ spike-controle en meng het.
   5. Voeg 200 µL van chloroform en vortex voor ten minste 15 sec.
   6. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
   8. Met behulp van een precisiepipet, overbrengen in het supernatant een nieuwe 1,5 mL-buis. Gooi de middenlaag en fasen.
   9. 1,5 x volume van 100% ethanol toevoegen aan het supernatant en meng het.
   10. Breng 700 µL van dit mengsel aan de miRNA extractie kolom samen en Centrifugeer het bij volledige snelheid voor 15 s bij RT en negeren de doorstroming; Herhaal deze stap met een resterende monster.
   11. 700 µL van de buffer 1 toevoegen aan de kolom samen en Centrifugeer het bij volledige snelheid voor 15 s bij RT; Gooi de doorstroming.
   12. Voeg toe 500 µL van buffer 2 aan de kolom samen en Centrifugeer het bij volledige snelheid voor 15 s bij RT; Gooi de doorstroming.
   13. Voeg 500 µL van 80% ethanol toe aan de kolom samen en Centrifugeer het op volle snelheid gedurende 2 minuten op RT; Gooi de doorstroming.
   14. Overdracht van de kolom een nieuwe 2 mL afgetopte buis, opent u het deksel en Centrifugeer het bij RT gedurende 5 min op volle snelheid; Gooi de doorstroming.
   15. Voeg 16 µL RNAse-gratis water toe aan de kolom en de centrifuge het op volle snelheid voor 1 min op RT. houden het eluaat op ijs of op te slaan bij-80 ° C voor toekomstige analyses.
       Opmerking: Twee microliters van elk monster kan worden gebruikt voor analyse van de OD.
2. Omgekeerde transcriptie
   1. Voorbereiden op het ijs. Voor elke 20 µL RT-PCR reactie, Voeg 4 µL van de miRNA RT buffer, 2 µL van nucleïnezuren, 9 µL van totale RNA, 2 µL van enzym en 3 µL RNAse-gratis water; Meng het en draai het naar beneden kort.
   2. De thermische Cycler als volgt instellen:
      37 ° C gedurende 60 minuten;
      95 ° C gedurende 5 minuten;
      4 ° C houdt.
   3. Verwijder de buizen uit de thermische cycler en voeg 200 µL RNAse-gratis water. Bewaren bij-20 ° C of doorgaan naar de PCR in real time.
3. PCR in real time
   Opmerking: Dit protocol volgt 96 goed plaat formaat. De mix van de reactie op ijs bereiden.
   1. Bereiden van PCR reactie mix en toevoegen van cDNA (vanaf miRNAs hierboven) volgens het bereik door het protocol aanvaard. Meerdere reacties kunnen worden opgesteld in de batch.
   2. Voeg een totaal van 25 µL van het PCR-mix + cDNA in elk putje.
   3. Het zegel van de plaat met behulp van een optische plaat zegel.
   4. Centrifugeer de plaat voor 1 min bij 1.000 x g bij kamertemperatuur.
   5. Programma de real-time cycler als volgt:
      Eerste activeringsstap bij 95 ° C gedurende 15 minuten;
      3-staps fietsen: denaturatie bij 94 ° C gedurende 15 s; gloeien bij 55 ° C gedurende 30 s; uitbreiding bij 70 ° C gedurende 30 s (uitvoeren verzamelen van de gegevens van de fluorescentie); Voeg toe 40 cycli;
      Smelten-curve volgens cycler standaard.
4. Vergelijkende analyse
   1. Voorbeeld van normalisatie (Zie tabel 2):
      1. Vindt u de minimale waarde van SCM.
      2. Normaliseren alle SCM waarden tot dit minimum.
      3. Deze waarde van de Ct-waarden voor miRNAs van belang (MOI) en referentie-gen (REF) aftrekken.
      4. Analyseren van gegevens met behulp van de formule 2^-ΔCt .

5. Proteoom-analyse

1. Winning van eiwitten uit Polysoom breuken
   1. Verzamelde sacharose breuken combineren tot drie definitieve breuken. Markeer de breuken als zware (hoog rendement polysomes in gepoolde fracties 4, 5, 6 en 7 met de hoogste concentratie van sacharose, onderkant van de kleurovergang buis), licht (lage efficiëntie polysomes in gepoolde fractie 8, 9, 10 en 11, midden van de kleurovergang buis) en niet-vertalen (gepoolde fracties 12, 13, 14 en 15 met de laagste concentratie van sacharose; boven aan de helling buis). Eiwit assay uitvoeren op gebundelde breuken.
   2. 100% aandelen van Trichloorazijnzuur (TCA) voor te bereiden en op te slaan bij 4 ° C in het donker. Meng 0,5 mL van het monster met 60 µL van 100% TCA en Incubeer bij-20 ° C's nachts in het donker.
      Opmerking: Gebruik 1,5 mL laag eiwitgehalte retentie buizen (Zie Tabel van materialen).
   3. Na een incubatieperiode van overnachting, ontdooien het monster op ijs en centrifuge 15.000 x g4 ° C gedurende 30 min. Discard supernatant.
      Opmerking: 100 µg totaal eiwit in monster geeft zichtbaar eiwit pellet aan de onderkant van de buis.
   4. Vooraf chill aceton in vriezer van-20 ° C. 0,5 mL koude aceton aan de eiwit pellet en centrifuge 15.000 x g4 ° C gedurende 15 min. Discard supernatant toevoegen. Herhaal deze stap tweemaal.
   5. Lucht drogen de pellet. Resuspendeer de pellet in 360 µL van 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8).
      Opmerking: Indien nodig, gebruik een puls ultrasoonapparaat om resuspendeer de pellet.
   6. Voeg 40 µL van 0,1 M dithiothreitol (eindconcentratie 10 mM) en Incubeer bij 55 ° C op shaker voor 45 min. toevoegen 50 µL van 0,15 M iodoacetamide (eindconcentratie 17 mM) en Incubeer bij kamertemperatuur op shaker gedurende 30 min. in het donker.
   7. Bereid trypsine oplossing: resuspendeer 20 µg trypsine in 100 µL van 50 mM Ammoniumbicarbonaat. Op 1:50 (w/w) overeenkomstige hoeveelheid trypsine oplossing toevoegen aan monster trypsine: eiwitverhouding, ervoor zorgen dat pH 8 en incubeer op shaker bij 37 ° C's nachts.
      Opmerking: Toevoegen 1 M Ammoniumbicarbonaat om pH te brengen tot en met 8.
   8. Na de spijsvertering van de trypsine, cool toevoegen het monster, centrifuge kort in de bench centrifuge, 10% mierenzuur aan pH 2-3 te doven de trypsine-activiteit, en ga verder met monster ontzouten.
      Opmerking: Voor het monster ontzouten µ-elutie plaat gebruiken.
   9. Het sorptiemiddel voorwaarde in de putten van 96 goed plaat met 200 µL van methanol met behulp van vacuüm driemaal gevolgd door conditionering van 200 µL van 0,1% mierenzuur driemaal. Laden van de steekproef en het uitvoeren van een monster wassen met 200 µL van 0,1% mierenzuur drie keer. Elueer de steekproef met 100 µL van 50% acetonitrile/0.1% mierenzuur tweemaal in laag eiwitgehalte retentie 0,5 mL buis.
      Opmerking: Het monster Elueer langzaam aanvankelijk met behulp van de zwaartekracht gevolgd door laag vacuüm op.
   10. Damp monster eluaat volledig in met behulp van de concentrator en hetzij rechtstreeks uitvoeren massaspectrometrie analyse of winkel bij-80 ° C tot gebruik.
2. Analyse van de Spectrometrie van de massa
   1. Elke pellet (bestaande uit de al peptiden) in 50-100 µL reconstrueren en 1 µL injecteren massaspectrometer.
      Opmerking: Optimaliseren reconstitutie en injectie volumes om te verkrijgen maximale intensiteit LC/MS/MS signaal. In ons geval, het maximale signaal (totale ion huidige; TIC) in het hart van de scan was binnen het bereik van 1E8 tot 2E9.
   2. Gebruik een val kolom C18 (300 µm i.d. x 5 mm, 5 µm, 100A) gevolgd door peptide scheiding met behulp van C18 kolom (75 µm i.d. x 250 mm, 2 µm, 100Å) met een stroom tarief instelling 300 nL/min. Set de nano-source capillaire temperatuur tot 275 ° C en de spanning van de spray 2 kV.
   3. Een lineaire verloop van 5-35% B voor 90 min, B van de 35 – 95% voor 3 min, houden op 95% B voor 7 min en evenwichtsinstelling op 5% B voor 25 min (A: 0,1% mierenzuur/water en B: 0,1% mierenzuur in acetonitril) toepassen. Verwerven MS2 spectra voor de 15 hoogste intensiteit ionen van elke MS1 scan met behulp van de CID-modus. Gebruik 3 massaspectrometrie replicatieonderzoeken voor elk monster geanalyseerd.
      Opmerking: Optimaliseren en de proefomstandigheden en parameters gebruiken die geschikt voor uw monsters op de bijzondere massaspectrometrie instrument zijn. De voorwaarden/parameters vermeld in sectie 5.2. werden gebruikt en geoptimaliseerd in ons laboratorium.
3. Eiwit identificatie/kwantificatie
   1. Na analyse van de Spectrometrie van de massa, door de ruwe spectra-bestanden te converteren naar compatibele mzXML bestanden met behulp van de MSConvert software (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
   2. Indienen van de geconverteerde bestanden in SEQUEST zoekmachine met de zoekcriteria opgeven, bijvoorbeeld UniProtKB/Swiss-Prot muis database (meest up-to-date canonieke herzien); semi-enzym verteren met behulp van trypsine (na KR /-); met maximaal 2 gemiste breuklijnen; voorloper massa bereik: 400 tot 4.500 amu; statische wijziging: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; Peptide massa tolerantie: 50 ppm; fragment van de massale type: exacte.
      Opmerking: Andere eiwit database Zoek motoren en gegevens pijpleidingen kunnen worden gebruikt. Als database gebruikt voor bijvoorbeeld rat, die minder volledig zijn dan databases voor muis en mens is, moet u wellicht te zoeken tegen de muis (of mens) databases te verhogen Proteoom dekking. In dit geval moet redundantie in de namen van het eiwit worden verwijderd.
   3. Een post search-analyses uit te voeren. Stel de filters voor het bekijken van de gegevens. Bijvoorbeeld, stel de waarschijnlijkheid van een minimale eiwit (eiwit drempel) als 95% of 99%, dat wil zeggen, alleen de eiwitten waarvoor een statistische analyse impliceert 95% of 99% kans dat aanwezig in het monster wordt getoond. Instellen van het filter voor peptide drempel (bijvoorbeeld 95%), dat wil zeggen, een minimale kans dat zal worden gebruikt bij het bepalen of een spectrum een peptide identificeert. Selecteer het minimumaantal peptiden die bepalen zullen of een eiwit aanwezig is (2 peptiden als een minimum voor eiwit identificatie wordt aanbevolen).
   4. Evalueren van geïdentificeerde eiwitten voor kwaliteit/kwantiteit. Zorg ervoor dat de proteotypic peptiden voor kwantificering worden gebruikt. Als isovorm wordt aangeduid ervoor zorgen bases op observatie van een al peptide bestaat uit een aminozuur volgorde die uniek zijn voor de specifieke isovorm. Een "vergelijkbaar" of hypothetische eiwitten moeten ondergaan vergelijking om te zien of de waargenomen peptiden correspondeert met een bekende eiwit.

Resultaten

mRNA analyse
mRNA resultaten kunnen worden uitgedrukt als een verdeling van een bepaalde mRNA in elke fractie (figuur 3A); voor kwantificering, polyribosomal vertalen breuken combineren en vergelijken met de niet-vertalen breuk (figuur 3B), presentatie van een verhouding van mRNA overvloed in vertalen naar nontranslating breuken. Aanvullende informatie is verkregen door behandeling van de hoog rendement Polysoom breuk...

Discussie

Polysoom profiel-analyse zorgt voor de studie van eiwit-vertaling door het analyseren van de translationeel status van een specifieke mRNA of de hele transcriptome^6,7. Het is ook van groot nut wanneer lokale vertaling moet worden bestudeerd zoals synaptosomes⁸. Deze methode houdt traditioneel, de scheiding van mono - en polyribosomes en de bijbehorende mRNAs op een verloop van sacharose die kan gepaard gaan met genomic of proteomic technie...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Pentobarbital	Vortech Phamaceuticals	9373	voor euthanasie
Heparine	Sagent	103424	gebruikt in Langendorff bereiding
tang	Fine Science Tools	91110-10	gebruikt om het hart op te hangen
Langendorff systeem	Radnoti + zelfgemaakt	n/a	Een 'vier hart' systeem bestaande uit op maat geblazen glas, buizen en waterbaden
NaCl	Sigma	S7653-5KG	Krebs buffer en Sucrose gradiënt
KCl	Sigma	P5405	Krebs buffer en Lysis buffer
KH2PO42	Sigma	P-5504	Krebs buffer
MgSO4	Sigma	M7774-500G	Krebs buffer
Glucose	Sigma	G5767	Krebs buffer
CaCl2	Sigma	C1016-500G	Krebs buffer
Sucrose poeder	Sigma	S0389-1KG	Sucrose gradiënt
MgCl2	Sigma	208337	Sucrose gradiënt en Lysis buffer
Tris-base	Sigma	T1503-1KG	Sucrose gradiënt en Lysis buffer
Xyleen Cyanole	Sigma	X-4126	Sucrose gradiënt
Cycloheximide	Sigma-aldrich	239763	Sucrose gradiënt en Lysis buffer
RNaseOUT	Life Technologies	C00019	RNAse remmer voor Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40)	Sigma	I3021	Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tabletten, EDTA vrij	Roche	5056489001
Buis, dunne wand, ultrahelder, 13,2 ml, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Ultracentrifuge	Beckman	LE-80K	Ultracentrifugatie van de gradiënten
Rotor	Beckman	SW41	Ultracentrifugatie van de gradiënten
Biologic LP (pomp)	Biorad	731-8300	Fractie van de gradiënten
BioFrac	Biorad	741-0002	Fractie van de gradiënten
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifugebuisjes, 2 ml buisje	Sigma	Z666513-100EA	Gradiënt fractie en RNA extractie
TRIzol Reagens	Life technologies	AM9738	RNA extractie
Luciferase Control RNA	Promega	L4561	RNA extractie
Chloroform	Fisher Scientific	C606-4	RNA extractie
Glycogen, RNA kwaliteit	Thermo Fisher Scientific	R0551	RNA extractie
Isopropanol	Sigma	I9516	RNA extractie
Ethanol	Sigma	E7023-1L	RNA extractie
iScript cDNA Synthese Kit	BioRad	170-8891	Omgekeerde transcriptie
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	175-5122	Kwantitatieve PCR
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	Kit voor totale RNA isolatie
miScript II RT Kit (50)	Qiagen	218161	Kit voor miRNA omgekeerde transcriptie
miScript Sybr Green PCR Kit (200)	Qiagen	218073	Kit voor real-time PCR expressieanalyse van miRNA's
Centrifuge 5424R	Eppendorf		Voor centrifugatie van 1,5 ml of 2,0 ml buisjes bij verschillende temperaturen. Max snelheid - 21130 x g
Centrifuge 5810R	Eppendorf		Voor real-time PCR plaat centrifugatie bij verschillende temperaturen. Max snelheid - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler	Bio-Rad		Voor omgekeerde transcriptie
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad		Voor real-time PCR analyse
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610	Voor kwaliteitscontrole van RNA isolatie
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, laag profiel, dunne wand, gerand, groen/helder	Bio-Rad	HSP9641	Voor real-time PCR analyse
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, kleefstof, optisch	Bio-Rad	MSB1001	Voor real-time PCR plaat verzegeld
Research plus Enkelkanaals Pipette, grijs; 0,5-10 µL	Eppendorf	UX-24505-02	Voor pipetteren
PIPETMAN Classic Pipetten, P20	Gilson	F123600G	Voor pipetteren
PIPETMAN Classic Pipetten, P200	Gilson	F144565	Voor pipetteren
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL	Gilson	17011782	Voor pipetteren
Glycogen, RNA kwaliteit	Thermo Fisher Scientific	R0551	Verbetert de efficiëntie van de totale RNA isolatie
Posi-Click 1,7 ml Buisjes, natuurlijke kleur	Denville	C2170	RNA isolatie en opslag; reagent mix
Thermal Cycling Buizen -0,2 ml Individuele Kappen, Standaard 0,2 ml buizen met optisch	Denville	C18098-4 (1000910)	Omgekeerde transcriptie reactie
Sharp 10 Precisie barrière tips	Denville	P1096-FR	Voor pipetteren
Sharp 20 Precisie barrière tips	Denville	P1121	Voor pipetteren
Sharp 200 Precisie barrière tips	Denville	P1122	Voor pipetteren
Tips LTS 1 ml Filter	Rainin	RT-L1000F	Voor pipetteren
miScript Primer Assay (200)	Qiagen	(verandert volgens de miRNA)	Voor real-time PCR analyse
Gradient Master ver 5.3 Model 108	BioComp Instruments		Voor