Hier presenteren we een protocol te differentiëren lymfkliertest granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T-helper (THGM) cellen van naïef CD4 + T-cellen, met inbegrip van isolatie van naïeve CD4 + T cellen, differentiatie van THGM, en analyse van gedifferentieerde THGM cellen. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de verordening en de functie van THGM cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vitro Differentiatie van muis granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende Factor (GM-CSF)-produceren van T-Helper (THGM) cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF)-produceren van T-helper (THGM)-cel is een nieuw geïdentificeerde T helper cel deelverzameling die overwegend scheidt van GM-CSF zonder het produceren van interferon (IFN) γ of Interleukine (IL)-17 en komt tot spelen een essentiële rol in de auto-immune neuroinflammation. Een methode van isolatie van naïeve CD4 + T cellen van een eencellige opschorting van splenocytes en THGM cel generatie uit naïef CD4 + T cellen zou een nuttige techniek in de studie van T-cel-gemedieerde immuniteit en auto-immune ziekten. Hier beschrijven we een methode die muis naïef CD4 + T cellen in THGM cellen bevorderd door IL-7 onderscheidt. Het resultaat van de differentiatie werd beoordeeld door de analyse van de cytokines expressie met behulp van verschillende technieken, met inbegrip van intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry, een kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (PCR), en Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Met behulp van de THGM differentiatie protocol zoals beschreven hier, ongeveer 55% van de cellen uitgedrukt GM-CSF met een minimale uiting van IFNα of IL-17. De overheersende uitdrukking van GM-CSF door THGM cellen werd verder bevestigd door de analyse van de uitdrukking van GM-CSF, IFNα en IL-17 op zowel eiwitten als mRNA niveaus. Dus, deze methode kan worden gebruikt om te onderscheiden van de naïeve CD4 + T cellen aan THGM cellen in vitro, die nuttig zal zijn in de studie van biologie van de cel van de THGM.
Inleiding
CD4 + T-helper (TH) cellen zijn essentiële onderdelen van het immune systeem, cruciale rol in de verdediging van de gastheer tegen microbiële ziekteverwekkers, in kanker toezicht, en autoimmuniteit1,2,3. Na activatie van T-cel receptor (TCR), naïef CD4 + T cellen kunnen worden onderscheiden in TH1, TH2, TH 17, of regelgevende T (Walter) cellen onder de invloed van verschillende cytokine milieus2,4, 5. onlangs een nieuwe subset van TH cellen, die overwegend GM-CSF produceert, werd geïdentificeerd en THGM6genoemd. De differentiatie van THGM cellen wordt gedreven door IL-7 door middel van de activering van een signaal transducer en een activator van transcriptie 5 (STAT5). Deze cellen een grote hoeveelheid GM-CSF express terwijl het hebben van een lage uitdrukking van andere TH-cell handtekening cytokines zoals IFNγ en IL-176. GM-CSF bleek te spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van CD4 + T cellen gemedieerde neuroinflammation7,8. In vergelijking met IFNγ - of IL-17-uiting van autoreactieve T cellen, cellen GM-CSF-uiting van T overgedragen naar wild-type (WT) muizen veroorzaakt een eerdere ziekte en de hogere ziekte-ernst. Daarnaast mislukte Csf2- / - T-cellen voor het opwekken van experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) na wordt adoptively doorgegeven aan ontvangers die WT, overwegende dat T-cellen ontbreekt IFNγ of IL-17A behouden de mogelijkheid om te bemiddelen EAE7. Bovendien, een blokkade van GM-CSF met behulp van neutraliserende antilichamen verbeterd EAE ziekte ernst8. Bovendien, een tekort aan STAT5 in T-cellen in muizen resulteerde in een verminderde THGM-generatie en, vandaar, een weerstand van de muizen EAE ontwikkeling6. Deze bevindingen onderstrepen het belang van GM-CSF-uiten TH cellen in auto-immune neuroinflammatoire ziekte. Dus, tot vaststelling van een methode om te differentiëren van GM-CSF-uiten TH cellen van naïeve CD4 + T cellen zou belangrijk in de studie van de pathogenese van auto-immune neuroinflammation en T cel-gemedieerde immuun reacties. Echter, een protocol dat efficiënt hervormt THGM cellen lymfkliertest naïef die CD4 + is niet vastgesteld.
Hier presenteren we een methode die lymfkliertest THGM cellen uit naïef CD4 + T cellen onderscheidt. Dit protocol beschrijft de hele procedure, met inbegrip van de winning van de milt van de muis, de voorbereiding van een eencellige schorsing, de CD4-positieve selectie, de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en de cel TH differentiatie en analyse. De gedifferentieerde T-helper cellen worden geanalyseerd door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry om te bepalen van de cytokine-expressie op het niveau van eencellige, door een kwantitatieve PCR in real time om te bepalen van de expressie van cytokine mRNA niveau, en door ELISA te beoordelen van de cytokine-expressie op het niveau van de eiwitten. Deze methode kan worden toegepast op de studies van de biologie van de cel van THGM onder verschillende omstandigheden, zoals EAE, waar GM-CSF een belangrijke rol in de pathogenese speelt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen gebruikt in dit protocol werden op de genetische achtergrond van C57BL/6 en gehuisvest onder specifieke pathogenen vrije voorwaarden aan de nationale universiteit van Singapore. Alle experimenten werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de nationale universiteit van Singapore.
1. reagens en materiële voorbereiding
- Het bereiden van 500 mL met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).
Opmerking: Houd de buffer op ijs gedurende de hele procedure voor optimale resultaten. - Bereiden van complete RPMI media RPMI 1640 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine met 50 mL. Gebruik volledige RPMI media met 50 µM β-mercaptoethanol voor de THGM celdifferentiatie. Voeg de β-mercaptoethanol in een zuurkast.
- 7,5 mL van een mengsel van anti-CD3e antistof bereid door verdunning van de anti-CD3e geconcentreerd voorraad tot 3 μg/mL in PBS. Jas van 48-Wells-platen door 150 μl van het mengsel van antilichaam toe te voegen aan elk putje en Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur, of bij 4 ° C's nachts.
- Een paar van schaar en pincet steriliseren en houd ze in 70% ethanol tussen dissecties.
2. voorbereiding van lymfkliertest Splenocytes
- Euthanaseren van de muis (van 6-8 weken oud) met behulp van een institutioneel goedgekeurde CO2 verstikking of cervicale dislocatie. Spray de muis met 70% ethanol en mounten op een polystyreen blok op zijn rug. De muis overbrengen in een biologische veiligheidskast om door te gaan met de volgende stappen.
- Houd de huid met behulp van een paar pincet en de huid onder de ribbenkast aan de linkerkant voor ongeveer 4 cm, met behulp van een paar van schaar te knippen. Open de peritoneale sac bloot van de milt te steriel pincet gebruiken om uit te pakken van de milt.
- Plaats een 70 μm cel zeef op een tube van 50 mL en nat het vooraf met 2 mL buffer. Plaats de milt op de zeef van de cel (2 – 3 milt voor één cel zeef) en maceraat ze met behulp van het einde van een zuiger van de spuit 5 mL.
- Spoel de zeef en meerdere malen met 1-2 mL van de isolatie van de cel buffer buis totdat alle cellen worden gespoeld in de buis. Negeren van de cel zeef en centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel met 5 mL koud (4 ° C) ammonium-chloride-kalium (ACK) lysing van buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM nb2EDTA; pH 7,2 – 7.4) en meng ze zachtjes voor 2 min. Voeg 10 mL van de volledige RPMI media te neutraliseren de ACK buffer en onmiddellijk Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant na het centrifugeren.
3. isolatie van CD4 + T cellen met behulp van magnetische CD4 Microbeads en een cel scheiding kolom
- Resuspendeer de pellet cel in 5 mL van de isolatie van de cel buffer. Het filteren van de celsuspensie met behulp van een pre scheiding filter (30 μm) in een nieuwe 15mL-buis te verwijderen elke puin.
- Neem 10 μL van de celsuspensie en maak van een 10 x verdunning door toevoeging van 90 μL van de buffer. Neem 10 μL van de verdunde celsuspensie en meng dit met 10 μL van trypan blauw voor het tellen van de cel. De cellen in een hemocytometer om te bepalen van het rendement van levensvatbare cellen te tellen.
- Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
- Resuspendeer de cellen in 90 μL van buffer per 107 cellen. 10 μL van magnetische CD4 microbeads per 107 cellen toevoegen. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Voor optimale resultaten, meng de celsuspensie zachtjes om de 5 min tijdens de incubatie.
- Terwijl de cellen aan het broeden zijn, plaatst u de kolom van een scheiding op de magnetische stand. Vooraf nat de kolom met 2 mL buffer.
- Aan het eind van de incubatie cel/kraal, wassen van de cellen met 5 mL buffer en centrifugeer ze bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 1 mL buffer, het monster te laden in de kolom van de cel scheiding en laten doorstromen. Gebruik een centrifugebuis van 15 mL voor het verzamelen van de Fractie van de CD4-cel. Voeg 1 mL buffer te wassen het reservoir voordat het droog is. Herhaal de stap wassen 2 x.
- Verwijder de cel scheiding kolom uit de magnetische standaard en plaats deze op een nieuwe 15 mL centrifugebuis. Voeg 2 mL isolatie van de cel buffer naar de cel scheiding kolom en de zuiger stevig te dwingen de cellen uit de kolom van toepassing.
- Centrifugeer de breuk bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot het verkrijgen van CD4 +-cellen. Verwijder het supernatant.
4. zuivering van de naïeve CD4 + T cellen (CD4+CD25-CD44loCD62LHallo) door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en THGM differentiatie
- Resuspendeer de pellet verkregen CD4 + cel in 500 µL van buffer. Meng de cellen met een mengsel van de TL-geconjugeerde antilichamen met CD4-PerCp (2,8 µg/mL), CD44-APC (2,4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), en CD62L-FITC (10 µg/mL) (tabel 1). Incubeer de cellen op het ijs gedurende 20 tot 30 minuten, terwijl het hen te beschermen tegen licht.
Opmerking: De concentratie van de antistoffen waren eerder geoptimaliseerd in het lab. Het aantal antilichamen vermeld is voor cellen van 1-2 muizen. - Na de incubatie, de cellen met 5 mL buffer wassen en centrifugeren van de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL van buffer. De cellen weer met behulp van een nylon gaas filteren.
- De celsuspensie overbrengen in een FACS buis voor het sorteren van de cel. De collectie FACS buizen met 500 µL van buffer precoat.
- Verkrijgen van een CD4+CD25-CD44loCD62LHallo bevolking (van naïeve CD4+ T cellen) door FACS sorteren. Gate op CD4+CD25- eerste en selecteer vervolgens CD44loCD62LHallo cellen uit deze populatie.
- Verzamelen van de naïeve CD4+ T cel breuken tot een nieuwe 15 mL centrifugebuis. Centrifugeer de cellen bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.
- Resuspendeer de naïeve CD4 + T-cellen bij een concentratie van 106 cellen/mL in volledige RPMI media met 50 µM β-mercaptoethanol.
- Gecombineerd de antilichamen van de anti-CD3e voor precoating in de 48-well-plaat gebruikt. Zaad 0,25 miljoen (250 µL) cellen in elk putje met IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 µg/mL) en anti-IFNγ (10 µg/mL) (tabel 1).
Opmerking: De concentraties van cytokine en antistoffen waren eerder geoptimaliseerd in het laboratorium voor een THGM celdifferentiatie. - Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2 voor 3 dagen. Wijzig het medium niet tijdens de incubatie.
5. analyse van de muis THGM cellen gegenereerd In Vitro
- Met behulp van een Microscoop, Controleer de celdifferentiatie 3 d na de differentiatie. Oogsten van de cellen samen en centrifugeer ze bij 350 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Wassen van de cellen 2 x met volledige RPMI media.
Opmerking: Gedifferentieerde cellen zijn groter in omvang dan de naïeve CD4 + T cellen. - Resuspendeer de cellen in 1 mL van volledige RPMI media. Neem 10 μL van celsuspensie en het goed mengen met 10 μL van trypan blauw aan het bepalen van het aantal cellen met een hemocytometer. Gedifferentieerde cellen verdelen in drie drankjes voor een restimulation en analyse.
Nota: De intracellulaire cytokine kleuring en ELISA vitrotests vereisen ≥0.5 miljoen cellen en qPCR analyse vereist ≥ 1 miljoen cellen. -
Opleving voor de intracellulaire cytokine kleuring, de cellen met de phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) (100 ng/mL) en ionomycin (1 μg/mL) in aanwezigheid van een eiwit vervoer inhibitor (1 µL/mL) voor 4 – 6 h.
- Oogsten van de cellen en vlekken hen met anti-CD4 antilichaam (PerCP-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning; of FITC-geconjugeerd, 0,5 mg/mL, 1:100 verdunning) voor 30 min.
- Het herstellen van de cellen met de 200 μL van fixatie buffer voor 20 – 60 min. Na de fixatie, het wassen van de cellen 2 x met 1 mL permeabilization buffer.
- Uitvoeren van intracellulaire kleuring met antilichamen tegen GM-CSF (PE-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning), IL-17A (FITC-geconjugeerd, 0,5 mg/mL, 1:100 verdunning; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning), IL-4 (APC-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning) en IFNγ (APC-geconjugeerde, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, 1:100 verdunning) gedurende 30 min. in het donker.
- Voor een analyse van de qPCR van de cytokine genexpressie door gedifferentieerde cellen, activeert u de cellen met plaat-gebonden anti-CD3e (3 μg/mL) (precoating de plaat zoals beschreven in stap 1.3). Oogst de cellen isoleren totaal RNA, cDNA voorbereiden op de qPCR van een fenol RNA extractie reagens met 3 uur na de stimulatie. De primers en programma gebruikt voor de qPCR staan in de tabellen 2 en 3, respectievelijk.
- Opleving voor de analyse van de cytokine eiwit secretie door gedifferentieerde cellen, cellen met plaat-gebonden anti-CD3e (3 μg/mL) gedurende 24 uur (precoating van de plaat zoals beschreven in stap 1.3). Oogst de celcultuur supernatant voor IL-17 en GM-CSF ELISA om te bepalen hun concentraties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Naïeve CD4 + T cellen geïsoleerd uit twee 8-week-oude mannelijke C57BL/6 muizen werden verdeeld in drie gedeelten. Een deel van de cellen werd onderscheid gemaakt tussen THGM cellen volgens het protocol beschreven. Een ander gedeelte werd gekweekt onder de voorwaarde van een THGM in aanwezigheid van anti-IL-4 antilichaam (10 µg/mL) als u wilt testen van de invloed van een blokkade van de IL-4 bij de differentiatie van THGM. Het laatste gedeelte werd gekwee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschreven hier een protocol van een in vitro THGM differentiatie van muis naïef CD4 +-cellen, gevolgd door een analyse van de gedifferentieerde cellen voor het valideren van de methode. Opmerking, kan zowel de milt en de lymfeklieren worden aangewend voor naïef CD4 + T cel zuivering en THGM differentiatie. De cytokine-expressie bepaald door intracellulaire cytokine kleuring gecombineerd met stroom cytometry bleek dat ongeveer 55% van de cellen werden aangezet tot GM-CSF-uiting van celle...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de nationale universiteit gezondheid systeem van Singapore (T1-2014 okt-12 en T1-2015 Sep-10).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Verdund tot 1x PBS in steriele water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10x ACK buffer | Biolegend | 420301 | verdund in steriele water |
| Cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
Referenties
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
