Methodenartikel

Karakterisatie van MLKL-gemedieerde plasmamembraan Rupture in Necroptosis

DOI:

10.3791/58088

⸱

7 augustus 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren methoden voor karakterisering van MLKL-gemedieerde plasmamembraan breuk in necroptosis met inbegrip van conventionele en confocal microscopie van live-cel imaging, scanning elektronen microscopie, en NMR gebaseerde lipide bindend.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptosis is een geprogrammeerde cel dood traject geactiveerd door activering van receptor interactie proteïne kinase 3 (RIPK3), die kinaseenzym en activeert de gemengde afkomst kinase-achtige domein pseudokinase, MLKL, scheuren of permeabilize van het plasma-membraan . Necroptosis is een inflammatoire traject gekoppeld aan meerdere aandoeningen waaronder autoimmuniteit, infectieziekten en cardiovasculaire ziekten, beroerte, neurodegeneratie en kanker. Hier beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van MLKL als de beul van plasmamembraan breuk in necroptosis. Wij visualiseren van het proces van necroptosis in cellen met behulp van live-cel beeldbewerking met fluorescentie van conventionele en confocal microscopie en in vaste cellen met behulp van elektronenmicroscopie, die samen de herverdeling van de MLKL van het cytosol aan het plasma geopenbaard membraan voor inductie van grote gaten in het plasma-membraan. We presenteren in vitro nucleaire magnetische resonantie (NMR) analyse met behulp van lipiden te identificeren van vermeende modulatoren van MLKL-gemedieerde necroptosis. Op basis van deze methode, wij kwantitatieve lipide-bindende voorkeuren en fosfatidyl-inositol fosfaten (pitten) aangewezen als kritische bindmiddelen van MLKL die nodig voor het plasmamembraan targeting en permeabilization in necroptosis zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificeren van genetische componenten van necroptosis heeft vergemakkelijkt het gebruik van dierlijke modellen voor het testen van de implicaties van necroptosis in fysiologie en ziekte1,2,3,4,5. Knock-out van RIPK3 of MLKL in muizen had minimale implicatie in ontwikkeling en volwassene homeostase suggereert dat necroptosis is niet essentieel voor leven3,6. Sommige soorten bevatten bovendien geen RIPK3 of MLKL genen, ter ondersteuning van de niet-essentiële rol van necroptosis in dieren7,8. Aan de andere kant, is knock-out diermodellen uitdagend met diverse ziektebeelden geïnduceerd in het laboratorium gebleken dat een belangrijke rol van necroptosis in de ontsteking, aangeboren immuniteit en virale infectie9,10, 11 , 12.

Necroptosis kan op verschillende manieren worden geactiveerd door signalering door middel van verschillende aangeboren immuniteit sensoren, al die resulteren in de activering van RIPK31,13,14. Actieve RIPK3 op zijn beurt kinaseenzym en activeert MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. De meest bestudeerde en wellicht de meest complexe manier, die leiden tot activering van RIPK3 gaat dood receptor afbinding, die bifurcates op basis van de stroomafwaartse samenstelling van de signalering complexen ofwel ertoe apoptosis of necroptosis1. Necroptosis ontstaat wanneer signalering via RIPK1 is favoriet en in de betrokkenheid van RIPK319,20 resulteert. Dit resultaat is gemakkelijk favoriet bij farmacologische remming of genetische schrapping van caspase 8, een vermeende endogene inhibitor van necroptosis die houdt van necroptosis in het bay. RIPK1 bindt aan en RIPK3 activeert. Een andere manier om te activeren necroptosis is door middel van Toll-like receptoren TLR3/TLR4 signalering, die zich bezighoudt en activeert RIPK3 via TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF)21. Nog is een andere manier om te sterven door necroptosis door activering van de DNA-sensor DAI, die direct bezighoudt en activeert RIPK322.

MLKL is een cytosolische eiwit bestaat uit een N-terminal helix bundel (NB)-domein en een C-terminal pseudokinase domein (psKD) door een regelgevende brace regio3met elkaar verbonden. In normale cellen, MLKL gevonden in het cytosol waar het wordt beschouwd als in een inactieve complex met RIPK314. Activering van necroptosis activeert fosforylering van de RIPK3 van MLKL in de lus van de activering van de psKD, en potentieel extra sites in de NB en brace3,15,23. Fosforylering induceert een conformationele verandering in MLKL waardoor de dissociatie van RIPK314. Slecht begrepen conformationele wijzigingen laat de brace uit de psKD24. De brace, die 2 helices bevat, bemiddelt oligomerisatie van MLKL in een vermeende trimeer via de C-terminal helix25. De helix van de N-terminal van de brace remt het domein NB, hetgeen essentieel om membraan permeabilization24,26 is. In isolatie is NB domein voldoende voor het opwekken van plasmamembraan permeabilization en necroptosis16,24,27. De activiteit van de pro-necroptotic voor NB was gereconstitueerd in muis embryonale fibroblasten tekort aan MLKL (mlkl- / - MEFs). NB is een lipide-bindend domein dat netcongestieproblemen de fosfolipide phosphatidylinositol 4,5 (III) difosfaat (PIP2 bezighoudt). Wij hebben voorgesteld een stapsgewijze mechanisme van activering van MLKL, waarin de brace oligomerisatie aanwerving van MLKL naar het plasmamembraan via zwakke interacties voor NB met de PIP2 polar hoofd groep24vergemakkelijkt. Op het membraan ondergaat de NB gereglementeerde blootstelling van een extra hoge-affiniteit bindende site voor PIP2, waarin wordt gemaskeerd door de brace in inactieve MLKL. Over het geheel genomen destabiliseren de meerdere interacties van NB met PIP2 het plasmamembraan leidt tot haar breuk, hoewel het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenissen hebben niet is opgehelderd.

We illustreren hier specifieke methoden gebruikt voor het karakteriseren van de functie van MLKL als beul van necroptosis24. In het bijzonder richten we ons op de meest minimale domein van MLKL, de NB en brace (NBB), die wordt gereguleerd door remming van de brace en kan worden geactiveerd door middel van gedwongen dimerisatie ertoe plasmamembraan breuk en necroptosis. Wij beschrijven onze afleidbare expressie systeem gecombineerd met gedwongen drug-geïnduceerde FKBP-gemedieerde dimerisatie voor live-cel beeldvorming, en elektronenmicroscopie van cellen necroptosis ondergaan. Bovendien, illustreren we onze in vitro NMR-analyse van de interacties van de NBB met phosphatidylinositols (pitten).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. klonen en cel lijn generatie

  1. PCR versterken de NBB-regio, overeenkomt met aminozuurresidu's 1-140 (NBB140), van menselijke MLKL cDNA voor frame standaard restrictie-enzym-gebaseerde klonen met de oligomerisatie-x FK506 domein 2 als bindend-proteïne (2xFKBP of 2xFV) en Venus TL eiwit in de Doxycycline (Dox) - afleidbare retrovirale vector pRetroX-TRE3G te verkrijgen van de NBB140- 2xFV-Venus (tabel 1, figuren 1A-B).
  2. Vereeuwigen van primaire mlkl- /- of ripk3- / - mlkl- / - muis embryonale fibroblasten (MEFs) de respectieve muizen die beschikbaar zijn in het groene laboratorium verkregen door voorbijgaande transfectie met SV40-grote antigeen plasmide uitdrukken. Selecteer vereeuwigd cellen in ~ 1-2 weken, en onderhouden in DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine 100 U/mL penicilline en streptomycine, 1 mM natrium pyruvaat en niet-essentiële aminozuren op 37 ° C en 5% CO2 in standaard weefsel cultuur incubators.
  3. Transduce SV40-vereeuwigd mlkl- / - MEFs met de omgekeerde tetracycline gecontroleerd transactivator (rtTA)-bevattende retrovirus uitgedrukt van een plasmide die het gen weerstand blasticidin (onze gemodificeerde plasmide) bevatten en behandelen voor 1 week met 5 μg/mL blasticidin selecteren voor cellen stabiel rtTA28te uiten.
  4. Transduce de MEFs rtTA-uitdrukken met de Dox-afleidbare retrovirale vector met de chimeer MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) en selecteer met behulp van 4 μg/mL puromycin voor een week, 2 dagen na transductie.

2. live-cel microscopie beeldvorming van MLKL-gemedieerde Necroptosis

  1. Plaat mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus bij een dichtheid van 50.000 cellen per putje (1 mL/putje) in 24 platen goed, en na een nacht bebroeden(Figuur 2). Gebruik live-cel kleuring voor geautomatiseerde cel tellen (Zie Tabel van materialen).
  2. Behandelen van cellen voor 12u met Dox (0.5 μg/mL) voor het opwekken van de uitdrukking van de NBB140-2xFV-Venus.
  3. Induceren necroptosis met 25 nM FKBP dimerizer (Dim) naast 25 nM membraan-ondoordringbare groene fluorescerende kleurstof (Zie Tabel van materialen) in standaard DMEM (zie 1.2). Cellen ondergaan necroptosis accumuleren de kleurstof zoals hun plasma membraan integriteit is aangetast door NBB140-gemedieerde breuk. Tests uitvoeren in drievoud of in viervoud.
  4. Als u wilt controleren met behulp van beeldvormende systemen single - of dual-color (Zie Tabel van materialen) necroptosis, plaatst u de schepen in de respectieve imaging eenheid gehuisvest in een incubator zoogdieren weefselkweek.
  5. Open de software (Zie Tabel van materialen) en selecteer het tabblad schema aankomende scant onder de takenlijst.
    Opmerking: dit protocol is voor beeldvorming met behulp van eenkleurige systemen, maar een soortgelijke software is beschikbaar voor dual-kleurensystemen.
  6. Selecteer de "lade, vaartuig, Scan typen", en de "Scan patroon" in het tabblad "Fysieke lay-out" en "Snel fluorescentie" op het tabblad Eigenschappen.
  7. Voeg de "scannen tijd" door te klikken op de "Timeline" venster en het totale aantal van de tijdstippen en de frequentie van de overname (meestal 1 acquisitie elke 0.5 h tot 1 h voor 6 h tot 12 h of elke 5 min. voor het snel-kinetiek necroptosis) en beeldacquisitie starten door het selecteren van "App ly"(rode knop).
  8. Kwantificeren van necroptosis met behulp van de software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen) door te selecteren in het "taakvenster", "Object Counting nieuwe analyse met vaste segmentatie drempel boven het achtergrondniveau", die kan worden bepaald door te hangen de muiscursor over achtergrond regio's in verschillende afbeeldingen die worden gebruikt bij de analyse.
  9. Fluorescerende objecten onderzoeken door Previewing met behulp van de huidige afbeelding selecteren en verfijnen van de drempelniveaus, zo nodig.
  10. Integreren van groene fluorescentie graven door te openen het tabblad "Launch nieuwe Analysis", kies de "periode", selecteer de putten worden geanalyseerd, voer de "analyse Taaknaam" en druk op "OK".
  11. Toegang tot gegevens via het tabblad "Analyse Jobs" geanalyseerd door te dubbelklikken op de respectieve Taaknaam en exporteren vanuit het venster grafiek/Export voor aanvullende analyse in externe grafische software (Zie Tabel van materialen).
  12. Kwantificeren van gegevens als groene fluorescentie positief (+ ve) graven/mm2 of normaliseren de graven door de samenvloeiing en als groene fluorescentie + ve graven/samenvloeiing uiting te geven aan de gegevens.
  13. Eventueel bij de experimentele eindpunt, vlek cellen met 100 nM van de membraan-permeant groen-fluorescerende kleurstof (Zie Tabel van materialen). Normaliseren gegevens naar % necroptotic cellen als de verhouding van groen fluorescentie/groen fluorescentie bij eindpunt.

3. live-cel confocale microscopie beeldvorming van plasmamembraan wervings- en Permeabilization door MLKL

  1. Plaat mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus bij een dichtheid van 20.000 cellen per putje (0,5 mL per putje) in een glazen bodem 4-well microscopie kamer voorbehandeld met 50 µg Mo/mL fibronectine in PBS bij 37 ° C gedurende 30 minuten en incubeer gedurende ~ 12 h ( Figuur 2B).
  2. Behandelen van de cellen met Dox (0.5 μg/mL) voor ~ 12 h voor het opwekken van de uitdrukking van de NBB140-2xFV-Venus.
  3. Induceren van necroptosis door aan het broeden met verse medium (1 mL/putje) dat 25 Dim ertoe NBB140nM-2xFV-Venus activering en translocatie aan het plasma-membraan.
  4. Plaats de zaal op een draaiende schijf laser confocal microscoop gebouwd op een omgekeerde standaard uitgerust met omgevingsbeheersing en een 63 scannen 1.4 nb doelstelling en beginnen met behulp van software van keuze overname imaging (Zie Tabel van materialen).
  5. Initialiseren van de software, selecteer "Focus"-pictogram en YFP filter configuratie (excitatie golflengte 515 nm).
  6. Zoek het gezichtsveld en brandvlak en voeren het onderhoud scherpstelsysteem met behulp van het tabblad "Duidelijke Focus".
  7. Om te beginnen de verwerving, selecteer het tabblad van de "Capture" gevolgd door de toewijzing van filter configuratie, passende EMCCD camera blootstelling tijd en intensivering winst en time-lapse overname parameters waaronder interval en de lengte van de overname.
  8. Controleren van cellulaire herverdeling van de fluorescerende NBB140-2xFV-Venus eiwit tijdens necroptosis door de verwerving van beelden elke 10 s door een camera van de EMCCD met behulp van een laser voor 515 nm (film 1).
    Opmerking: Photobleaching baart met fluorescente proteïne beeldvorming. Venus is een van de meer resistent fluorescente proteïnen photobleaching29. Als fluorescente proteïnen die meer vatbaar voor photobleaching zijn worden gebruikt, beeld elke 30 s of langer toestaan dat herstel van het signaal tussen imaging tijdstippen.
  9. Om te controleren plasmamembraan vereniging van NBB140-2xFV-Venus tijdens necroptosis, image elke 10 s het monster bereid in 3.3 door totale interne reflectie fluorescentie microscopie van de (TIRF) met behulp van een microscoop voorzien van een geautomatiseerde TIRF schuif en een 100 x 1.4 nb doelstelling en een EMCCD camera (Movie 2). Stappen 3.5 – 3.7, maar het aanpassen van de hoek van de TIRF binnen de TIRF focus tabblad in volgens de monster- en onderkant glasdikte van de microscopie kamer.
    Opmerking: plasmamembraan markeringen zoals LCK-C-RFP kunnen worden gebruikt als besturingselementen voor plasmamembraan lokalisatie in TIRF analyse.
  10. Uitvoeren van beeldverwerking ter verbetering van de kwaliteit door Convolutie met de negatieve genormaliseerde tweede afgeleide van een Gauss functie (Marr algoritme).

4. elektronenmicroscopie

  1. Plaat mlkl- / - MEFs uiten NBB140-2xFV-Venus bij een dichtheid van 5 miljoen cellen in een plasma beklede 150 mm cel cultuur schotel en incubeer gedurende 12 h (Figuur 3).
  2. Behandelen van de cellen met Doxycycline (0.5 μg/mL) voor het opwekken van de expressie van NB1-140-2xFV-Venus voor 12u.
  3. Induceren NBB140-2xFV-Venus activering en translocatie naar het plasmamembraan met 25 nM van homodimerizer voor 5 min. Ditmaal is gevestigd van de kinetiek van de necroptosis waargenomen in live-cel beeldbewerking.
  4. Verwijder het medium en het herstellen van cellen met behulp van 10 mL 2,5% Glutaaraldehyde, 2% paraformaldehyde in 0,1 M natrium cacodylate buffer pH 7.4 (cacodylate buffer) vooraf opgewarmd bij 37 ° C.
  5. De monster verzameld door schrapen en draaien van de monsters gedurende 10 minuten bij 500 x g. Verwijder het supernatant.
  6. Postfix het monster gedurende 1,5 uur in verminderde 2% osmium tetroxide met 1,5% kaliumferrocyanide in 0,1 M natrium cacodylate buffer. Osmium-tetroxide is een kleuring agent gebruikte in TEM om contrast. We gebruikten TEM als voorlopige analyse voorafgaand aan SEM van cel necroptosis ondergaan.
  7. Spoel het monster 5 keer in ultrazuiver water voor elke 5 min op 500 x g, gevolgd door spoelen in de buffer (zie 4.6), water en ethanol op een automatische processor. Verwijder het supernatant.
  8. Voor de SEM, vlek de eerder vaste monsters met 1% uranyl acetaat en lood aspartaat zware metalen vlek31.
  9. Uitdrogen van de monsters door een gesorteerde reeks van alcohol en propyleen oxide-oplossingen.
  10. Het monster in harde hars32 te verkrijgen van een blok hars insluiten.
  11. Snijd dik secties van 0,5 μm om te bepalen van het juiste gebied van analyse.
  12. Coat de monsters met een ultra-dunne film van elektrisch-geleidend metaal (Iridium).
  13. Beeld en analyseren van de monsters (Figuur 3). Voor kwantificering, een afbeelding van de laag-vergroting van het oppervlak van de blok hars met blootgestelde cellen wordt gescand op 5 keV met een elektronenmicroscoop.
  14. Visualiseren van cellen over individuele beelden door SEM of imaging-software kan worden gebruikt om meerdere velden-of-view meedoen in één aaneengesloten afbeelding30. Ongeveer 100 cellen kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de Fractie van cellen ondergaan necroptosis op deze manier door het genereren van een hoge resolutie montage in de software van keuze (Zie Tabel van materialen).
    Opmerking: Scoren van necrotisch morfologie door SEM vergelijking tussen de normale cel functies met de progressie van vooraf necrotisch of necrotische fenotypen. Deze functies omvatten plasmamembraan wijzigingen met inbegrip van de microvilli verdwijning, afvlakken, breuken in cellen variërend van 10 nm tot 1 µm in grootte, of verlies van organel structuur over ten minste 30 – 40% van de oppervlakte van cytosolische cel.

5. lipide Binding van MLKL met nucleaire magnetische resonantie (NMR), infraroodspectroscopie

  1. 15N-geëtiketteerden NBB1-156 door standaard eiwit expressie en zuivering als eerder beschreven24voor te bereiden.
  2. Los 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol ammoniumzout (18:0-PI) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) ammoniumzout (18:1 PI) in 500 µL van ijskoude CHCl3 elke voor eindconcentraties van 1 mg/mL.
  3. Bewerk ultrasone trillingen ten 1 mg/mL 18:0 en 18:1 PI in een waterbad ultrasoonapparaat voor 1 minuut bij kamertemperatuur of tot 5 min in een mengsel van ijs-water.
  4. Aliquot 1 mg/mL 18:0 en 18:1 PI in schone glazen flesjes voor individuele NMR titratie serie (Figuur 4). Overdracht lipiden in organische oplosmiddelen, met behulp van glas luchtdichte spuiten.
    1. Aliquot 132 µL van 1 mg/mL 18:1 PI (molmassa = 880.137 g/mol) in CHCl,3 voor een definitieve resuspensie volume van 1.200 µL 125 µM concentratie.
      Opmerking: Voor 5 mm NMR buizen, bereiden seriële verdunning volumes van > 1000 µL en definitieve NMR proeven volumes van > 500 µL. Voor 3 mm NMR buizen, bereiden seriële verdunning volumes van > 300 µL en definitieve NMR proeven volumes van > 150 µL.
  5. Aliquot 1 mg/mL varkens brain L-α-phosphatidylinositol-4,5-difosfaat ammoniumzout in 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (hersenen PI (4,5) P2) in schone glazen flesjes.
  6. Flesjes onder een gasvormige stroom van argon (Ar) of stikstof (N-2) met matige doorstroming naar organische oplosmiddelen verdampen zonder spetters tegen de muren van de flacon glas te plaatsen. Vijf tot dertig min is meestal voldoende voor volumes van 10 – 200 µL organisch oplosmiddel.
  7. Regelen glas vial(s) onderaan Büchner of een vacuüm kolf met behulp van grote pincet, verzegelen met een rubberstop en hechten kunststof slang aangesloten op een vacuüm lijn. Kolf onder milde vacuüm 's nachts te verwijderen van de resterende organics evacueren.
  8. Overlay lipide film aliquots met inert gas, verzegelen met een luchtdicht deksel en bewaren bij-20 ° C voor gebruik binnen één maand of -80 ° C voor langere opslag.
  9. Bereiden van NMR monster buffers zonder wasmiddel (-Det) met 20 mM nbxHyPO4 pH 6.8, 10% D2O en met wasmiddel (+ Det) met 20 mM nbxHyPO4 , pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. Toevoegen + Det buffer glazen ampul met lipide film Bewerk ultrasone trillingen ten in waterbad voor maximaal 30 min, afwisselend ultrasoonapparaat gedurende 10 minuten te bereiken van de gewenste concentratie gevolgd door visuele inspectie.
    Opmerking: Ultrasoonapparaat kan warm monster. Laat afkoelen tot kamertemperatuur voor 15 min vóór definitieve eiwit monster reconstitutie.
  11. Seriële verdunning van lipide-wasmiddel micellen in + Det buffer met behulp van ultrasoonapparaat van 1:1 mengsels voor de gewenste concentratie-reeks uitvoeren Basisgewicht: 125 µM vetgehalte, zal drie herhalingen opleveren 62,5 µM, 31.3 µM en 15.6 µM lipide in 0,34 mM DDM.
  12. Bereiden van controle en verwijst naar de NMR monsters van eiwit en additieven in - Det en + Det buffers, respectievelijk. Toevoegen eiwit en additieven aan elke verdunning van lipide in + Det buffer.
    Opmerking: Voor 15N NBB156, eiwit wordt toegevoegd aan een eindconcentratie van 40 µM en aangevuld met 2 mM Halfzwaar dithiothreitol te houden Cys residuen verminderd.
  13. Het juiste volume van monsters overbrengen in 5 mm of 3 mm NMR buizen (zienoot in stap 5.4).
  14. Handmatig laden van steekproeven in de NMR instrument of regelen in een automatisering-platform zoals de lader van de SampleCase.
  15. Verwerven van samengestelde NMR spectra met behulp van standaard pulse programma's voor 1H proton spectra als kwaliteitscontrole gevolgd door 2D 1H -15N correlatie spectra hetzij als transversale ontspanning geoptimaliseerd spectroscopie (TROSY) of heteronucleaire meerdere quantum samenhang (SOFAST-HMQC)33.
    Opmerking: Gebruik van 3 mm NMR buizen vereist 64 scans voor 1 H -15N TROSY (~ 3 h) of 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan nummers voor 5 mm NMR buizen zijn gehalveerd.
  16. Verwerkte 2D NMR spectra kunnen worden toegevoegd aan een CARA repository34 voor analyse- of andere software van keuze voor de gebruiker.
  17. Software analyseren door annoteren 2D NMR resonanties voor drie goed verspreid en opgelost pieken voor elk eiwit staat. De piekamplitudes opnemen voor elk van de zes toppen voor elke voorwaarde van de buffer met NBB156 (Figuur 5A).
    1. CARA gebruiken ter voorbereiding van een batch-integratie-lijst (Klik op Main Menu rubriek "Spectrum | Setup lijst Batch"...) van alle spectra verzameld en analyseren met behulp van een toewijzingsbestand één piek (Klik op Main Menu rubriek "pieken | Importeren van Peaklist".. .en kies een gebruiker gedefinieerde .peaks bestand met 6 totaal pieken, 3 voor elk eiwit staat, gedefinieerd binnen).
    2. Afstemmen van de instellingen ("Integrator | Tune piek Model"...) X-breedte 0.06 ppm en Y-breedte 0,30 ppm (Klik op Main Menu rubriek "Integrator | Tune piek Model"...) voordat het opnemen van de uiteindelijke uitvoer in twee menuselecties (1. Klik op Main Menu kop "Integrator | Integreren van lijst Batch") (2. Klik op Main Menu kop "pieken | Integratie-tabel exporteren") (Figuur 5B).
      Opmerking: De ruggengraat amide resonanties voor residuen M21, V53 en L105 hebben gekregen voor de NBB156 gesloten-brace staat. De open-brace staat werd toegewezen aan ruggengraat amide resonanties van residuen G130 en A141 en de epsilon proton zijketen resonantie van W133 met behulp van 3D NMR experimenten24.
  18. Normaliseren monsters voor directe vergelijking van de verschillende magneten of monster voorwaarden door de drie open-brace amplitudes van de referentiemonsters gemiddeld en een factor van de normalisatie betreffende de twee verwijzingen te berekenen. Bereken de schaal amplitudes voor NBB156 resonanties met behulp van de factor van de normalisatie en de negatieve amplitudes van de instelling op nul (tabel 2).
    Voorbeelden: 1) vergelijken monsters van verschillende magneten: magneet A, NBB156DDM en magneet B, NBB156+ DDM. 2) wasmiddel vergelijking: 0,34 DDM en 1,7 mM DDM.
  19. Berekenen voor elke resonantie de geschaalde breuk van gesloten - of open-brace door te delen met een aantal minimale tot de maximale amplitude van alle spectra verzameld met relevante referenties van gratis NBB156 en volledig open-brace NBB156 in wasmiddel.
  20. De genormaliseerde NMR amplitudes plot als een functie van vetgehalte en vergelijken van de Fractie van de open-brace NBB156 in verschillende omstandigheden (figuur. 5 C).
    Opmerking: Als alternatief, analyse van de Fractie van gesloten-brace conformatie tegen vetgehalte kan worden uitgevoerd om te vergelijken lipide binding aan NBB156. Wij verkiezen de voormalige analyse, want het is sneller en beter verslagen over de breuk volledig-door lipiden betrokken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visualiseren van gereglementeerde necroptosis uitvoering in levende cellen is mogelijk door middel van afleidbare expressie voor een minimale afgeknotte MLKL construct, NBB140-2xFV-Venus. Deze constructie de capaciteit voor het opwekken van plasmamembraan permeabilization onderhoudt en wordt geactiveerd door middel van de Dim-geïnduceerde oligomerisatie van de cassette FKBP (2xFV). We observeren en kwantificeren van necroptosis door live-cel microscopie imaging, monitoring kine...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij bieden protocollen voor technieken die wij samengevoegd tot de betrokken MLKL als de vermeende beul van plasmamembraan breuk24. Naast het ontcijferen van de regelgevende netwerk dat MLKL-gemedieerde necroptosis regelt, kunnen deze technieken onafhankelijk worden gebruikt te karakteriseren van andere passende biologische systemen. Praktisch gesproken, zijn deze technieken middellange - tot laag-throughput diagnosetools.

We hebben regelmatig live-cel beeldvorming van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Klonen en cellijngeneratie
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transactivator plasmidLlambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S HydrochlorideThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
Celdood kwantificering en live-cel microscopie
DoxycyclineClontech631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Ammonium ChlorideCambridge Isotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Deuterium OxideSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Gespecialiseerde apparatuur
IncuCyte FLR of ZOOMEssen BioScience, Inc.Live-cel microscopie beeldvorming
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher ScientificElektronenmicroscoop
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comBeeldanalyse
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM analyse
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comNMR dataverzameling
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ NMR data-analyse
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookConfocal microscopie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MLKL NecroptosisLive cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid Binding AnalysisConfocal MicroscopyElectron MicroscopyNecroptosis InductionMLKL TranslocationPhosphatidyl inositol Phosphates

Gerelateerde artikelen