Method Article

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tot op heden, zijn de verschillende types van de stamcel op verschillende ontwikkelingsstadia in de focus voor de behandeling van degeneratieve ziekten. Echter verminderde bepaalde aspecten, zoals de eerste massale celdood en lage therapeutische effecten, hun brede klinische vertaling. Genetische manipulatie van stamcellen voorafgaand aan de transplantatie naar voren gekomen als een veelbelovende methode voor het optimaliseren van de cel van de stam van de therapeutische effecten. Gen van de veilige en efficiënte levering systemen zijn echter nog steeds ontbreekt. Daarom kan de ontwikkeling van geschikte methoden biedt een aanpak om op te lossen van de huidige uitdagingen in stamcel gebaseerde therapieën.

Dit protocol beschrijft de extractie en de karakterisatie van menselijke tandheelkundige follikelstimulerend stamcellen (hDFSCs) en hun niet-virale genetische modificatie. De postnatale tandheelkundige follikel onthuld als een veelbelovende en gemakkelijk toegankelijke bron voor het oogsten van adulte multipotente stamcellen hoge proliferatie potentieel bezitten. De procedure beschreven isolatie presenteert een eenvoudige en betrouwbare methode om te oogsten hDFSCs van beïnvloed wijsheid tanden. Dit protocol bevat ook methoden om te definiëren van de kenmerken van de cel van de stam van geïsoleerde cellen. Voor genetische manipulatie van hDFSCs, wordt een geoptimaliseerde kationische lipide gebaseerde transfectie strategie gepresenteerd waardoor hoogefficiënte microRNA Inleiding zonder cytotoxische effecten. MicroRNAs zijn geschikte kandidaten voor voorbijgaande cel manipulatie, omdat deze kleine translationeel toezichthouders controle de lotgevallen en het gedrag van stamcellen zonder het gevaar van stabiele genoom integratie. Dit protocol vormt aldus, een veilige en efficiënte procedure voor de engineering van hDFSCs die belangrijk zijn voor het optimaliseren van hun therapeutische werking kan worden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke tandheelkundige follikel is een losse ectomesenchymally afkomstige bindweefsel rondom de ontwikkelende tand1,2. Naast zijn functie om osteoclastogenesis en osteogenesis voor de tand uitbarsting proces te coördineren, herbergt dit weefsel cellen van de stam en voorlopercellen vooral voor de ontwikkeling van het parodontium3,4,5. De tandheelkundige follikel is derhalve als een alternatieve financieringsbron te oogsten menselijke adulte stamcellen6,7.

Verschillende studies aangetoond dat stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel (hDFSCs) geschikt zijn voor differentiatie in de parodontale afkomst, met inbegrip van botcellen, ligament fibroblasten en cementoblasts8,9,10 . Bovendien, deze cellen werden getoond aan alle kenmerken van mesenchymale stromale cellen (MSCs) met inbegrip van zichzelf vernieuwende capaciteit, de naleving van de plastic, expressie van specifieke oppervlakte markers (b.v., CD73, CD90, CD105) zo goed als osteogenic, adipogenic en chondrogenic differentiatie potentiële11,12,13. Andere studies bleek ook een potentieel van de neurale differentiatie van hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Als gevolg van hun veelbelovende eigenschappen en gemakkelijke toegang werd hDFSCs onlangs relevant voor weefsel engineering19,20,21. De eerste studies geconcentreerd op het potentieel van DFSCs voor de regeneratie van bot, parodontale en tand wortels19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Sinds de kennis van de neurogene vermogen van hDFSCs, is hun toepassing als mogelijke behandeling voor neurodegeneratieve ziekten onderzochte31,32,33. HDFSCs hebben ook opgedaan belang met betrekking tot het herstel van andere weefsels (bijvoorbeeld hoornvlies epitheel)34,35. De therapeutische mogelijkheden van hDFSC is niet alleen gebaseerd op hun directe differentiatie mogelijkheden maar ook op hun paracrine activiteit. Onlangs, hDFSCs is aangetoond dat het afscheiden van een schat aan bioactieve factoren, zoals matrix metalloproteinasen (MMP), insuline-achtige groei factor (IGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF) en hepatocyte groei factor (HGF), die een cruciale rol voor de angiogenese, immunomodulatie, extra cellulaire matrix remodelleren en herstellend processen36.

Brede klinische vertaling van stamcel therapie is echter nog steeds aangetast door verschillende uitdagingen, zoals massale eerste celdood en37,38van de effecten van de lage positieve cel van de stam. Genetische manipulatie biedt een veelbelovende strategie om deze problemen aan te pakken en daarom kan sterk verbeteren van de therapeutische werking van stamcellen38,39,40. Voor tijdelijke cel manipulatie zijn microRNAs (miRs) geschikte kandidaten, omdat deze kleine translationeel toezichthouders controle de lotgevallen en het gedrag van stamcellen zonder het gevaar van stabiele genoom integratie41,42, 43. tot op heden verschillende heilzame miRs geconstateerd bevordering van stam celproliferatie, overleving, homing, paracrine activiteit, evenals hun differentiatie in verscheidene geslachten44. Bijvoorbeeld, ontworpen miR-133a MSCs toonde een hogere overleving en de engraftment in infarcted rat hart wat resulteert in een verbeterde cardiale functie wanneer vergeleken bij ongewijzigde van de MSCs45. MiR-146a overexpressing MSCs werden ook getoond om hogere bedragen van VEGF die op zijn beurt geleid tot een verbeterde therapeutische efficiëntie in ischemische weefsel46afscheiden.

Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor de selectieve extractie en genetische manipulatie van hDFSCs. Voor dit doel beschreven we de oogsten en enzymatische vertering van menselijke tandheelkundige follikels en de daaropvolgende Isolatievan hDFSCs. Om het karakteriseren van geïsoleerde cellen, zijn belangrijke aanwijzingen voor de verificatie van MSC eigenschappen opgenomen overeenkomstig de richtsnoeren van de International Society for cellulaire therapie13. Daarnaast bieden wij een gedetailleerde beschrijving voor de generatie van miR gemodificeerde hDFSCs door toepassing van een strategie van kationische lipide gebaseerde transfectie en de evaluatie van de efficiëntie van de transfectie en cytotoxiciteit.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSCs zijn geïsoleerd van de tandheelkundige follikels uitgepakte verstandskiezen geboden door het departement van orale en maxillofaciale plastische chirurgie van het Rostock University Medical Center. Geïnformeerde toestemming en schriftelijke toestemming is verkregen van alle patiënten. Deze studie werd gemachtigd door de lokale ethische commissie van de Universiteit van Rostock (No. A 2017-0158 toestemming).

1. isolatie van hDFSCs

Opmerking: Voorkom bacteriële besmetting en moeten wijsheid tanden niet worden uitbrak vóór de extractie

  1. Voorbereiding van vereiste oplossingen
    1. Bereiden-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) / penicilline-streptomycine-Glutamine (P-S-G) oplossing: Meng 495 mL PBS met 5 mL P-S-G oplossing. Winkel aliquots van 50 mL bij 4 ° C.
    2. HDFSC-kweekmedium bereiden: Meng 445 mL van basaal medium met 5 mL antibiotica agent en 50 mL van foetale runderserum (FBS). Bewaren bij 4 ° C.
    3. Bereiden van Collagenase type ik stockoplossing (30 mg/mL): 300 mg van Collagenase type ik in 10 mL van basaal medium aangevuld met 1% antibiotica agent verdunnen. Krachtig Meng de oplossing. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 µm filter. Winkel aliquots van 500 µL van Collagenase typ ik stockoplossing bij-20 ° C.
    4. Dispase II-stockoplossing (40 mg/mL) bereiden: Verdun 40 mg Dispase II 10 ml van basaal medium aangevuld met 1% antibiotica agent. Krachtig Meng de oplossing. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 µm filter. Winkel aliquots van 500 µL van Dispase II stockoplossing bij-20 ° C.
  2. Chirurgische ingreep
    1. Injecteren van een voldoende hoeveelheid (maximale: 2 mL) van lokale verdoving.
    2. Maken en een driezijdige mucoperiosteal klep te verhogen. Het verhogen van een meertalige klep is niet vereist.
    3. Bescherm de meertalige aspect met een periosteal lift.
    4. Zachtjes molen buccale en distale bot met een ronde hard metalen burr.
    5. Los van het weefsel van de follikel met een periosteal lift. Verwijder voorzichtig de volledige tand (kiem) en follikel door te trekken uit de kroon (en follikel) met achterste (derde-molar) pincet.
    6. Debride en bevloeiing van de socket grondig met NaCl-oplossing.
    7. Vervang de mucoperiosteal klep met vicryl hechtingen (Zie Tabel van materialen).
    8. De follikel tand uit de mondholte te verwijderen en plaats hen in een aliquoot deel van 50 mL PBS/P-S-G oplossing.
      Opmerking: Het monster kan bij 4 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.
  3. Enzymatische vertering van de follikel tand
    1. Vooraf warm hDFSC kweekmedium en PBS/P-S-G oplossing tot kamertemperatuur (RT).
    2. Ontdooi een aliquoot gedeelte van elk type Collagenase I en Dispase II stamoplossingen. Bereid een oplossing van de spijsvertering van 3 mg/mL Collagenase type ik en 4 mg/mL Dispase II door toevoeging van 500 µL van elke Collagenase type I en Dispase II stockoplossing tot 4 mL voor basale gemiddeld met 1% antibiotica agent.
    3. Plaats van uitgepakte follikel in een steriele petrischaal en voeg 10 mL PBS/P-S-G oplossing te wassen het uitgepakte weefsel. Herhaal deze stap wassen tweemaal.
    4. Mince de uitgepakte follikel aan stukken van ongeveer 1 mm x 1 mm met een steriel scalpel binnen de petrischaal met 10 mL PBS/P-S-G oplossing.
    5. Pipetteer gehakt weefsel en PBS/P-S-G oplossing van de petrischaal in een tube van 50 mL conische centrifuge. Wassen van de petrischaal met 10 mL PBS/P-S-G oplossing en breng de oplossing kwantitatief over in de dezelfde buis.
    6. Centrifugeer de conische centrifugebuis gedurende 10 minuten bij 353 x g bij RT en verwijder het supernatant.
    7. Voeg 5 mL van de oplossing van de spijsvertering aan het Ingehuld weefsel. Meng voorzichtig de oplossing en het weefsel. Incubeer het mengsel bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 uur in een schudden incubator.
    8. Centrifuge verteerd cel/weefsel schorsing bij 353 x g gedurende 10 minuten op RT. Discard het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 6 mL hDFSC kweekmedium.
    9. Zaad celsuspensie in een 25 cm2 cel cultuur kolf en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 en 20% O2cellen.
      Opmerking: Het resterende weefsel overbrengen de kolf van de cultuur van de cel zo goed als weefsel wordt niet volledig verteerd.
    10. Wijzigen medium zorgvuldig 24 h na het zaaien van de cel. Daarna medium elke drie dagen tot confluentie wijzigen.
      Opmerking: HDFSCs kunststof-aanhanger 24 h na het zaaien van de cel moet worden en kunnen worden gescheiden van niet-aanhanger cellen en bloedbestanddelen door simpelweg het veranderen van het medium.
  4. Cel oogsten
    1. Vooraf warm hDFSC kweekmedium, PBS/P-S-G oplossing en trypsine/ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing voor RT.
    2. Verwijder het supernatant van cultuur kolf en wassen van confluente cellen met 5 mL PBS/P-S-G oplossing.
    3. Voeg 1 mL trypsine/EDTA-oplossing over in een maatkolf van de cultuur en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Stop het spijsverteringsproces bij 3 mL hDFSC kweekmedium aan de kolf cultuur toe te voegen.
    4. Pipetteer celsuspensie in een tube van 15 mL conische centrifuge en centrifugeren van de suspensie voor 10 min bij 353 x g bij RT. Discard het supernatant en resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid van een hDFSC voedingsbodem.
    5. Cellen tellen: meng zachtjes 10 µL celsuspensie met 10 µL van Trypan blauwe oplossing. 10 µL van toepassing in een kamer tellen en berekent het bedrag van de cel hDFSC.

2. karakterisering van hDFSCs

  1. Immunophenotyping
    1. Voorbereiding van cellen voor flow cytometrische analyse
      1. Voorbereiding van vereiste oplossingen
        1. PBS/EDTA (2 mM) bereiden: Meng 996 mL PBS met 4 mL EDTA (0,5 M).
        2. Kleuring buffer bereiden: Meng 995 mL PBS/EDTA (2 mM) met 5 g van BSA. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 µm filter eenheid en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
        3. Paraformaldehyde (PFA) stockoplossing (4%) bereiden: Verdun 4 g PFA in 100 mL PBS en verwarm de oplossing tot 80 ° C. De oplossing mengen en de pH-waarde tot 7.3. Aliquot verkregen PFA oplossing in de respectieve bedragen (1,5 mL) en opslag bij-20 ° C tot gebruik.
          Let op: Omdat PFA dampen giftig zijn, bereid de PFA-oplossing in een geventileerde zuurkast.
      2. Pipetteer 14 monsters van 5 x 104 cellen in 1,5 mL microcentrifuge buizen na cel oogsten (1.4). Centrifugeer de schorsingen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
        Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer. Cellen en reagentia op ijs houden tenzij anders vermeld.
      3. Resuspendeer de cellen in bepaalde hoeveelheden van kleuring buffer (4 ° C) en voeg FcR blokkeren reagens (4 ° C) zoals aangegeven in tabel 1.
      4. Voeg de volgende antistoffen op de binnenzijde van het respectieve monster zoals aangegeven in tabel 1: Allophycocyanin (APC) muis anti-mens op het gebied van CD29; APC muis IgG1 κ isotype controle; Peridinin-chlorofyl eiwit (PerCP)-Cyanine5.5 muis anti-mens op het gebied van CD44; PerCP-Cyanine5.5 muis IgG2b κ isotype controle; V500 muis anti-mens op het gebied van CD45; V500 muis IgG1 κ isotype controle; Phycoerythrin (PE) muis anti-mens op het gebied van CD73; PE muis IgG1 κ isotype controle; PerCP-Cyanine5.5 muis anti-menselijke CD90; PerCP-Cyanine5.5 muis IgG1 κ isotype controle; Anti-menselijke CD105 muis: Alexa Fluor (AF) 488; muis IgG1 negatieve controle: AF488; PE-Cyanine7 muis anti-mens op het gebied van CD117; PE-Cyanine7 muis IgG1, κ isotype controle. Nadat antilichamen hebben toegevoegd aan elk monster, spin down antilichamen en meng voorzichtig. Incubeer de oplossingen voor 10 min bij 4 ° C.
      5. Voeg 1 mL PBS (4 ° C) en centrifugeren van de monsters bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
      6. Resuspendeer de cellen in 100 µL van PBS (4 ° C) en 33 µL van PFA (4%) toe te voegen. Meng de oplossingen en bewaren op ijs of bij 4 ° C tot flow cytometrische analyse.
    2. Cytometrische Stroommeting van cellen
      Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer. Houden cellen op ijs tot meting.
      1. Pipetteer monsters in buizen geschikt voor stroom cytometrische metingen te onderzoeken de expressie van oppervlakte antigenen.
      2. Minstens 2 x 104 evenementen met behulp van een cytometer van de stroom te meten. Analyseren zoals afgebeeld in Figuur 2.
  2. Multipotente differentiatie mogelijkheden van hDFSCs
    1. Gebruik een commercieel beschikbare menselijke mesenchymale stamcellen functionele identificatie Kit om te bevestigen, adipogenic, osteogenic en chondrogenic differentiatie mogelijkheden van hDFSCs. Toepassen van de ezel anti-geit AF488 secundair antilichaam voor de kleuring van vetzuur bindend-proteïne 4 (FABP4) en aggrecan evenals ezel anti-muis AF488 secundair antilichaam voor verkleuring van de osteocalcin. Voor de kleuring van kernen, montage medium met 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) te gebruiken.
      Opmerking: Voorbereiding van monsters zonder primair antilichaam als negatieve controles voor microscopische analyses.
    2. Het analyseren van expressie van eiwitten door laser scanning confocal microscopie. Microscopie instellingen: 40 x doelstelling met olie-immersie; excitatie laser 488 nm (voor AF488) en 405 nm (voor DAPI).

3. de transfectie van hDFSCs

  1. Zaad na cel oogsten (1.4), hDFSCs op een 24-well cel cultuur plaat 24 h vóór transfectie.
    Opmerking: Het starten van de celdichtheid is ongeveer 4 x 104 cellen per putje. Cellen moeten bereiken ~ 80% samenvloeiing op dag van transfectie.
    Opmerking: Zaad één extra cel monster als besturingselement voor flow cytometrische analyse.
  2. Voorbereiding van transfectie complexen
    Opmerking: Om te voorkomen dat besmetting van RNases, reinigt u de werkruimte rechtstreeks voor de bereiding van transfectie complexen met behulp van RNase decontaminatie oplossing. Gebruik alleen RNase-vrij materiaal en oplossingen.
    Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer.
    1. MiR-stockoplossing (50 µM) bereiden: resuspendeer Cy3-gelabelde voorloper miR (5 nmol) in 100 µL van de nuclease-vrij van het water. Aliquot verkregen stockoplossing van het miR in respectieve bedragen (5 µL) en winkel in het donker bij-20 ° C tot gebruik.
    2. Verdun 40 pmol van miR (0.8 µL van de stockoplossing van de miR 50 µM) in 66,7 µL van verminderde serum medium. Meng de oplossing voorzichtig
    3. Verdun 0,67 µL van kationische lipide gebaseerde transfectiereagens in 66,7 µL van verminderde serum medium. Meng de oplossing voorzichtig en incubeer gedurende 5 min op RT.
    4. Na incubatie toevoegen de vooraf verdunde transfectiereagens naar de vooraf verdunde miR. Meng de oplossing voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten op RT.
  3. De complexen bereid transfectie ontkleuring rechtstreeks aan het kweekmedium aan cellen toevoegen. Meng voorzichtig door de 24-well cel cultuur plaat heen en weer schommelen.
  4. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2en 20% O2 gedurende 24 uur.

4. analyse van de Transfectie

Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer.

  1. Cel oogsten na transfectie
    Opmerking: Het verzamelen van alle mobiele oplossingen van één monster in de dezelfde conische centrifugebuis van 15 mL.
    1. 24 uur na de transfectie, verzamelen het supernatant van monsters in de respectieve centrifuge buizen.
    2. Cellen met 1 mL PBS wassen, Breng PBS in de respectieve centrifugebuis en voeg 500 µL trypsine/EDTA (RT) naar cellen. Incubeer de oplossingen gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
    3. Stoppen trypsinebehandeling door toevoeging van 1 mL gestolde voedingsbodem (RT) op de cellen en de overdracht de oplossing in de respectieve centrifugebuis. Centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
      Opmerking: Vanaf dit moment, houd cellen en reagentia op ijs tenzij anders vermeld.
  2. Voorbereiding van cellen voor flow cytometrische analyse
    1. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 100 µL van kleuring buffer (4 ° C) en overdracht cel oplossing voor een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
    2. 0,5 µL van amine reactieve kleurstof aan de monsters toevoegen om het onderscheid tussen levende en dode cellen. Zachtjes Meng de oplossing en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
    3. Voeg 1 mL PBS (4 ° C) tot cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    4. Resuspendeer de cellen in 100 µL van PBS (4 ° C) en 33 µL van PFA (4%) toe te voegen. Meng de oplossingen en bewaren op ijs of bij 4 ° C tot flow cytometrische analyse.
  3. Cytometrische Stroommeting van cellen
    Opmerking: De volgende werkzaamheden uitvoeren in een nogal grijs kamer. Houden cellen op ijs tot meting.
    1. Pipetteer monsters in buizen geschikt voor stroom cytometrische metingen.
    2. Onderzoeken van de levensvatbaarheid van de cellen en miR opname efficiëntie met behulp van een cytometer van de stroom. Minstens 2 x 104 gebeurtenissen te meten. Gebruik de gating strategie afgebeeld in Figuur 4.
      Opmerking: Untransfected cellen worden gebruikt als negatieve controle te regelen de gating voor Cy3 positieve cellen en voor de berekening van de celdood, veroorzaakt door transfectie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd isolatie instructie om te oogsten van de hDFSCs van menselijke tandheelkundige follikel weefsel. Als gevolg van de gemakkelijke toegang van de tandheelkundige follikel tijdens een routine-operatie is het een veelbelovende bron voor de winning van volwassen stamcellen.

De geïsoleerde hDFSCs toonde alle kenmerken voor de definitie van MSCs13beschreven. In feite, cellen ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volwassen stamcellen zijn momenteel in focus voor de behandeling van verschillende degeneratieve ziekten. In het bijzonder, beenmerg (BM)-afgeleid van stamcellen, met inbegrip van hematopoietische stamcellen (HSCs) en de MSCs, onder intensieve klinisch onderzoek47. BM oogsten is echter een invasieve procedure veroorzaken van pijn op de site van donatie en kan leiden tot ongewenste voorvallen48. Onlangs, het postnatale tandheelkundige weefsel heeft ontpopt als een roman en g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het programma van de FORUN van het Rostock universitair medisch centrum (889018) en de VOCHTIGE Foundation (2016-11). Daarnaast P.M. en R.D. worden ondersteund door de goedgekeurd (VIP + 00240).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clone SN6, monoklonaal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488monoklonaal
APC Mouse Anti-Human CD29 AntibodyBD Biosciences559883Clone MAR4, monoklonaal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences555751Clone MOPC-21, monoklonaal
PE Mouse Anti-Human CD73 AntibodyBD Biosciences550257Clone AD2, monoklonaal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences555749Clone MOPC-21, monoklonaal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 AntibodyBD Biosciences339217Clone 104D2, monoklonaal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences557872Clone MOPC-21, monoklonaal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 AntibodyBD Biosciences560531Clone G44-26, monoklonaal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences558304Clone 27-35, monoklonaal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 AntibodyBD Biosciences561557Clone 5E10, monoklonaal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences55095Clone MOPC-21, monoklonaal
V500 Mouse Anti-Human CD45 AntibodyBD Biosciences560777Clone HI30, monoklonaal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control AntibodyBD Biosciences560787Clone X40, monoklonaal
FcR Blocking Reagent, humanMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200.5M, pH 8.0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0.22 µm, radio-gesteriliseerde, polyethersulfone
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification KitR&D SystemsSC006
RNase decontaminatieoplossing; RNaseZap RNase DecontaminatieoplossingThermo Fisher ScientificAM9780
Cy3-gelabelde precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negatieve Controle #1Thermo Fisher ScientificAM171205 nmol
Pre-miR miRNA-precursor Negatieve Controle #1Thermo Fisher ScientificAM171105 nmol
Kationisch lipid-gebaseerde transfectiereagens; Lipofectamine 2000 TransfectiereagensThermo Fisher Scientific11668019
Gereduceerd serum medium; Opti-MEM I Gereduceerd Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055polyklonaal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Sterk Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202polyklonaal
Montagemedium; Fluoroshield met DAPISigma-AldrichF6057-20MLhistologie montage medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocale microscoopZeiss
BD FACS LSRII flow cytometerBD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2BD Biosciences
ZEN2011 softwareZeiss
Trypsin/EDTA-oplossing (0,05%/ 0,02%)BiochromL2143in PBS, zonder: Ca2+, Mg2+
Amine reactieve kleurstof; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7,4; zonder: Ca en Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
Basaal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12Thermo Fisher Scientific11039021
Antibioticum, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
Collagenase type IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Filter, Sterifix spuitfilter 0,2 µmBraun4099206
50 mL kegelvormige centrifugeerbuisSarstedt62,547,254
15 mL kegelvormige centrifugeerbuisSarstedt62,554,502
Cell culture flesk 75 cm2Sarstedt833,910,002
Cell culture flesk, 25 cm2Sarstedt833,911,002
Vriesmedium, BiofreezeBiochromF 2270
CryotubesThermo Fisher Scientific3772671,8 mL
Trypan blauw oplossingSigma-AldrichT81540,4 %
TelkamerPaul Marienfeld
Locaal verdovingsmiddel, Xylocitin (lidocaïne hydrochloride) 2% met adrenaline (epinefrine) 0,001%Mibe
NaCl oplossingBraun0,9 %
Vicryl naalden, Vicryl rapideEthicon3 - 0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096(2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015(2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114(2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183(2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005(2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326(2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300(2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902(2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063(2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406(2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154(2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879(2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113(2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dental Follicle Stem CellsStem Cell IsolationEnzymatic DigestionMicroRNA TransfectionCationic Lipid TransfectionFlow Cytometry AnalysisStem Cell CharacterizationMesenchymal Stromal CellsCell Culture ProtocolGenetic Modification

Related Articles