Hier presenteren we een protocol om te produceren huis vliegen carboxylesterase eiwitten in vitro met een baculovirus gemedieerde insect cel expressie systeem en later functioneel karakteriseren van hun rollen in metaboliseringssysteem permethrin, daarmee overdracht van pyrethroïde weerstand door het uitvoeren van cel-gebaseerde MTT assay en in vitro metabole studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Functionele karakterisering van Carboxylesterases in Insecticide resistente huis vliegt, Musca Domestica
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Carboxylesterase-gemedieerde metabolisme wordt beschouwd als een belangrijke rol spelen in insecticide resistentie bij verschillende insecten. Meerdere carboxylesterase genen bleken omhoog-geregeld in de resistente huis vliegen stam, terwijl hun rol in de overdracht van het insecticide resistentie bleef om te worden onderzocht. Hier, ontwierpen we een protocol voor de functionele karakterisering van carboxylesterases. Drie voorbeeld experimenten worden gepresenteerd: (1) expressie en isolatie van proteïnen van de carboxylesterase door een insect van baculovirus-gemedieerde Spodoptera frugiperda (Sf9) systeem voor de expressie van de cel; (2) een cel-gebaseerde MTT (3-[5-dimethykthiazol-2-yl 4] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) cytotoxiciteit assay voor het meten van de tolerantie van insect cellen tot verschillende permethrin behandelingen; en (3) in vitro metabole studies om te verkennen de metabole mogelijkheden van carboxylesterases naar permethrin. Het carboxylesterase gen MdαE7 werd gekloond uit een resistente huis vliegen stam ALHF en gebruikt voor de constructie van een recombinant baculovirus voor Sf9 cellen infectie. De viabilities van de cel tegen verschillende permethrin behandelingen werden gemeten met de MTT-test. De verbeterde cel tolerantie van de experimentele groep (MdαE7-recombinant baculovirus geïnfecteerde cellen) vergeleken met die van de controlegroepen (CAT-recombinant baculovirus geïnfecteerde cellen en GFP-recombinant baculovirus geïnfecteerde cellen) naar permethrin behandelingen voorgesteld de mogelijkheden van MdαE7 in de stofwisseling van insecticiden, waardoor de bescherming van cellen tegen chemische schade. Daarnaast werden carboxylesterase eiwitten uitgedrukt in insect cellen van de Sf9 en om uit te voeren van een metabole studie in vitro geïsoleerd. Onze resultaten aangegeven een aanzienlijke in vitro metabole efficiëntie van MdαE7 naar permethrin, direct de betrokkenheid van carboxylesterases in de stofwisseling van insecticiden die aangeeft en dus de toekenning van insecticide resistentie in huis vliegt.
Inleiding
Insecticide resistentie is momenteel een groot probleem voor huis vliegen controle wereldwijd1,2. Inspanningen om het mechanisme van insecticide resistentie vergemakkelijkt beter begrip van deze kwestie en bieden daardoor nieuwe strategieën om effectief voorkomen of minimaliseren van de verspreiding van resistentie ontwikkeling3. Carboxylesterases, hebben als een van de grote Detoxificatie-enzymen, aangetrokken veel aandacht voor hun rollen in vastleggen en insecticiden in verschillende insecten4,5,6....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. weergave en isolatie van Target proteïnen met een Insect cel Baculovirus-gemedieerde expressie systemen
- Gerichte kloon blunt-ended PCR producten van doel eiwitten uit huis vliegt.
- Ontwerp PCR inleidingen van groen fluorescent proteïne (GFP) en het huis vliegen MdαE7 gen gebaseerd is op hun reeksen en de bijzondere noden van de gekozen vector (tabel 1).
- Een thermostable, corrigeren polymerase van DNA- en grondlagen uit stap 1.1.1 gebruiken voor het uitvoeren van een 150 µL PCR reactie (30 µL van reactie buffer, 3 µL van 10 mM dNTPs, 1.5 µL van polymerase van DNA, 6 µL van huis vliegen sjabloon DNA, 7,5 µL voorste primer ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De levensvatbaarheid van de cellen naar verschillende permethrin behandelingen (MTT assay)
De cytotoxiciteit van permethrine werd onderzocht in MdαE7-recombinant baculovirus besmet Sf9 cellen (experimentele groep) en CAT-recombinant baculovirus (verstrekt door baculovirus besmet kit) geïnfecteerde cellen (controlegroepen). De verbeterde cel toleranties aan permethrine in MdαE7 uitdrukken cellen sterk ondersteunen de metabolische fu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de afgelopen decennia hebben heterologe expressiesystemen wijd gebruikt om te uiten en isoleren van grote hoeveelheden eiwitten, waardoor biochemische en functionele vastberadenheid en karakterisering van enzymen in vitro. Tot op heden zijn verscheidene verschillende modelsystemen waaronder Escherichia coli, Sacccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisen Spodoptera frugiperda aangepast voor recombinant eiwit expressie, en de keuze van de in vitro systeem is van cruci.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium en universele M13-sequentieprimers waren in dit kit inbegrepen. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix voor BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfectie reagens en ganciclovir waren in dit kit inbegrepen |
| pENTR-CAT plasmide | Invitrogen by life technology | Inbegrepen in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentratie: 0,5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cellen in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Vrij Medium Compleet | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytische standaard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analtisch gerangschikt) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analtisch gerangschikt) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters met 0,45 μm GHP Membraan (HPLC Gecertificeerd) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC Systeem | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrofotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
Referenties
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
