Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

Samenvatting

We hebben een strategie om te zuiveren en het beeld van een groot aantal centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor super-resolutie microscopie en single-deeltje gemiddeld ontwikkeld.

Samenvatting

Centrioles zijn grote macromoleculaire assembly's die belangrijk zijn voor de goede uitvoering van fundamentele cel biologische processen zoals de celdeling, de beweeglijkheid van de cel of cellen signalering. De groene algen Chlamydomonas reinhardtii heeft bewezen een inzichtelijke model in de studie van centriool architectuur, functie en samenstelling van het eiwit. Ondanks de grote vooruitgang richting de centriolar het begrip platform is een van de huidige uitdagingen het vaststellen van de precieze lokalisatie van centriolar componenten binnen structurele regio's van de centriolen om beter te begrijpen hun rol in Centriool biogenese. Een belangrijke beperking ligt in de resolutie van de fluorescentie microscopie, die de interpretatie van eiwit lokalisatie in dit organel met afmetingen dicht bij de grens van diffractie compliceert. Ter bestrijding van deze vraag, bieden we een methode om te zuiveren en het beeld van een groot aantal C. reinhardtii centrioles met verschillende oriëntaties met behulp van de resolutie van de Super microscopie. Deze techniek maakt het mogelijk verdere verwerking van gegevens door middel van fluorescerende single-deeltje gemiddeld (Fluo-SPA) wegens het grote aantal centrioles verworven. Fluo-SPA genereert gemiddelden van gekleurd C. reinhardtii centrioles in verschillende richtingen, waardoor de lokalisatie van verschillende eiwitten in de centriolar subregio's. Nog belangrijker is, kan deze methode worden toegepast op afbeelding centrioles van andere soorten of andere grote macromoleculaire samenstellen.

Inleiding

De centriolen is een evolutionair geconserveerde organel dat de kern van het centrosoom in dierlijke cellen en kan fungeren als een orgaan van de basale (hierna aangeduid als centrioles hierna) sjabloon cilia of flagellen in vele eukaryoten^1,2. Als zodanig zijn centrioles kritisch voor biologische processen fundamentele cel variërend van spindel vergadering naar cel signalering. Daarom gebreken in centriool vergadering of een functie hebben in verband gebracht met verschillende menselijke pathologie, met inbegrip van ciliopathies en kanker³.

Centrioles zijn nine-fold, symmetrische, microtubulus triplet gebaseerde cilindrische structuren dat zijn, meestal ~ 450 nm lange en ~ 250 nm breed^4,5,6,7. Conventionele elektronenmicroscopie en cryo-Elektronentomografie van centrioles van verschillende soorten gebleken dat centrioles zijn gepolariseerd langs hun lange as met drie verschillende regio's: een proximale regio, een centrale kern en een distale regio^{5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}. belangrijk is dat elk van deze regio's specifieke structurele kenmerken weergegeven. Ten eerste bevat het lumen van de 100 nm durende proximale regio de structuur van de Radslag aangesloten op de microtubuli triplet via de pinhead element¹². Ten tweede, de regio van 300 – 400 nm durende midden vezelig dichtheden in de lumen en structurele kenmerken langs de binnenzijde van de microtubuli bevat: de linker Y-vormige, de C-zaadvormende staart en de A-zaadvormende stub⁹. Ten slotte is de 50-100 nm distale regio vertoont sub distale en distale aanhangsels die het distale deel van de centriolen^{5,13 omringen}.

De laatste twee decennia hebben gekenmerkt door de ontdekking van een toenemend aantal centriolar eiwitten, leiden tot een huidige schatting van ongeveer 100 verschillende eiwitten die deel uitmaken van de centriolen^{14,15,16, 17}. Ondanks deze vooruitgang, de precieze lokalisatie van deze proteïnen binnen de centriolen blijft ongrijpbaar, met name binnen structurele subregio's. Nog belangrijker is, is van cruciaal belang voor een beter begrip van hun functie een precieze lokalisatie toewijzen aan structurele regio's van de centriolen. In dit opzicht hebben C. reinhardtii centrioles bijgedragen in beide aspecten door de eerste delimitating de verschillende structurele kenmerken langs de cilinder^9,18,19, waardoor vervolgens onderzoekers te correleren de lokalisatie van een subset van eiwitten fluorescent microscopie met een sub structurele regio. Dit omvat bijvoorbeeld de eiwitten Bld12p en Bld10p, die in de proximale regio, en in de Radslag-structuur met name lokaliseren^20,21,22,23. De lijst van substructuur gelokaliseerd eiwitten omvat ook POB15 en POC16, twee nieuwe eiwitten geïdentificeerd door massaspectrometrie die de binnenkern van de centrale regio van C. reinhardtii centrioles^{17 versieren}.

Dit witboek biedt een volledige beschrijving van de methode ontwikkeld om te isoleren en C. reinhardtii centrioles voor de daaropvolgende resolutie van de Super microscopie en single-deeltje gemiddeld beeld. Om dit te bereiken, is het belangrijk om af te bakenen de technische beperkingen die moeten worden overwonnen. Eerst, centriool zuivering kan invloed hebben op de algemene architectuur, met de structuur van de Radslag vaak verloren tijdens de verschillende stappen van isolatie⁹. Ten tweede, de afmetingen van de centriolen zijn zeer dicht bij de grens van de diffractie in optische microscopie. Inderdaad, de laterale resolutie die kan worden verkregen in confocale microscopie is ongeveer 200 nm²⁴, vergelijkbaar met de diameter van de centriolen, en de resolutie in de z-as is over 2-3 x lager, wat leidt tot een anisotrope volume. Ten derde, de heterogeniteit van antilichaam labeling en centriool oriëntatie kan beperken de interpretatie die nodig zijn voor het lokaliseren van een proteïne in een specifieke centriolar sub-regio. Tot slot bestaan centrioles in slechts twee exemplaren per cel, waardoor het moeilijk te verwerven van een groot aantal afbeeldingen en het vinden van een eenduidige centriool oriëntatie. Om te omzeilen deze technische kwesties, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op het super resolutie microscopie toe te passen op een groot aantal geïsoleerde centrioles die verschillende richtsnoeren aannemen. Eerst beschrijven we een protocol om te zuiveren van C. reinhardtii centrioles waarmee de zuivering van structureel intact centrioles en procentrioles met de Radslag. Vervolgens beschrijven we een stapsgewijze protocol te concentreren van de centrioles op coverslips voor beeldvorming door conventionele of Super-resolutie fluorescentie microscopie. Deze belangrijke stap zorgt voor toename van de centrioles beeld in meerdere richtingen. Ten slotte, beschrijven we een procedure om uit te voeren single-deeltje gemiddeld op gegevens verworven op fluorescente microscopen, dat vergemakkelijkt de opsporing van centrioles in verschillende richtingen. Over het geheel genomen kan deze methode worden toegepast op beeld centrioles van verschillende soorten of andere grote macromoleculaire verzamelingen.

Protocol

1. Media voorbereiding C. reinhardtii cultuur en centriool isolatie

1. Voorbereiding van media naar cultuur C. reinhardtii cellen
   Let op: Onderstaande stappen beschrijven de voorbereiding van stamoplossingen voor 1 x TAP (Tris-acetaat fosfaat) medium.
   1. Bereid een fosfaatbuffer (pH 7), door het mengen van 250 mL 1 M K₂HPO₄ (174.2 g K₂HPO₄ tot 1 L aangevuld met gedestilleerd water) met ~ 170 mL 1 M KH₂PO₄ (136.09 g voor KH₂PO₄ in 1 L). Aanpassen van het mengsel te bereiken pH 7.
   2. Bereid een (40 x)-oplossing door het mengen van 96.8 g van Tris, 40 mL fosfaatbuffer (pH 7) en 40 mL azijnzuur en pas de oplossing aan 1 L met gedistilleerd water.
   3. Bereiden van oplossing B (40 x) met 16 g van NH₄Cl, 2 g CaCl₂en 4 g van MgSO₄. Wees voorzichtig te ontbinden CaCl₂ in gedistilleerd water apart voordat u deze toevoegt aan de andere componenten. Pas de oplossing aan 1 L met gedistilleerd water.
   4. Hutner van sporenelementen buffer²⁵ als volgt voorbereiden.
      1. Voor 1 liter buffer, los van elke verbinding in de aangegeven hoeveelheid water: EDTA Dinatrium zout 50 g in 250 mL, ZnSO₄.7H₂O (22 g in 100 mL), H₃BO₃ (11.4 g in 200 mL), MnCl₂.4H₂O (5.06 g in 50 mL) , CoCl₂.6H₂O (1.61 g in 50 mL), CuSO₄.5H₂O (1.57 g in 50 mL), (NH₄) 6Mo₇O₂₄.4H₂O (1.10 g in 50 mL) en FeSO₄.7H₂O (4.99 g in 50 mL).
         Opmerking: EDTA moet worden opgelost in kokend water, en de FeSO₄ moet bereid zijn laatst om oxidatie te voorkomen.
      2. Alle oplossingen met uitzondering van de EDTA meng en breng aan de kook. Voeg vervolgens de EDTA, en de oplossing moet groen. Na ontbinding alles, koel de oplossing tot 70 ° C. Voeg bij deze temperatuur, 85 mL hete 20% KOH-oplossing (20 g in 100 mL). Pas de oplossing aan 1 L met gedistilleerd water op kamertemperatuur (RT).
      3. Toevoegen van een katoen-stekker aan de kolf en laat de oplossing staan voor 1 of 2 weken, schudden 1 x per dag. De oplossing moet in eerste instantie worden groen en schakel vervolgens paars, verlaten van een roest-bruin neerslag; Verwijder de neerslag met filtreerpapier totdat de oplossing duidelijk is. Bevriezen van de aliquots en opgeslagen bij-20 ° C.
   5. Bereiden 1 x TAP middellange tot C. reinhardtii cellen groeien door het mengen van de volgende onderdelen: 25 mL van oplossing A (40 x) en 25 mL van oplossing B (40 x) met 1 mL van Hutner van spoorelementen buffer²⁵en aanpassen van het mengsel tot 1 L met gedistilleerd water. Steriliseren van het mengsel met behulp van een 0.4 µm filter.
2. Media voorbereiding voor centriool zuivering
   1. Bereiden van een buffer van de deflagellation met behulp van 5 gewichtspercenten sacharose in 10 mM HEPES (pH 7) op een eindvolume van 500 mL met gedestilleerd water aangepast.
   2. Bereiden van 250 mL 0,5 M azijnzuur.
   3. Bereiden van 250 mL van een 1 M K-PIPES-stockoplossing (pH 7,2) door eerste toevoegen 50 mL H₂O te ontbinden van het PIJPEN poeder, daarna het toevoegen van 10 N KOH tot de oplossing begint te duidelijk geworden. Titreer pH 7,2 met 10 N en 1 N KOH en pas de oplossing tot een eindvolume van 250 mL met H₂O.
   4. 5 sacharose oplossingen (w/w) als volgt bereid.
      Opmerking: Alle sacharose oplossingen moeten worden gefilterd nadat solubilisatie met behulp van een 0.4 µm filter op een spuit aangesloten. Merk op dat de 60% en 70% sacharose oplossingen moeilijk zijn te solubilize en in een waterbad vooraf opgewarmd bij 60 ° C ter vergemakkelijking van de solubilisatie moeten worden geplaatst. Mix elke 10 minuten totdat de sacharose volledig is opgelost.
      1. Bereiden van 25% sucrose, Weeg 25 g van sacharose en het gewicht tot 100 g aanpassen door het toevoegen van 10 mM K-PIPES (pH 7,2).
      2. Bereiden van 60 gewichtspercenten sacharose, weeg 60 g van sacharose en aanpassen van het gewicht tot 100 g met 10 mM K-PIPES (pH 7,2).
      3. Sacharose oplossingen voorbereiden op het verloop van sacharose. Bereiden 40 gewichtspercenten sacharose door met een gewicht van 40 g van sacharose en aanpassing van de oplossing à 100 g met 10 mM K-PIPES (pH 7,2). Op dezelfde manier bereiden 50% (m/m) en 70% (w/w) sacharose.
      4. Opslaan van de oplossingen bij-20 ° C. Wees voorzichtig om resuspendeer de sacharose oplossingen goed na het ontdooien.
   5. Bereiden van 100 mL lysisbuffermengsel door mengen 1 mM HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl₂, en 1% NP-40 en houd het bij 4 ° C. Altijd bereid deze buffer vers op de dag van het experiment. Anti-protease tabletten op de dag van de centriolen isolatie toevoegen.
   6. 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) (pH 7.4) voor te bereiden door het mengen van 8 g NaCl, KCl 2 g, 1,44 g nb₂HPO₄, en 0,24 g. van KH₂PO₄ in 800 mL gedestilleerd H₂O. Adjust pH aan 7.4 met HCl. Breng het volume van het mengsel 1 L met gedistilleerd H₂O.

2. isolatie van C. reinhardtii Centrioles

Opmerking: Zie Figuur 1.

1. Cultuur en uitbreiding van C. reinhardtii cellen
   1. In de avond op dag 1, een cw15 - soort uit een stevige plaat te enten in een cultuur conische kolf met 10 mL 1 x TAP. Groeien de cellen onder wit fluorescerende lampen (60 µE/m²s) voor 2-3 dagen bij 23 ° C.
   2. Op dag 3, Verdun de cultuur 10 x (tot 100 mL) in 1 x de kraan en de cellen onder licht groeien voor 2-3 dagen bij 23 ° C.
   3. Op dag 6, Verdun de cultuur 10 x in 1 x raak aan het verkrijgen van 1 L van cultuur. Groeien de cellen onder licht bij 23 ° C, totdat de cultuur bereikt een donker groene kleur die een geschatte celdichtheid ~ 1 x 10⁷ cellen/mL²⁶ (dag 9-10 aangeeft).
2. Zuivering van C. reinhardtii centrioles
   1. Centrifugeer de cw15 - cellen bij 600 x g gedurende 10 minuten in 50 mL conische buisjes. Wassen van de pellet van cellen 1 x met 50 mL 1 x PBS en draai het bij 600 x g gedurende 10 min. resuspendeer de pellet in 100 mL kamertemperatuur deflagellation buffer met een pipet.
   2. Deflagellate van de cellen met een pH-schok door langzaam toevoegen van druppels 0,5 M azijnzuur aan een definitieve pH van 4.5-4,7 op een magneetroerder en Incubeer de cellen voor 2 min. Voeg langzaam druppels 1 N KOH om te herstellen de pH 7.0.
   3. Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 10 minuten te verwijderen elke vrijstaande flagellen. Verwijder het supernatant en opslaan van de pellet op ijs. Wassen van de pellet 2 x met 50 mL 1 x PBS precooled bij 4 ° C. Draai vervolgens, de pellet bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   4. Resuspendeer de pellet in 30 mL 1 x PBS en langzaam laden van de schorsing op een 25%-sacharose-kussen van 20 mL zonder mengen (Figuur 1B).
   5. Draaien op 600 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C tot het verwijderen van de resterende flagellen in het supernatant; de cellen liggen verspreid in de 25% sucrose (Figuur 1C). Houd alleen de onderste 20 mL (rode pijl, Figuur 1C) door zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof met behulp van een aspirator aspirating.
   6. De resterende 20 mL wassen door toevoegen van 20 mL koude 1 x PBS. Draai het monster bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 10 mL koude 1 x PBS (bij 4 ° C). Zorg ervoor dat er geen klontjes zijn, zodat de volgende lysis alle cellen in een keer raakt.
   7. Overdracht van de geresuspendeerde pellet op een nieuwe 250 mL fles. Voeg 100 mL van de lysis-buffermengsel aangevuld met 5.000 eenheden van DNase aan de cellen. Het is belangrijk de lysis-buffermengsel toevoegen aan de cellen, en niet de andere manier rond. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 4 ° C en meng dit voorzichtig door het omkeren van de fles iedere 15 minuten zonder dat zij belletjes vormen.
   8. Centrifugeer de lysed cellen bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een conische buis van 50 mL te verwijderen van het puin van een cel. Als de lysis correct is uitgevoerd, moet de cel pellet wit (Figuur 1D). De bovendrijvende vloeistof met een pipet verzamelen en het laden op een 30 mL ronde-onderkant-buis met een 60%-sacharose kussen, geplaatst op het ijs. Dan, draai de buis bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
      Opmerking: Meerdere ronde onderkant buizen (Tabel van materialen) kunnen nodig zijn, afhankelijk van het volume van het supernatans.
   9. Gecombineerd het supernatant tot 1 mL boven het kussen sacharose. Opmerking de gele interface tussen de 1 mL van het supernatans dat resterende en de 2 mL van het kussen sacharose. Meng voorzichtig de sucrose en het resterende supernatant met een gesneden P1000 tip. Doen niet vortex bij deze stap; anders, kan de procentrioles worden verloren in dit stadium. Bundelen alle sacharose kussens en sla deze op het ijs.
   10. Bereiden een 40% tot 70% sacharose verloop in een polypropyleen dunwandige 38.5 mL-buis door voorzichtig toe te voegen 3 mL 70% sucrose (bij 4 ° C), gevolgd door 3 mL 50%, en ten slotte, 3 mL van 40% sucrose. Laden van de gebundelde interfaces op het 40% tot 70% sacharose verloop; Doe dit langzaam omdat de koude sacharose zeer visceuze is. Evenwicht van de buizen met de buffer van 10 mM K-PIPES (pH 7,2) en centrifugeer ze bij 68,320 x g (bijvoorbeeldmet een SW32Ti rotor) gedurende 1 uur en 15 min bij 4 ° C.
   11. Verzamel 12 x 500 µL breuken bij 4 ° C door een gat in de onderkant van de buis met een naald van 0,8 mm zonder verstoring van de verschillende sacharose lagen. Bereiden met een gesneden P200 Pipetteer tip, extra 10 µL aliquots van elke fractie die zal worden gebruikt voor de volgende immunofluorescentie. Module-freeze de breuken in vloeibare stikstof.
       Opmerking: Geïsoleerde centrioles kunnen worden geanalyseerd door elektronenmicroscopie om ervoor te zorgen dat de totale ultrastructuur van de centrioles behouden blijft.

3. kwantificering van geïsoleerde Centrioles op Coverslips: centrifugeren en immunofluorescentie

Opmerking: Zie Figuur 2.

1. Voorbereiding van de buizen en coverslips
   1. Gebruik 1 glazen ronde onderkant buis (15 mL) per fractie aan het analyseren van de centriolar breuken (12 buizen in totaal).
   2. Zet een aangepaste dekglaasje aan steun adapter (adapter hierna genoemd) in de ronde-onderkant-buis. Plaats een steriele 12 mm dekglaasje aan in de ronde-onderkant-buis.
      Opmerking: Hier wordt gebruikt 12 mm coverslips, maar het protocol kan worden aangepast voor 18 mm coverslips met behulp van 30 ml ronde onderkant buizen.
   3. Voeg 5 ml van vooraf gekoelde 10 mM K-PIPES (pH 7,2) bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het dekglaasje aan niet zweeft en beneden op de adapter blijft. Plaats de buizen op ijs.
2. Centrifugeren van de centrioles
   1. Verdun elk 10 µL breuk met 100 µL van koude 10 mM K-PIPES (pH 7,2). Resuspendeer de verdunning goed tot de volledige verdwijning van de sucrose(Figuur 2). Laad elke verdunde breuk in een ronde-onderkant-buis.
   2. Draai de buis bij 10.000 x g gedurende 10 minuten (bijvoorbeeldmet een JS-13.1 swingende emmer rotor) bij 4 ° C.
   3. Herstellen van het dekglaasje aan door het invoegen van een handgemaakte verslaafd apparaat in het gat aanwezig in de slotted rand van de adapter en het voorzichtig omhoog.
      Nota: De handgemaakte verslaafd apparaat kan worden gemaakt met spuit-naald handmatig verslaafd en gegoten op een zelfgemaakte stok (cijfers 2B-2D).
   4. Bij het bereiken van de top van de ronde-onderkant-buis, overlappen de rand van de adapter met een gehandschoende vinger en verwijder het dekglaasje aan met een pincet. Wees voorzichtig om te onthouden welke kant van het dekglaasje aan bevat de centrioles. Ga verder met het behandelen van de coverslips voor immunofluorescentie.
3. Immunofluorescentie kleuring en beeldvorming van geïsoleerd C. reinhardtii centrioles
   Opmerking: Zie Figuur 2.
   1. Het bereiden van het materiaal voor immunofluorescentie kleuring als volgt.
      1. Voorbereiden van een cover-glas kleuring rek in een kristal polystyreen transmissie lab vak (60 mm lengte 50 mm in de breedte x 43 mm in hoogte). Vul het met 100% methanol en opslaan bij-20 ° C.
      2. Een vochtige kamer voor te bereiden. Voor dit, monteren de vochtige kamer door het plaatsen van een water-bevochtigde weefsel naast de binnenkant randen van een vierkant petrischaal(Figuur 2). Een stuk van laboratorium afdichten van omslag toevoegen (Zie Tabel van materialen) naar het midden van de petrischaal op die de antilichaam-mixen zullen worden geplaatst tijdens de procedure van de immunofluorescentie (stappen 3.3.2–3.3.3). Betrekking hebben op het deksel en de vochtige kamer met aluminiumfolie te beschermen tegen licht.
   2. Immunokleuring de geïsoleerde centrioles als volgt.
      1. Herstellen van de coverslips met de centrioles direct na het centrifugeren (stap 3.2.4) door ze aan het broeden gedurende 5 minuten in het vak gevuld met-20 ° C methanol (stap 3.3.1.1).
      2. Verwijder de coverslips met pincet en plaats hen in een transparante laboratorium vak (Zie Tabel van materialen) gevuld met 50 mL 1 x PBS en was ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Pipetteer 60 µL van primair antilichaam mix [primaire antilichamen verdund in 1% bovien serumalbumine (BSA) en 0,05% Tween-20 in PBS] op het stuk van laboratorium afdichten van omslag in de vochtige kamer. Zorgvuldig Leg de coverslips op de top van de antilichaam-mix met het centrioles recht tegenover de daling. Incubeer de coverslips voor 45 min met primaire antilichamen.
         Opmerking: De primaire antilichamen die gebruikt werden om de representatieve resultaten te genereren zijn konijn polyclonal Bld12 (1:300) en muis α-tubuline (DM1A) (1:300).
      4. Verwijder de coverslips en was ze gedurende 5 minuten in 1 x PBS, zoals beschreven in stap 3.3.2.2. Incubeer de coverslips voor 45 min met secundaire antilichamen in PBS met 1% BSA en 0,05% Tween-20.
         Opmerking: De secundaire antilichamen die gebruikt werden om de representatieve resultaten te genereren zijn geit-antimuis gekoppeld aan Alexa 488 (1:1, 000) en anti-konijn geit gekoppeld aan Alexa 568 (1:1, 000).
      5. Verwijder de coverslips en was ze gedurende 5 minuten in 1 x PBS, zoals beschreven in stap 3.3.2.2.
   3. Monteer de coverslips op een glasplaatje door toevoeging van 3 µL van montage van drager op de dia en zorgvuldig het plaatsen van de coverslips op bovenkant (centrioles geconfronteerd met het medium montage). Verzegel de rand van het dekglaasje aan met nagellak.
   4. Afbeelding van de geïsoleerde centrioles op een confocal microscoop op een 63 X olie doelstelling met een N.A. van 1.4 tijdens het toepassen van deconvolutie²⁷ (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Hier, werden de volgende instellingen gebruikt: 500 – 545 nm voor Alexa 488 en 580-635 nm voor Alexa 568.

4. concentratie van Centrioles in het midden van de Coverslips

Opmerking: Zie Figuur 3.

1. Materiële voorbereiding
   1. Bereiden van een 15 mL glazen ronde-onderkant-buis op ijs, een aangepaste dekglaasje aan steun adapter (genaamd adapter hierna .stl bestand geleverd als aanvullende bestand 1), een aangepaste concentrator (.stl bestand als aanvullende bestand 2) en 10 mM K-PIPES (pH 7.2) bij 4 ° C.
   2. Bereiden van poly-D-lysine (PDL)-gecoat coverslips. Verdun 10 x de 1 mg/mL PDL-stockoplossing met H₂O. Ten eerste was de coverslips met 70% EtOH, verwijderen de ethanol, en laat die de coverslips droog. De coverslips met PDL jas en laat ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Wassen van de coverslips 3 x met water en laat ze drogen.
      Opmerking: Jas de coverslips met PDL te verhogen van het aantal geïsoleerde centrioles gekoppeld aan de coverslips.
2. Centrifugeren
   1. Plaats een steriele 12 mm dekglaasje aan op de verzonken, onderkant van de concentrator, houden de PDL jas naar beneden. Kap het dekglaasje aan door het plaatsen van de adapter rechtstreeks op de top. Omkeren van de ronde-onderkant-buis en plaats deze over de concentrator dekglaasje aan en de adapter.
   2. Zachtjes duwen het ensemble met een pincet totdat de onderkant van de ronde-onderkant-buis wordt bereikt, en het omkeren van de buis. 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) aan de ronde-onderkant-buis toevoegen totdat het gaat naar de top van de concentrator. Zorg ervoor dat er geen bubbels in de centrale cilinder van de concentrator blijven.
   3. Zachtjes Voeg 100 µL van 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) aan één aliquot met verrijkte centriool breuk en meng grondig het volume.
   4. 100 µL van 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) verwijderen uit de holle center van de concentrator en voeg 100 µL van de verrijkte centriolar breuk in 10 mM K-PIPES buffer (pH 7,2) naar het holle midden van de concentrator, zorg dat de inhoud in het holle center blijft.
   5. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten (bijvoorbeeldmet een JS-13.1 swingende emmer rotor) in een vooraf gekoelde centrifuge bij 4 ° C.
   6. Verwijder de concentrator met een pincet.
   7. Herstellen van het dekglaasje aan door het invoegen van een handgemaakte verslaafd apparaat in het gat aanwezig in de slotted rand van de adapter en het voorzichtig omhoog. Bij het bereiken van de top van de ronde-onderkant-buis, overlappen de rand van de adapter met een gehandschoende vinger en verwijder het dekglaasje aan met een pincet. Wees voorzichtig om te onthouden welke kant van het dekglaasje aan bevatten centrioles. Ga verder met het behandelen van de coverslips voor immunofluorescentie.
      Nota: De handgemaakte verslaafd apparaat kan worden gemaakt met een naald van de spuit handmatig verslaafd en gegoten op een zelfgemaakte stok (Cijfers 2B-D).
   8. Fixatie en immunofluorescentie kleuring van geconcentreerde centrioles zoals gedaan in stap 3.3.2–3.3.4 uitvoeren.

5. single-deeltje gemiddeld

Opmerking: Zie Figuur 4.

1. Imaging voor Single-deeltje gemiddeld
   1. Monteer het dekglaasje aan op een dia met behulp van een regelmatige anti-fading montage medium. Uitvoeren van gestructureerde verlichting microscopie (2D SIM) beeldvorming met behulp van een doelstelling van de CFI Apochromat TIRF (100 X, NB 1.49, WD 0.12 mm) en een achterzijde verlicht EM CCD-camera.
      Opmerking: De Acquisitietijd werd ingesteld op 100 ms bij een camera lezen uit 3 MHz. Een 2.5 X lens werd gebruikt voor SIM-imaging.
      Opmerking: De dataset die hier gepresenteerd op een 3D-SIM Microscoop overgenomen (Zie Tabel van materialen).
   2. Beeld de centrioles door de overname van een grote stapel van beelden, bestaande uit de totale centriool signaal, door het opzetten van de positie van het boven- en onderkant van de Z-stack hierboven en hieronder de centriolen signaal, respectievelijk. Ga naar de stack te projecteren en single-deeltje gemiddeld per stap 5.2 en 5.3.
2. Projectie van een stapel
   1. Open de afbeeldingsstapel met ImageJ. Klik dan op '→ afbeeldingsstapels → Z Project'. De projectie type instellen alsMax intensiteit'.
   2. De afbeelding omkeren door te klikken op 'bewerken → omkeren'. Opslaan van de projectie die wordt gegenereerd (.tif formaat).
3. Single-deeltje uitlijning met Scipion
   1. Maak een nieuw project in Scipion door te drukken op de rode 'Maak Project' knop aan de bovenkant van de pagina. Op het linker paneel, dubbel-klik op 'invoer → importeren microfoto'.
   2. Vul de 'bestanden directory' en 'patroon ' velden volgens de gegevensmap en namen. Houd de standaardparameters. Klik op 'Uitvoeren'.
   3. Dubbelklik op 'Deeltjes → Picking → xmipp3 - handleiding (stap 1) plukken'. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input microfoto' en selecteer de geïmporteerde microfoto uit stap 5.3.1. Klik op 'Uitvoeren'.
   4. In de nieuw geopende venster, selecteer deeltjes in de verschillende microfoto door te klikken op hen. Wanneer u klaar bent met elke opname, klik op de rode knop '+ coördineert'.
   5. Dubbelklik op 'Deeltjes → Extract → xmipp3 - extract deeltjes'. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input coördinaten' en selecteer de geplukte coördinaten uit stap 5.3.4. Vul het 'Vak deeltjesgrootte (px)' afhankelijk van de afmetingen van de deeltjes. Stel in het tabblad 'Preprocess' stofverwijdering: geen (het kan leiden tot artefacten); Omkeren van contrast: geen (zwarte deeltjes, witte achtergrond); Fase spiegelen: Nee (gelinkt aan CTF correctie); Normaliseren: Ja.
   6. Klik op 'Uitvoeren'. Wanneer het werk wordt gedaan, Controleer de uitgepakte deeltjes door het selectievakje in van de baan (grenzen worden dikker) en klik op 'analyseren resultaten (linksonder in het hoofdmenu).
   7. Dubbelklik op '2D → → xmipp3 uitlijnen - uitlijnen met cl2d'. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input deeltjes' en selecteer de uitgepakte deeltjes uit stap 5.3.5. Gebruik geen een referentiebeeld. Klik op 'Uitvoeren'.
   8. Dubbelklik op ' 2D → uitlijnen → meer → xmipp3 - uitlijning van toepassing 2d'. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input deeltjes' en selecteer de uitgelijnde deeltjes uit stap 5.3.7.
   9. Klik op 'Uitvoeren' zoals in stap 5.3.6. De resultaten kunnen worden gecontroleerd door te klikken op 'Analyseren resultaten' na de selectie van de doos van de baan.
   10. Dubbelklik op 'Deeltjes → masker → xmipp3 - 2d masker toepassen'.
   11. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input deeltjes' en selecteer de uitgelijnde deeltjes uit stap 5.3.9. De 'Masker bron' is ingesteld op 'Geometrie'. Vervolgens stelt u de parameters van het masker als masker type: circulaire; Straal (px): op zoek naar één deeltje (een centriool) zonder dat er iets omheen, klik op de 'toverstaf ' icon aan de linkerkant die opent een venster om te helpen bij het vinden van de perfecte waarde; Shift Center: Nee (als het particle is perfect gecentreerd) of Ja (als het particle is verschoven); De verschuiving van de X-centrum: volgens het deeltje standpunt; De verschuiving van de Y-centrum: volgens de positie van de particle. Klik op 'Uitvoeren'.
   12. Gebruik de knop ' resultaten analyseren ' om te controleren als het masker wordt toegepast. Als dat niet het geval is, klik met de rechtermuisknop op de baan 'Toepassen maskeren 2d' en selecteer 'Bewerken'. Het wijzigen van de parameters van het masker (grootte en/of verschuivingen) en looppas het opnieuw met de 'Uitvoeren' knop.
   13. Dubbelklik op '2D → Classify → xmipp3 - cl2d'.
   14. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input deeltjes' en selecteer de gemaskerde deeltjes uit stap 5.3.11. Het aantal lessen moet verkrijgen van ongeveer 50 deeltjes per klas. Klik op 'Uitvoeren'.
   15. Het resultaat controleren door te klikken op de knop ' analyseren resultaten ' . In het geopende venster, klik op het oogpictogram rechts naast "Wat te tonen" .
   16. Het nieuwe venster kunt de inspectie van de gegenereerde klassen door 'Classes2D' in het menu 'Blok' te selecteren. Controleer de inhoud van elke klasse door 'Class00N_Particles' in hetzelfde menu te selecteren. Inspecteer elke klasse om te identificeren welke enige slechte deeltjes bevatten. Ga terug naar de 'Classes2D' -weergave en selecteer de klassen met goede deeltjes door te klikken op elk. Het is mogelijk om te selecteren van de verschillende klassen door het bijhouden van de 'Ctrl' -toets ingedrukt tijdens de selectie.
   17. Als u alle klassen met goede deeltjes hebt geselecteerd, klik op '+ deeltjes' een subset maken met deze deeltjes.
   18. In hetzelfde venster, selecteer een aantal sets van klassen die verschillende oriëntaties van de deeltjes vertegenwoordigen. Een nieuwe subset maken door te klikken op '+ gemiddelden'.
   19. Voor elke geaardheid/gemiddelde geselecteerd, gaat u als volgt.
       1. Dubbelklik op '2D → → xmipp3 uitlijnen - uitlijnen met cl2d'.
       2. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input deeltjes' en selecteer de goede deeltjes uit stap 5.3.17. 'Gebruik een referentiebeeld' ingesteld op 'Ja'. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'referentiebeeld' en klik op de witte pijl links aan het project 'Maak deelverzameling' uit stap 5.3.18 en selecteert u de afbeelding om het te gebruiken als referentie. Dubbelklik op een object te openen in een afzonderlijk venster en controleer welk object is. Klik op 'Uitvoeren'.
       3. Dubbelklik op ' 2D → uitlijnen → meer → xmipp3 - uitlijning van toepassing 2d'. Klik op het vergrootglaspictogram dicht bij het veld 'Input deeltjes' en selecteer de uitgelijnde deeltjes uit stap 5.3.19.2.
       4. Klik op 'Uitvoeren'.
       5. Het resultaat van de uitlijning controleren ('Analyseren van resultaten); het zal tonen de uitgelijnde deeltjes en het gemiddelde van deze deeltjes.
       6. Als het gemiddelde is goed, maar de deeltjes zijn alle gericht op dezelfde manier, de gemiddelde opslaan door te klikken op ' Advanced → ImageJ' en sla de afbeelding op met ImageJ.
       7. Als het gemiddelde kan worden verbeterd, selecteert u alle goed georiënteerde beelden en maken van een nieuwe subset met de knop '+ deeltjes' . Herhaal stappen 5.3.19.1–5.3.19.4 totdat de subset wordt schoongemaakt (alle slechte deeltjes verwijderd). Elke keer dat de uitlijning wordt uitgevoerd (stap 5.3.19.2), de verwijzing is ingesteld op de laatste gegenereerde gemiddelde (vanaf iteratie aan iteratie, de verhogingen van de gemiddelde kwaliteit).

Resultaten

C. reinhardtii centriool isolatie:
Om te isoleren van de centrioles, cw15- C. reinhardtii cellen werden gekweekt in vloeibare cultuur voor enkele dagen onder licht en vervolgens Ingehuld door centrifugeren op 600 x g voor 10 min. Pelleted cellen werden 1 x met PBS gewassen en geresuspendeerde in een deflagellation buffer voorafgaand aan deflagellation door het uitvoeren van een schok van de pH met behulp van 0.5 M azijnzuur aan een definitieve pH van 4.5-4.7 gedurende 2 minuten(Figuur 1). Een toevoeging van 1 N KOH werd gebruikt om te herstellen pH 7.0. Om te scheiden vrijstaande flagellen van cel organen, werden deflagellated cellen eerst gecentrifugeerd om te verwijderen van het grootste deel van de flagellen. De pellet was dan 2 x met PBS gewassen en geresuspendeerde in 30 mL PBS voorafgaand aan langzaam laden op een 25%-sacharose kussen (Figuur 1B). De buis was gesponnen op 600 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C tot het verwijderen van de meeste van de vrijstaande flagellen. Na het centrifugeren, de cel organen werden verspreid in het kussen van sacharose (Figuur 1C) en hersteld door het verwijderen van de ongeveer 30 mL van het supernatans (tot de rode pijl in Figuur 1C). De resulterende 20 mL van de gewassen cellen werden vervolgens geresuspendeerde 20 ml koude PBS en gecentrifugeerd bij 600 x g gedurende 10 minuten. Vervolgens het supernatant werd verworpen, en werden volledig geresuspendeerde de cellen in 10 mL PBS. De cellen werden overgedragen aan een fles van 250 mL en de lysis buffer is toegevoegd aan de geresuspendeerde cellen tegelijk. DNase werd toegevoegd aan de lysis en uitgebroed gedurende 1 uur bij 4 ° C. Na een centrifugeren-stap voor verwijderen cel puin (Zie de witte pellet in Figuur 1D), het supernatant was verzameld en zorgvuldig geladen op een kussen 60%-sacharose 2 mL vóór centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Merk op dat voor 100 mL lysis, 8 buizen 15 ml werden gebruikt voor het uitvoeren van deze stap, overeenkomt met 12,5 mL lysis-buffermengsel geladen op 2 mL van sacharose per buis. Na het centrifugeren, de meeste van de bovendrijvende substantie werd verwijderd tot 1 mL boven het kussen. De 1 mL van het supernatans dat resterende was dan verzameld met de 2 mL-kussen en vervolgens gemengd en gebundeld om op te halen een eindvolume van 24 mL. Het zwembad was vervolgens geladen op een 40% - 50%-, 70%-sacharose kleurovergang en gesponnen bij 68,320 x g gedurende 1 uur en 15 min bij 4 ° C. Ten slotte, de geïsoleerde centrioles werden verzameld door een gat in het onderste gedeelte van het centrifugeren buis met behulp van een naald en de druppels werden verzameld in 12 x 500 µL breuken. De daling gevormd als gevolg van de hoge dichtheid van de verschillende sacharose, heel langzaam aan het begin (70% sucrose), en vervolgens meer snel (40% sucrose).

Immunofluorescentie van geïsoleerde Centrioles
Om te beoordelen van de kwaliteit van de isolatie-procedure, was 10 µL van elke verzamelde kleurovergang breuk vervolgens gecentrifugeerd op een dekglaasje aan met behulp van een dekglaasje aan steun adapter (figuur 2A-2D). Nog belangrijker is, u kunt veilig verwijderen van het dekglaasje aan, een aangepaste verslaafd apparaat was ontworpen (Figuur 2B). De coverslips werden vervolgens geanalyseerd door immunofluorescentie. Antistoffen tegen CrSAS-6(Bld12p) gewend waren in deze studie wijzen op de aanwezigheid van de Radslag structuur en α-tubuline (DMA1) wil de centriolar muur. Door het aantal centrioles die positief voor zowel CrSAS-6 en α-tubuline per gezichtsveld waren tellen en vervolgens het berekenen van het totale aantal centrioles per breuken, bleek het mogelijk om te bepalen welke fracties werden verrijkt voor geïsoleerde centrioles ( Figuur 2F-2 H). Interessant, werden 6 breuken verrijkt voor centrioles (figuur 2F en 2 G, breuken #1-6), met een piek voor Fractie #3, terwijl de laatste breuken niet waren, die aangeeft dat de zuivering gewerkt. Merk op dat in dit bijzonder experiment, 95% van de totale centrioles positief voor CrSAS-6 en α-tubuline in fractie #3 waren. Dit geeft aan dat de meest geïsoleerde centrioles hun cartwheels behouden. Als geen verrijking van centrioles wordt waargenomen in de eerste breuken, de procedure van de isolatie werkte niet en moet worden herhaald. Merk op dat sommige flagellar stukken meestal in de breuken verstoken van centrioles kunnen worden waargenomen.

Vervolgens voor het berekenen van het totale aantal centrioles per µL, moet het aantal centriool per gezichtsveld worden vermenigvuldigd met de verhouding als aangegeven in Figuur 2H. Het resulterende getal moet vervolgens worden gedeeld door het volume van de breuk gebruikt voor de immunofluorescentie om het aantal centrioles per µL te verkrijgen. In deze procedure bepaalde isolatie bevatte de meest verrijkt breuk ongeveer 37 centrioles voor een oppervlakte van 0.00846 mm² (met een gezichtsveld van 92 x 92 µm²). Het oppervlak van de buis sectie was 7.5 mm straal met een totale oppervlakte van 176 mm². De overeenkomstige verhouding was toen 176/0.00846 = 20,803.8, dus een totaal van 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8) in 10 µL. Daarom was het aantal centrioles in 1 µL 76,974.

Concentratie van geïsoleerde Centrioles op Coverslips:
Verhoging van het aantal centrioles per veld verhoogt de kans op ondubbelzinnige centriool oriëntatie opsporen, evenals het verhogen de kans op het opsporen van soortgelijke richtsnoeren die kunnen worden gebruikt voor verdere deeltje gemiddeld procedures. Als centrioles van de geconcentreerde breuken zijn nog steeds schaars op het dekglaasje aan, ontwikkelden we een centrifugeren accessoire te concentreren in het midden van het dekglaasje aan (Figuur 3A) een concentrator met de naam centrioles. Merk op dat een .stl bestand met de nauwkeurige metingen voor 3D-printen is voorzien van dit manuscript.

Ten eerste, een dekglaasje aan van 12 mm was gemonteerd op de concentrator (Figuur 3B). De adapter was geplaatst op de top van het dekglaasje aan was de ronde-onderkant-buis en omgekeerd geplaatst over de geassembleerde adapter en de concentrator. De ronde onderkant-buis werd vervolgens voorzichtig omgekeerd, waardoor het laden van het monster (Protocol stap 4.2). De centrioles werden vervolgens gecentrifugeerd bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Daarna werden de centrioles onderworpen aan immunofluorescentie en gekleurd voor CrSAS-6/Bld12p en α-tubuline (Figuur 3 c-3E). Belangrijker, werden ongeveer 30 centrioles zonder concentrator beschouwd per gezichtsveld (Figuur 3C), terwijl de 183 centrioles per gezichtsveld werden gezien toen de concentrator gebruikt (figuur 3D-3F). Merk op dat de centrioles bedekt alleen een schijf van 4 mm diameter in het midden van het dekglaasje aan. Dit resultaat toont aan dat de concentratie stap werkt en een 6-fold verrijking van centrioles in een bepaalde regio van de coverslips kunt, dus versoepeling van hun detectie en beeldvorming.

TL Single-deeltje gemiddeld van geïsoleerde C. reinhardtii Centrioles:
Hier, met behulp van SIM-microscopie, die oplopen een resolutie van ongeveer 120 tot kan nm, centrioles gebeitst voor monoglutamylated tubuline (GT335, Figuur 4), een tubuline wijziging in centriolar microtubuli, aanwezig waren verbeelde²⁴. C. reinhardtii centrioles zijn ongeveer 500 nm lang, altijd in paren, en vaak gevonden met bijbehorende, nieuw gedupliceerd probasal organen (hierna aangeduid als procentrioles hierna) en Locustella microtubulus-geassocieerde vezels¹⁹. Daarom was deze eindmontage ongeveer 1 µm groot. Om deze reden, en om het beeld van de centrioles in hun geheel, is het raadzaam het verwerven van een Z-stack op de geïsoleerde centrioles.

Hier, na de overname, is een uiteindelijke afbeelding gegenereerd door het uitvoeren van een projectie van maximale intensiteit met behulp van ImageJ²⁸ (beeld/stapels/Z project/max intensiteit projectie, Figuur 4B). Dergelijke beelden, een analyse van de single-deeltje cryo-Elektron microscopie softwarematig werd uitgevoerd zodat de klassen van centrioles met gelijkaardig oriëntaties en dan gemiddeld werd uitgevoerd. Om dit te doen, was de kleur van de afbeelding eerst omgekeerd zodat de objecten (Figuur 4C) beter te visualiseren. Centrioles werden handmatig geplukt in een vak gecentreerd over elk deeltje met behulp van de vrij beschikbare Scipion software²⁹ die verschillende elektronenmicroscopie software programma's zoals Xmipp3 integreert (Figuur 4D). Merk op dat de grootte van de doos moet worden gedefinieerd door de gebruiker. Hier, dozen van 50 x 50 pixels voor een pixelgrootte van 31.84 nm werden gebruikt. Vervolgens alle deeltjes werden uitgepakt (Figuur 4E) en uitgelijnd met Xmipp3 (Figuur 4F). Vervolgens werd een cirkelvormig masker van 12 pixels in straal toegepast om te isoleren elke centriool uit de centriolar-pair (Figuur 4G). De deeltjes werden vervolgens ingedeeld, aan de hand van Xmipp3, voor het genereren van verschillende gemiddelden. Alleen werden homogene klasse gemiddelden bewaard, wat betekent dat de deeltjes die van de gemiddelden van de klasse afwijken werden handmatig uitgesloten. Deze stap werd herhaald om het genereren van een bijna perfecte gemiddelde voor elke gekozen koers. Na vijf iteraties, twee klassen van gemiddelden werden gegenereerd: een bovenaanzicht van 63 objecten (Figuur 4H) en een kant uitzicht vanaf 98 deeltjes (Figuur 4ik) van monoglutamylated centrioles. De afmetingen van het object werden bepaald door het meten van de afstand tussen de pieken van de intensiteit perceel profiel langs het monoglutamylation signaal.

Nog belangrijker is, is de lengte van het zijaanzicht klasse gemiddelde 260 nm met een diameter van 250 nm, vergelijkbaar met de gemeten monoglutamylated tubuline signaal dat bleek te lokaliseren in een regio van 286 ± 33 nm lengte binnen de kern van de centriolen¹⁷.

Figuur 1 : Zuivering van C. reinhardtii centrioles. (A) Dit is een schematische weergave van elke stap die leidt tot de isolatie van C. reinhardtii centrioles. Het omvat representatieve stappen van het protocol (B) vóór en (C) na het centrifugeren op het verloop van de 25%-sacharose. De rode pijl in deelvenster C geeft de minimumgrootte voor het volume te houden na het centrifugeren. (D) dit paneel toont de witte pellet lysed cellen na het centrifugeren. De zwarte pijl geeft de pellet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figuur 2 : Centrifugeren set-up om te voeren immunofluorescentie op geïsoleerde centrioles. (A) 10 µL van elke verzamelde breuk wordt eerst verdund in 100 µL van 10 mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Dit is een schematische weergave van de apparaten van centrifugeren, omvat een tube van 15 mL ronde onderkant, een dekglaasje aan van 12 mm, een adapter voor het dekglaasje aan, en een op maat gemaakte verslaafd apparaat herstellen het dekglaasje aan na het centrifugeren. Panelen C en D tonen tekeningen waarin wordt uitgelegd hoe te herstellen van het dekglaasje aan na het centrifugeren. (C) plaats de verslaafd tool in het gat in de slotted rand van de adapter aanwezig en (D) trekken zachtjes. (E) Dit zijn beelden van de vochtige kamer moest uitvoeren immunofluorescentie imaging. De pijl geeft de 12 mm dekglaasje aan. (F) Dit zijn representatieve confocal beelden op 63 X (zoom 2) voor kleurovergang breuken #1-8, verzameld tijdens de procedure zuivering en gekleurd voor CrSAS-6 (rood) en α-tubuline (groen). De inzetstukken komen overeen met de regio aangegeven met een wit vakje in de lagere vergroting weergaven. Schaal bar = 10 µm. (G) Dit is een grafiek die het aantal centrioles positief voor zowel CrSAS-6 en α-tubuline per gezichtsveld in elke fractie vertegenwoordigt. Opmerking de verrijking in breuken #1-6. Het gemiddelde aantal centrioles per veld in elke fractie: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17,0, #4 = 23.3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = 13.7 ± 9.3, #7 = 2.7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0.0, #9 = 1,0 ± 0.0, #10 = 0,0 ± 0.0, #11 = 0.3 ± 0,6, #12 = 0,0 ± 0.0. Voor elke fractie, werden 3 willekeurige velden beeld. Merk op dat, toen de meest verrijkt breuk #3 tellen, we vonden dat 95% van de centrioles positief voor CrSAS-6 en α-tubuline zijn (n = 205 centrioles). (H) A verhouding van het aantal centrioles aanwezig op het gemeten gebied van de microfoto wordt gebruikt voor het berekenen van het totale aantal centrioles aanwezig op het gebied van de buis. Het nummer van de centriolen per µL kan worden berekend uit de 10 µL oorspronkelijk gecentrifugeerd breuken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figuur 3 : Geïsoleerde centrioles worden gecentrifugeerd met behulp van concentrators. (A) dit paneel toont het centrifugeren apparaten nodig om zich te concentreren op centrioles op coverslips vóór immunofluorescentie, met inbegrip van een tube van 15 mL ronde onderkant, een concentrator, een dekglaasje aan van 12 mm en een steun adapter apparaat. (B) dit paneel toont de stappen voor het monteren van het centrifugeren apparaat. Panelen C-E Toon confocal beelden van centrioles gekleurd voor CrSAS-6 (rood) en α-tubuline (groen) (C) zonder of (D-E) met de concentrator. De inzetstukken komen overeen met de regio aangegeven met een wit vakje in de lagere vergroting weergaven. De bar van de schaal is 10 µm. opmerking dat centrioles in het midden van het dekglaasje aan (de stippellijn geeft de rand van de geconcentreerd gebied) zijn verrijkt. (F) deze grafiek vertegenwoordigt het aantal centrioles per gezichtsveld zonder en met de concentrator. Vijf willekeurige gezichtsveld werden geanalyseerd. Het gemiddelde aantal centrioles is, zonder concentrator, 29.8 ± 2,9, en met de concentrator, 182.6 ± 11,5, P < 0,0001. De statistische significantie werd beoordeeld door een ongepaard t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Single-deeltje gemiddeld op geïsoleerde C. reinhardtii centrioles. (A) dit paneel toont Z stapel beelden van centrioles gekleurd met GT335 en verkregen met behulp van een Microscoop SIM. (B) deze panelen tonen een maximale intensiteit Z projectie van de gestapelde afbeeldingen. Schaal bar = 1 µm. (C) de Toon van deze panelen een representatief beeld met een omgekeerde contrast. De inzet vertegenwoordigt een zoom-in de centrioles beter te visualiseren. (D) deze panelen Toon deeltje plukken. De inzet wordt aangegeven hoe de deeltjes werden geplukt. (E) Dit zijn voorbeelden van 5 geëxtraheerd deeltjes. (F) dit paneel toont de deeltjes na uitlijning. (G) dit paneel toont de deeltjes na het toepassen van een masker. Panelen H en ik Toon twee klasse gemiddelden: (H) een top uitzicht (63 deeltjes) enikeen zijaanzicht (98 deeltjes). De dubbele pijlen geven aan dat de afmetingen van het GT335 signaal. Schaal bar = 250 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Aanvullende bestand 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende bestand 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Een van de uitdagingen in de biologie is het ontcijferen van de precieze lokalisatie van eiwitten in een architecturale context. De centriolen is een ideale structuur deze methoden, toe te passen als de architectuur is onderzocht met behulp van cryo-Elektronentomografie, onthullen interessante ultrastructurele kenmerken langs de lengte. Dankzij zijn afmetingen dicht bij de grens van de resolutie in de optische microscopie is het echter moeilijk te lokaliseren precies een eiwit door immunofluorescentie aan een structurele subregio van de centriolen met behulp van conventionele microscopen³⁰.

De resolutie in de optische microscopie wordt beperkt door de diffractie van licht dat, ongeveer, een laterale maximumresolutie van 200 geeft nm in optische microscopie²⁴. Echter, deze limiet in optische microscopie omzeild door een van de belangrijke doorbraken van de laatste 20 jaar is geweest: de uitvinding van super resolutie methoden. Deze aanpak kunnen beeld buiten de grenzen van de diffractie bij verschillende resoluties: 120 nm voor SIM, ongeveer 50 nm voor gestimuleerde emissie uitputting (STED) en 20-40 nm voor single-molecuul lokalisatie microscopie (SMLM)²⁴. Met deze nieuwe ontwikkelingen van super resolutie microscopie zijn de structurele subregio's van de centriolen haalbaar. In de praktijk is het echter nog steeds moeilijk om nauwkeurig de lokalisatie van een proteïne aan een structureel element voor de belangrijkste reden dat de volwassen centrioles bestaan in slechts 2 exemplaren per cel en willekeurige oriëntaties, waardoor de interpretatie van lokalisatie moeilijk. Om deze reden een protocol opgericht waarmee onderzoekers om het imago door super resolutie een groot aantal centrioles, verhoging van de kans om te observeren niet-dubbelzinnig oriëntaties. Nog belangrijker is, aangezien deze methode is gebaseerd op het gebruik van geïsoleerde centrioles, wij bieden een methode om te zuiveren intact C. reinhardtii centrioles die volwassen centrioles en procentrioles bevatten.

Tot slot, als gevolg van het aantal centriool oriëntaties die image kan worden gemaakt met dit protocol, single-deeltje analyse kan worden toegepast met behulp van elektronenmicroscopie software. Dit resulteert in de generatie van de gemiddelde klassen van centrioles in een bepaalde richting. Nog belangrijker is, kunnen deze resulterende 2D-afbeeldingen vervolgens worden gebruikt ter beoordeling van de lokalisatie van een specifieke proteïne langs de centriolen. Inderdaad, deze methode kan worden toegepast op dual-kleuren Super resolutiebeelden en één kleur kan worden gebruikt om te onthullen de centriolen skelet (bv, tubuline), terwijl de andere kleur kan worden toegeschreven aan een specifieke centriolar eiwit. Door af te trekken de gemiddelden verkregen met één kleur of twee kleuren, wordt het gemakkelijker om te registreren een eiwit langs de centriolen (proximale, centraal of DISTAAL). Merk op dat de twee kanalen nauwkeurig moeten worden afgestemd om te voorkomen dat een misleidend interpretaties. Bovendien zal de gemiddelden van top uitzicht helpen ontcijferen als een eiwit binnen de centriolar lumen, langs de muur van de microtubuli, of buiten de centriolen lokaliseert.

Deze methode heeft het voordeel om na te gaan van de lokalisatie van specifieke proteïnen die moeilijk te lokaliseren anders vanwege de heterogene labeling. Merk op dat andere methoden om de kaart van eiwitten in de centrioles zijn beschreven in oereenstemming 3-D SIM/SMLM met, bijvoorbeeld, beoordeling van de specifieke richtsnoeren voor de centrioles door de bepaling van de elliptische Profiel van een marker vormen een torus rond de Centriool door SIM imaging. Met behulp van deze parameter, is het mogelijk om te lokaliseren van eiwit met een nauwkeurigheid van 4 – 5 nm³⁰. Merk ook op dat de beschreven methode maakt hier gebruik van geïsoleerde centrioles met intact procentrioles, een teken dat de centriolen architectuur is het meest waarschijnlijk grotendeels behouden. Echter, we kunnen niet uitsluiten dat sommige architectonische stijlkenmerken zijn gestoord tijdens het zuiveringsproces ongehinderd, zoals de centriolen diameter variëren met de concentratie van divalente kationen zoals versterkt met de isolatie van de menselijke centrosoom⁵.

Een van de essentiële stappen van het hier gepresenteerde protocol is het verkrijgen van voldoende geconcentreerde geïsoleerde centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor Fluo-SPA. Om dit te doen, moet u eerst de zuiverheid en de efficiëntie van de centriolen isolatie procedure zorgen. Een lage concentratie van geïsoleerde centrioles wordt voorkomen dat juiste beeldvorming en verdere beeldverwerking. Voor dit doel bieden wij een methode om te verrijken het aantal centrioles per gezichtsveld. Afhankelijk van het aantal centrioles in de Fractie gebruikt, moet het volume in de concentrator geladen worden aangepast, met een maximaal volume van 250 µL.

Nog belangrijker is, is deze methode is ontwikkeld voor een celwand minus cw15-C. reinhardtii cellen. In deze stam zorgt de kwetsbaarheid van de celwand voor een juiste lysis van de cellen en dus de bevrijding van de inhoud ervan. Dit protocol is niet efficiënt voor wild-type C. reinhardtii cellen, zoals de celwand een goede lysis voorkomt. Alternatieve strategieën, zoals ultrasoonapparaat of een pre-incubatie van de cellen met autolysin, een enzym dat de celwand³¹, kunt degraderen zou moeten worden ingevoerd om te wijzigen de celwand voorafgaand aan toepassing van het protocol van de isolatie die hier gepresenteerd.

Deze set-up kan worden gebruikt met verschillende soorten microscopen, variërend van conventionele confocal microscopen tot hoge doorvoer gewijd super resolutie microscopen. Bij het doen van SMLM, een speciale buffer is vereist voor correcte beeldvorming en dus een kamer voor een 12 mm dekglaasje aan met de buffer op de top van het dekglaasje aan aangepast moet worden gebruikt. Verdere beeldvorming worden uitgevoerd met omgekeerde microscopen. Als de set-up van de Microscoop niet mogelijk is een 12 mm dekglaasje aan, kan het protocol hier gepresenteerd worden toegepast op 18 mm coverslips met een ronde bodem tube van 30 mL en een gemodificeerde adapter en concentrator. Het is ook belangrijk om de opmerking dat de kwaliteit van de laatste wederopbouw in SMLM zal afhangen van de kwaliteit van de kleuring en van het primaire antilichaam gebruikt, evenals de methode van fixatie.

Kortom bieden wij een methode die kan worden toegepast op de afbeelding talrijke centrioles gevolgd door Fluo-SPA die zal genereren gemiddelden van centrioles in verschillende richtingen, waardoor centriolar eiwit met precisie te lokaliseren. Nog belangrijker is, kan deze methode meer in het algemeen worden toegepast naar geïsoleerde centrioles van andere diersoorten, aan andere organellen of te grote macromoleculaire verzamelingen. Tot slot het monster voorbereiding aanpak hier gepresenteerd, gecombineerd met de recente ontwikkeling van de algoritme voor single-deeltje analyse van fluorescerende SMLM gegevens³², kon openen verdere verbetering in de moleculaire cartografie van grote macromoleculaire assembly's.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Muis monoklonaal anti-apha tubulin (clone DM1A)	Abcam	ab7291	verdunning 1:300
DNaseI	Roche	10104159001
12 mm dekglasjes	Roth	YX03.1
18 mm dekglasjes	Roth	LH23.1
K2HPO4	Fluka	60355
KH2PO4	Fluka	60230
Tris base	Biosolve Chimie SARL	0020092391BS
azijnzuur	Carlo Erba Reagents	524520
NH4Cl	Sigma	A-4514
CaCl2	Sigma	C-7902
MgSO4	Sigma	63140-500G-F
steritop filter	Millipore	SCGPT05RE
sucrose	Sigma	S7903-1KG
HEPES	AppliChem PanReac	A3724,0250
PIPES	Sigma	P6757-500G
MgCl2	ACROS ORGANICS	197530010
NP-40	AppliChem PanReac	A1694,0250
Rondbodem (Kimble) buizen 15 mL	Fisherscientific	09-500-34
Rondbodem (Kimble) buizen 30 mL	Fisherscientific	09-500-37
dekglas staining rack	Thomas scientific	8542E40
kristal polystyreen transmissie lab box	FISHERS	11712944
Methanol	VWR	20864.32
BSA	Roche	10735086001
Triton X100	Roth	3051.3
geit anti-muis gekoppeld aan Alexa 488	invitrogen	A11029	verdunning 1:1.000
geit anti-konijn gekoppeld aan Alexa 568	invitrogen	A11036	verdunning 1:1.000
inbedmedium	abcam	ab188804
Buis, dunwand polypropyleen	Beckman Coulter	326823
Poly-D-Lysine 1 mg/mL	SIGMA	A-003-E
Muis monoklonaal anti-Polyglutamylering modificatie mAb (GT335)	Adipogen	AG-20B-0020	verdunning 1:1.000
glycerol inbedmedium met DAPI en DABCO	Abcam	ab188804
50 mL conische buizen	Falcon	14-432-22
Eppendorf 5810R centrifuge	Eppendorf	5811000622
Beckman JS-13.1 zwenkbeugel rotor	Beckman Coulter	346963
Beckman SW 32Ti rotor	Beckman Coulter	369694
parafilm	Bemis	13-374-10
Leica TCS SP8 met Hyvolution mode	Leica
OSRAM L18W/954 LUMILUX	Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman filterpapier	Sigma	WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 antilichaam			verdunning 1:300 (Hamel et al., 2014)
Scipion	http://scipion.i2pc.es/
EM CCD camera (Andor iXON DU897)	Andor