Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

Samenvatting

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.

Samenvatting

Het immuunsysteem is een essentieel onderdeel van een gezond hart. Het myocardium is herbergt een rijke bevolking van verschillende immuun cel subsets met functionele brandcompartimentering zowel tijdens steady-state en tijdens verschillende vormen van ontsteking. Tot voor kort, de studie van immuuncellen in het hart vereist het gebruik van microscopie of slecht ontwikkelde spijsvertering-protocollen, die geboden van voldoende gevoeligheid tijdens ernstige ontsteking maar konden vertrouwen identificeren kleine — maar belangrijke — populaties van cellen tijdens steady-state. Hier bespreken we een eenvoudige methode combineren enzymatische (collagenase, hyaluronidase en DNAse) en mechanische vertering van lymfkliertest harten voorafgegaan door intravasculaire administratie van fluorescently-gelabelde antilichamen tegen kleine onderscheiden maar onvermijdelijke intravasculaire cel contaminanten. Deze methode genereert een suspensie van geïsoleerde levensvatbare cellen die kunnen worden geanalyseerd door stroom cytometry voor identificatie, fenotypering en kwantificering, of verder gezuiverd met fluorescentie-geactiveerde cel sorteren of magnetische kraal scheiding voor transcriptionele analyse of in vitro studies. Wij zijn een voorbeeld van een stapsgewijze flow cytometrische analyse om te onderscheiden van de belangrijkste macrophage en dendritische cel populaties van het hart. Voor een middelgrote formaat experiment (10 harten) vereist de voltooiing van de procedure 2 – 3 h.

Inleiding

Verschillende vormen van myocardiale stress of schade, met inbegrip van ischemische (ischemie-reperfusie of myocardinfarct) en niet-ischemische (hypertensie of myocarditis), bevordering van de rekrutering van ontstekingscellen met herstellend en beschermend, maar ook pathogene eigenschappen. Al in 1891, beschreven Romberg eerst de aanwezigheid van cellulaire infiltreert in het myocardium van patiënten geïnfecteerd met tyfus en roodvonk¹. De gedetailleerde studie van immuun hartcellen vereist echter de ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van de immunophenotyping. Dientengevolge, zijn pas onlangs we begonnen te begrijpen dat een diverse bevolking van immune cellen met essentiële onderhoud rollen tijdens steady-state zich binnen het myocardium bevindt.

Histologie is geweest, en nog steeds is, de meest voorkomende methode te karakteriseren immuun hartcellen tijdens ontsteking. Terwijl histologie een waardevolle diagnostisch hulpmiddel vertegenwoordigt, heeft het gebruik ervan in de studie van immuun hartcellen echter belangrijke beperkingen. De immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium vertegenwoordigen een zeer klein percentage van het totaal aantal cellen en zijn min of meer gelijkmatig verdeeld in een proportioneel immense ruimte. Ook Toon verschillende vormen van cardiale ontsteking, zoals virale myocarditis, focal patronen van ontsteking. Dit betekent dat de nauwkeurige analyse van het immuunsysteem van het hart vaak hogere graden van de histologische bemonstering, verhoging van de kosten te verminderen van bias vereisen. Histologie biedt bovendien een zeer beperkte hoeveelheid bruikbare informatie in cel identificatie (bijvoorbeeld aantal parameters). Met een steeds groeiend aantal cel subsets kunt weergeven die het gebruik van meerdere expressie markers vereisen (met inbegrip van oppervlakte markeringen, transcriptiefactoren of secreted moleculen), heeft stroom cytometry zich gevestigd als de meest krachtige tool voor immunophenotyping, Als gevolg van lage kosten en hoge gegevensdoorvoer.

Het gebruik van immunophenotyping technieken is sterk afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte spijsvertering protocollen dat is toegestaan voor single-cellen analyse van grote aantallen cellen. De ontwikkeling van uitputtende protocollen van de extractie van de cel opende een nieuw venster van mogelijkheden in de studie van cardiale immunologie. Door de combinatie van de spijsvertering en stroom cytometry transcriptomics zijn de grote bevolking van macrofagen en dendritische cellen die woonachtig zijn in het hart gekarakteriseerd^2,3. De overvloedigste bevolking van immuun hartcellen tijdens steady-state zijn CD64⁺⁺ MerTK macrofagen, die kunnen verder worden onderverdeeld op basis van hun uitdrukking voor CCR2 of CD11c². CCR2⁺ macrofagen zijn afkomstig uit beenmerg volwassen Haematopoiese, overwegende dat de meerderheid van CCR2^- -macrofagen, dat hoge of lage niveaus van MHC-II uitdrukken kunnen, zijn hoofdzakelijk van prenatale oorsprong. Macrofagen belangrijke taken uitvoeren zoals reparatie⁴ en verwijdering van puin⁵ tijdens blessure of ondersteunende elektrische connectiviteit⁶ in stabiele toestand. Tijdens verschillende vormen van ontstekingen een belangrijke toevloed van Ly6C^hi MHC-II^lo CD64^int monocyten optreden, die later differentiëren in Ly6C^Hallo CCR2⁺ macrofagen^2,7 . Een aanzienlijk kleiner, maar belangrijke bevolking van cellen die woonachtig zijn in het myocardium van gezonde individuen is samengesteld uit dendritische cellen^8,9. De twee belangrijke subsets van cardiale conventionele DCs (cDCs) hebben onlangs gekenmerkt: cDC1 (CD103⁺ DCs) en cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs spelen een belangrijke rol in de verdediging tegen infectie⁸ maar kunnen ook bevorderen zelfverwonding tijdens ontsteking, met name tijdens een myocardinfarct⁹.

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van levensvatbare immuun hartcellen van muis myocard. De methode combineert enzymatische en mechanische spijsvertering met een cel-zeef filtratie met het oog op een interne celsuspensie dat kan worden geanalyseerd, of verder gezuiverd is, wat door de stroom cytometry sorteren of magnetische kraal verrijking. Nauwkeurige metingen van extravascular myocardcellen vereisen cardiale perfusie om het verwijderen van eventuele verontreinigingen uit de bloedbaan van de cardiale microvasculature. Daarnaast presenteren wij een optionele stap van intravasculaire labeling van immune cellen die kunnen worden gebruikt om te onderscheiden verder myocardcellen van intravasculaire contaminanten, gebaseerd op de Galkina et al. protocol¹⁰. Tot slot presenteren we een fundamentele stroom cytometry analyse ter identificatie van de grote macrophage en cDC subpopulaties.

Protocol

Ethische verklaring: dit protocol is herzien en goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op het University Health Network (Toronto, Canada) en is in overeenstemming met de Canadese Raad op Animal Care.

1. buffer voorbereiding

1. HBB buffer (Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 0,2% bovien serumalbumine) voor te bereiden. Voeg toe 10 mL van warmte geïnactiveerd runderserum en 1 g bovien serumalbumine aan 500 mL HBSS. Filter steriliseren door een 0,2 µm filter en bewaren bij 4 ° C.
2. Bereiden van FACS buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA, pH 8,0)). Voeg toe 10 mL warmte geïnactiveerd runderserum en 1 mL van de EDTA 0.5 M tot 500 mL PBS. Filter steriliseren door een 0,2 µm filter en bewaren bij 4 ° C.
   Opmerking: Oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.

2. etikettering van circulerende leukocyten

1. Aseptisch bereiden anti-muis CD45 injectie met 1 microgram van antilichaam verdund in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een definitieve geïnjecteerde volume van 200 µL/muis. Volume in een 28.5G insuline spuit laden en blijf uit de buurt van licht.
   Opmerking: Gebruik twee verschillende fluorescerende-gelabelde anti-CD45 antilichamen om te onderscheiden van het intravasculaire (gekleurd door i.v. toediening) van de intracardiac kleuring (gekleurd na vertering; Zie stap 4).
2. Vooraf warm muizen (8-12 weken oud) door de staart aan een rode warmte lamp voor 5 min bloot te leggen.
   Let op: Niet oververhit raakt het dier. Houd van de lamp op een veilige afstand (> 30 cm).
   1. Beperken van het dier in de sternale positie met behulp van een geschikte inrichting. Bloot en stabiliseer de staart met de niet-dominante hand door immobilizing de basis van de staart met de index- en middelvinger en de medio-distale regio van de staart met de duim en de ringvinger.
      Let op: Geldt niet te veel kracht op het puntje van de staart, als de huid kan worden getrokken uit. Plaats de naald met de schuine kant naar boven in de ader. Houd de naald evenwijdig aan de ader te allen tijde als het is gemakkelijk om het doorprikken van de ader.
      Opmerking: Bloed invoeren van de injectiespuit kan optreden en is een teken van een goede injectie. Buigen de naald onder een hoek van 90° kan vergemakkelijken i.v. toediening. Bevestigen met uw veiligheid kantoor zoals buigende naalden kunnen een gevaar vormen.
   2. 200 µL intraveneus injecteren in de ader van de staart. De vloeistof moet gemakkelijk stromen en schakelt u tijdelijk de ader.
      Let op: Forceer niet vloeistof in als weerstand wordt voldaan. Dit is een teken van omdat van de naald.
   3. Het toestaan van antilichaam circuleren gedurende 5 minuten voordat het humaan euthanizing muis.

3. hart isoleren en spijsvertering

1. Euthanaseren van muizen met behulp van CO₂ of door andere institutioneel aanvaarde euthanasie procedure.
   1. Voor CO₂ euthanasie, plaatst u de muisaanwijzer in de CO₂ -kamer en het tarief van de opvulling ingesteld op 20% van het volume van de kamer per minuut (dat wil zeggen, als de kamer 10 L, opvulling op 2 L/min is). Een looptijd van 2 min en monitor muis totdat ademhaling heeft opgehouden.
   2. Uitschakeling van de CO-₂ en laat de muis voor een extra 1-2 min. zorgen ademhaling heeft opgehouden alvorens de kamer te openen en uitvoeren van een teen snuifje om te bevestigen dat de muis is dood voordat wij overgaan tot het verwerken van de muis.
2. Spray de muis met 70% ethanol. Til de huid op de buik en ontleden de muis door te snijden langs het begin van de ventral midline op het niveau van de heupen tot het borstbeen. Open de buik en de lever om bloot van het middenrif te verplaatsen.
3. Snijd het middenrif en de ribben aan weerszijden van de middellijn, voorzichtig om te voorkomen dat het prikken van de longen en het hart.
   1. Expose het hart door peeling toen de ribben, snijd eerst de linker atria gevolgd door de juiste atria.
      Let op: Wees voorzichtig bij het snijden van de atria, ervoor te zorgen dat geen slagaders of aders zijn gewond, aangezien dit de efficiëntie van het spoelen van het bloed opgenomen in de organen kan verminderen.
   2. Perfuse het hart met 15-20 mL koude PBS met een 60 mL injectiespuit met een naald 21 G uitgerust en koude PBS. Zachtjes begrijpen van de basis van het hart met een tang en plaats de naald in het linkerventrikel in de buurt van de top. Herhaal de procedure in het rechterventrikel. Een correcte injectie resulteert in witte longen en bleke lever.
      Opmerking: Perfusie moet worden uitgevoerd binnen 5 minuten na euthanasie om te voorkomen dat bloed coagulatie, die de organen van belang met het circulerende cellen kan besmetten.
4. Houd de basis van het hart met een tang en zachtjes het hart optrekken, dan loskoppelen van het hart door het snijden van de grote pulmonary slagaders en aders, aorta en de pericardvocht zak.
   1. Reinig het hart door het hart tussen de duim en de wijsvinger zachtjes te houden in een schone stofvrije papieren handdoek en trek de atria en de overblijfselen van de grote slagaders en aders en eventuele andere verontreinigingen met een tang.
      Opmerking: Zorg ervoor het geheel van de atria wordt verwijderd en geen andere weefsels, zoals de longen of de bloedvaten, als deze weefsels hun eigen resident immune cellen hebben aanwezig zijn. De Long heeft met name een grote immuun cel bevolking die de kleinere bevolking van die binnen het myocardium maskeren kan.
5. Plaats het hart in een 5 cm kunststof schotel met 50 µL van koude PBS.
   1. Blad voor het hart met gebogen ontleden schaar totdat er geen zichtbare deeltjes en het heeft een gladde consistentie.
      Opmerking: Probeer te houden het hart op een beperkt gebied van de schotel tijdens het hakken om te minimaliseren van verlies van weefsel.
   2. Overdracht thetrituratedheart weefsel met gebogen pincet in 2 mL microcentrifuge buis met 800 µL koude Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM).
6. Toevoegen van 450 U/mL ofcollagenase ik 60 U/mL hyaluronidase type I-S en 60 U/mL DNase-I bij elk monster.
   1. Incubeer monsters bij 37 ° C op een rockende shaker 50 rpm voor 45 – 60 min.
7. Na de vertering, kort vortex monsters (20 s) en onmiddellijk plaats op ijs te houden van de monsters bij 4 ° C.
   1. Met behulp van een pipet 1 mL, Pipetteer monsters op en neer totdat weefselsteekproeven homogeen zijn en niet het uiteinde van de pipet verstoppen doen.
      Opmerking: Vaststelling van een bepaald aantal keren naar Pipetteer reproduceerbaarheid kan verhogen. Als de harten zijn niet optimaal verteerd, kunnen stukken van myocard belemmeren de pipet. Voorzichtig slijpen de pipet tip tegen de microcentrifuge buis zal helpen Meng grotere stukken van weefsel.
8. Natte vooraf een 40 µm cel zeef geplaatst op een conische buis van 50 mL met 1 mL koude HBB.
   1. Gehomogeniseerde monster toevoegen aan de filter en wassen via door het langzaam stromende 12 – 14 mL koude HBB.
   2. Gefilterde monsters overbrengen in een conische buis van gelabelde 15 mL en houden bij 4 ° C.
9. Centrifugeer steekproeven bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd uit supernatant.
   1. Lyse rode bloedcellen door toevoeging van 1 mL lysis-buffermengsel van Ammonium-Chloride-kalium (ACK) aan elk monster. Resuspendeer monsters door vortexing en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   2. Zodra lysis heeft voltooid, voeg 5 – 8 mL van koude Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) om te stoppen met hemolyse.
10. Centrifugeer steekproeven op 400 x Gvoor 5 min bij 4 ° C. Gecombineerd uit supernatant.
11. Voeg 1 mL FACS buffer toe aan elk monster tot een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis.
    Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier voor maximaal 2 uur met monsters opgeslagen bij 4 ° C.

4. Stroom Cytometry kleuring en analyse

1. Centrifugeer steekproeven bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
   1. Verklein de niet-specifieke antilichaam-bindende en Verdun 1:100 anti-CD16/CD32 en monocyt Blocker (1:20) (Zie Tabel van materialen) boekhouding voor 50 µL FACS per monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   2. De administratieve verwerking van antilichaam, verdunning (1:250 voor elke antilichaam) van 50 µL van FACS per monster te bereiden.
      Opmerking: Een levensvatbaarheid kleurstof kan worden opgenomen in het antilichaam cocktail om uit te sluiten van de dode cellen. Als alternatief, kleine grootte uitsluiting door flow analyse kan worden gebruikt (Figuur 1C en D).
   3. Zonder wassen, voeg 50 µL van antilichaam master mix aan elk monster en meng.
   4. Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
2. 600 µL FACS toevoegen aan elk monster te wassen en centrifugeren van de monsters bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
3. Gecombineerd uit supernatant en resuspendeer de pellet in 300 µL FACS. Houd de monsters bij 4 ° C in het donker.
   Opmerking: Sommige levensvatbaarheid kleurstoffen, zoals DAPI, vereisen binnen 10 min voordat u stroom cytometry kleuring.
4. Analyseren door stroom cytometry (Zie figuren 1 en 2) binnen de volgende 3 h. Als een langere tijd is vereist, op korte termijn fixatie met behulp van een lage concentratie paraformaldehyde (0,5 – 1% in PBS) wordt aanbevolen voor het behoud van de kleuring.
   Opmerking: Het is sterk aanbevolen om het filteren van monsters door een zeef cel 40 µm vóór starten stroom cytometry analyse ter voorkoming van obstructie van de fluidics van de cytometer van de stroom.

Resultaten

Tot op heden is geen goede methode ontwikkeld om te isoleren van immune cellen van andere cardiale celbestanddelen, zoals cardiomyocytes. Analyse van de cardiale eencellige schorsing door stroom cytometry heeft dus een vooraf gating met CD45 om te identificeren van de immuun cel populaties, gevolgd door eencellige en klein uitsluiting gating (Figuur 1A). Anderzijds kan een levensvatbaarheid kleuring worden uitgevoerd als u wilt uitsluiten van...

Discussie

Myocardiale ontsteking of myocarditis, is een functie van meest cardiovasculaire ziekten. Het myocardium is echter niet gespeend van eigen immuunsysteem componenten in niet-ziekte staten. Tijdens steady-state, vele immune cellen bevinden zich in het myocardium en spelen de essentiële rol van onderhoud en bescherming. De karakterisering van deze verschillende populaties van cellen zou niet mogelijk zijn geweest zonder methoden zoals gepresenteerd in dit protocol.

Een combinatie van mechanische ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) PrecisionGlide-naald	BD	305167
Hank’s gebalanceerde zoutoplossing	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Rund serum albumine	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Rund serum	Sigma	B9433
0,5 M Ethyleendiaminetetraazijnzuur	BioShop	EDT111
Vacuumfilter, 0,2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulinesyringe	BD	329424
60 mL-spuit	BD	309653
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM met 4,5 g/L glucose en L-Glutamine en Natrium Pyruvaat
Collagenase I	Sigma	C0130	van Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	van rundpancreas
Celzeef, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Kalium (ACK) lysebuffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-muis/mens CD11b	Biolegend	101222	1:250 verdunning
APC/Cy7 anti-muis Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 verdunning
APC anti-muis CD103	Biolegend	121414	1:250 verdunning
Brilliant Violet 605 anti-muis CD11c	Biolegend	117334	1:250 verdunning
PE anti-muis Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 verdunning
Pacific Blue anti-muis I-Ab	Biolegend	116422	1:250 verdunning
FITC anti-muis CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 verdunning
PE/Cy7 anti-muis CD45	Biolegend	103113	1:250 verdunning
PerCP/Cy5.5 anti-muis CD45	Biolegend	103132	1:40 verdunning
TruStain fcX (anti-muis CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 verdunning
True-Stain Monocyt Blocker	Biolegend	426101	1:20 verdunning
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Muis: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755