Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een High-performance Liquid Chromatography-meting van Kynurenine en Kynurenic zuur: Biochemie voor cognitie en slaap in ratten

10.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58129

⸱

19 augustus 2018

 ,  ,  , 
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Wijzigingen in de kynurenine traject (KP) neuroactive metabolieten zijn betrokken bij de psychiatrische ziekten. Onderzoek naar de functionele uitkomsten van een gewijzigde kynurenine traject metabolisme in vivo bij knaagdieren kan helpen nieuwe therapeutische benaderingen toelichten. Het huidige protocol combineert biochemische en gedragsmatige benaderingen voor het onderzoek naar de gevolgen van een acute kynurenine uitdaging bij ratten.

Samenvatting

De kynurenine traject (KP) van de afbraak van tryptofaan heeft betrokken bij psychiatrische stoornissen. In het bijzonder de Astrocyt afkomstige metaboliet kynurenic zuur (KYNA), een antagonist bij beide N-methyl-d-aspartaat (NMDA) en α7 nicotinerge acetylcholine (α7nACh) receptoren, heeft betrokken bij cognitieve processen bij gezondheid en ziekte. Als KYNA niveaus zijn verhoogde in de hersenen van patiënten met schizofrenie, wordt een storing bij de glutamaterge en cholinerge receptoren verondersteld om het causaal verband kunnen houden met cognitieve dysfunctie, een domein van de kern van de psychopathologie van de ziekte. KYNA kan een pathophysiologically belangrijke rol bij personen met schizofrenie. Het is mogelijk om te verheffen van endogene KYNA in de knaagdier hersenen door de behandeling van dieren met de directe bioprecursor kynurenine en preklinische studies bij ratten hebben aangetoond dat acute waterstand in KYNA mogelijk van invloed op hun processen voor leren en geheugen. Het huidige protocol beschrijft deze experimentele aanpak in detail en combineert een) een biochemische analyse van bloedspiegels kynurenine en hersenen KYNA vorming (met behulp van krachtige vloeibare chromatografie), b) gedrags testen om de sonde de hippocampal-afhankelijke contextuele geheugen (passieve vermijden paradigma), en c) een evaluatie van het slaap-waak gedrag [telemetrische opnamen combineren electroencephalogram (EEG) en electromyogram (EMG) signalen] bij ratten. Tezamen, een relatie tussen verhoogde KYNA, slaap en cognitie wordt bestudeerd, en dit protocol beschrijft in detail een experimentele aanpak voor het begrip van de functie resultaten van kynurenine hoogte en KYNA vorming in vivo bij ratten. Resultaten die zijn verkregen door middel van variaties van dit protocol zal het testen van de hypothese dat de KP en KYNA dienen een cruciale rol bij het moduleren van de slaap en cognitie in gezondheid en ziekte staten.

Inleiding

De KP is verantwoordelijk voor bijna 95% van het essentiële aminozuur tryptofaan1vernederende. In de hersenen van zoogdieren, wordt kynurenine astrocyten rekening gemetaboliseerd in de neuroactive klein molecuul KYNA voornamelijk door het enzym kynurenine aminotransferase (KAT) II2. KYNA fungeert als een antagonist op NMDA en de α7nACh-receptoren in de hersenen2,3,4, en ook doelstellingen signalering receptoren met inbegrip van de aryl koolwaterstof receptor (AHR) en het G-eiwit gekoppelde receptor 35 (GPR35)5 ,6. Bij proefdieren, is waterstand in hersenen KYNA gebleken dat schade kunnen toebrengen aan hun cognitieve prestaties in een array van gedrags assays2,7,8,9,10 . Een opkomende hypothese suggereert dat KYNA een integrale rol bij het moduleren van cognitieve functies door de invloed van slaap-waak gedrag11 speelt, dus verder ter ondersteuning van de rol van Astrocyt-afgeleide moleculen bij het moduleren van de neurobiologie van slaap en cognitie12.

Klinisch, waterstand in KYNA gevonden in cerebrospinaal vocht en Postmortem hersenweefsel van patiënten met schizofrenie13,14,15,16, een invaliderende psychiatrische stoornis gekenmerkt door cognitieve beperkingen. Patiënten met schizofrenie worden ook vaak geplaagd door slaapstoornissen die de ziekte17 verergeren kunnen. Het begrip van de rol van KP metabolisme en KYNA bij het moduleren van een relatie tussen slaap en cognitie, met name tussen leren en geheugen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van deze slechte resultaten in schizofrenie en andere psychiatrische ziekten.

Een betrouwbare en consistente methode voor het meten van KP metabolieten is belangrijk om ervoor te zorgen dat het onderzoek die uit verschillende instellingen kan worden geïntegreerd in het wetenschappelijk begrip van KP biologie. Op dit moment beschrijven we de methode voor het meten van kynurenine in rat plasma en KYNA in de rat hersenen door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Het huidige protocol, dat maakt gebruik van een fluorimetrische detectie in aanwezigheid van Zn2 +, werd eerst ontwikkeld door Shibata18 en meer onlangs aangepast en geoptimaliseerd voor het derivatize met 500 mM zink acetaat als het na kolom reagens, waardoor het opsporen van endogene, nanomolar hoeveelheid KYNA in de hersenen-11.

Om te stimuleren de productie van DOVO endogene KYNA zoals beschreven in het huidige protocol, de directe bioprecursor kynurenine intraperitoneally wordt geïnjecteerd (i.p.) bij ratten. In combinatie met biochemische analyses om te bepalen van de mate van KYNA productie, de gevolgen van een kynurenine uitdaging op het hippocampal-afhankelijke geheugen (passieve vermijden paradigma) en het slaap-waak-architectuur (EEG en EMG signalen) is ook onderzochte11. Een combinatie van deze technieken zorgt voor de studie van de biochemische en functionele gevolgen van een kynurenine uitdaging in vivo bij ratten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Onze experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Maryland institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité en volgde de National Institutes of Health Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.

Opmerking: Volwassen mannelijke Wistar ratten (250 – 350 g) werden gebruikt in alle experimenten. Aparte cohorten van dieren werden gebruikt voor de biochemische analyse, gedrags experimenten en slaap-waak opnames. De dieren werden gehuisvest in een temperatuurgevoelig faciliteit bij de Maryland psychiatrische Research Center. Ze werden gehouden op een 12/12 h licht-donker cyclus, met lichten op op zeitgeber moment (ZT) 0 en lichten uit bij ZT 12. De dieren ontvangen ad libitum toegang tot voedsel en water tijdens de experimenten. De faciliteit is volledig geaccrediteerd door de American Association voor de accreditatie van Laboratory Animal Care.

1. intraperitoneaal Kynurenine toediening aan ratten

Opmerking: In dit protocol kynurenine werd toegediend op ZT 0 (het begin van de lichte fase) en weefsel werd verzameld bij ZT 2 en ZT 4 om te bepalen van een tijdsverloop voor het kynurenine metabolisme. Saline-geïnjecteerd dieren werden gebruikt als een besturingselement. Bijvoorbeeld, als een rat 500 g weegt en de gewenste dosering 100 mg/kg is, ontvangt de rat een injectie 5 mL van een 10 mg/mL oplossing van kynurenine.

  1. Weeg L-kynurenine sulfaat ("kynurenine") en plaats het in een glazen flesje van 20 mL. Zorg ervoor dat de kynurenine op ijs houd te allen tijde.
  2. Het toevoegen van zout voor het bereiken van de gewenste concentratie en breng de pH op 7.6 met behulp 1 N van natriumhydroxide (NaOH). Vortex en bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing totdat de kynurenine volledig heeft opgelost.
    Let op: Volg alle voorzorgsmaatregelen op aanbeveling tijdens het verwerken van NaOH.
    1. Bijvoorbeeld, om te bereiken van een oplossing van 10 mg/mL, weeg 200 mg kynurenine en plaats het in een glazen ampul. Voeg toe 15 mL zoutoplossing en vortex en bewerk ultrasone trillingen ten (20 kHz voor 5-10 s, 1/8 duim diameter microtip) te ontbinden. Met behulp van NaOH, breng de pH van de oplossing. Tot slot, zoutoplossing gebruiken voor verstellen naar de volume tot 20 mL.
  3. Elke experimentele rat wegen en berekenen van het volume van elke injectie op basis van lichaamsgewicht van de dieren en de gewenste behandeling dosis. Zorgvuldig verwijderen van het dier uit zijn kooi, injecteren van de oplossing intraperitoneally en het dier terug naar haar kooi.

2. Kynurenine metingen met behulp van krachtige vloeibare chromatografie

  1. Weefsel collectie
    Opmerking: In dit protocol kynurenine werd toegediend op ZT 0 (het begin van de lichte fase) en weefsel werd verzameld bij ZT 2 en ZT 4 om te bepalen van een tijdsverloop voor het kynurenine metabolisme. Saline-geïnjecteerd dieren werden gebruikt als een besturingselement.
    1. Gebruik van kooldioxide om te euthanaseren van het dier. Na afloop van de tekens van de ademhaling voor 1 min, voeren een secundaire euthanasie-methode door onthoofding.
    2. Het verzamelen van bloed van de hele stam, plaats een wegwerp trechter in een tube van 15 mL met 20 μL van K3-EDTA (0,5 M). Toestaan dat het bloed uit het lichaam afgevoerd in de buis. De buis herhaaldelijk om ervoor te zorgen dat het EDTA is gemengd in de gehele omkeren.
    3. Met behulp van schaar, sneed de huid op de bovenkant van het hoofd naar beneden de middellijn aan het blootstellen van de schedel. Verwijder alle overtollige nek spier op de achterkant van de schedel, en bij de opening voor het ruggenmerg, het doorsnijden van de schedel van achterkant naar voorkant.
      1. Trek voorzichtig aan de twee zijkanten van de schedel open voor het blootstellen van de hersenen, en verwijder daarna voorzichtig de hersenen met een tang om niet te beschadigen. Verwijder de bulbus bollen met een scheermesje en snijd van de hersenen in de helft van de middellijn. Met behulp van Tang, het ontleden van de hemibrain in regio's van belang (dat wil zeggen, de hippocampus en de cortex).
    4. Leg alle ontleed hersenen stukjes op aluminiumfolie op droog ijs. Nadat het weefsel volledig bevroren heeft, het overbrengen van een plastic flesje van 20 mL en opslaan bij-80 ° C.
    5. Centrifugeer het bloed van de hele stam aan 300 x g voor 10 min. Verwijder de bovendrijvende substantie (plasma) en breng dit in de nieuwe centrifuge buizen vóór ze op te slaan bij-80 ° C.
  2. Bereiding van de monsters
    1. Plasma: verzameld uit de behandelde dieren
      1. Ontdooi de bevroren buis met plasma (zie stap 2.1 voor de collectie van weefsel) op nat ijs.
      2. Verdun het monster met ultrazuiver water (1:2 voor kynurenine, 1:10 voor KYNA) in een nieuwe centrifugebuis. Toevoegen aan 100 μl van het verdunde monster, 25 μL van 6% perchloorzuur.
        Let op: Volg alle voorzorgsmaatregelen op aanbeveling tijdens het verwerken van perchloorzuur.
      3. Vortex alle monsters, vervolgens Centrifugeer ze bij 12.000 x g gedurende 10 minuten. Zodra gebeëindigd, verwijder 100 μL van de bovendrijvende substantie (uit elke buis) en plaats hen in een kleine 0,25 mL microcentrifuge buis voor de kynurenine of KYNA vastberadenheid.
    2. Hersenen: verzameld uit de behandelde dieren
      1. Buizen met bevroren hersenen monsters (zie stap 2.1 voor de collectie van weefsel) plaats op droog ijs. Afzonderlijk wegen elk monster hersenen op een precieze analytische balans. Terug te sturen naar de buis en plaats deze terug op droog ijs.
      2. Nadat alle monsters werden afgewogen, verplaatst u de buizen op nat ijs. Elk monster 1:10 verdunnen w/v met ultrazuiver water en meng ze met behulp van een ultrasoonapparaat (20 kHz voor 5-10 s, 1/8 duim diameter microtip). Bijvoorbeeld voor 100 mg van hersenweefsel, voeg 900 l ultrazuiver water.
      3. Aliquot 100 μl van elk verdund proef tot een nieuwe koker en breng het met 25 μL van 25% perchloorzuur. Vortex, vervolgens het Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten.
      4. Na het centrifugeren, 100 μL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen en plaats het in kleine 0,25 mL microcentrifuge buizen voor de KYNA bepaling.
  3. HPLC set-up en run
    1. 50 mM natrium acetaat mobiele fase voor te bereiden. Los 6.81 g natrium acetaat Trihydraat in 1 L ultrazuiver water. Breng de pH op 6.2 met behulp van ijsazijn en dan vacuüm het filtreer in schoon glaswerk. De natrium acetaat mobiele fase overbrengen in een schone fles 1 L.
    2. Het bereiden van 500 mM zink acetaat. Los 54.88 g zink acetaat in 500 mL ultrazuiver water, dan vacuüm filteren. Overbrengen naar een schoon 500 mL glazen fles. Vul een 1 L fles met ultrazuiver water en een fles van 500 mL met HPLC rang acetonitril.
    3. Plaats de buis van de inname van de HPLC-machine afzonderlijk in de mobiele fase, de ultrapure water, en de 100%-acetonitril. Pomp de zink acetaat oplossing afzonderlijk door een peristaltische pomp die met de mobiele fase na kolom en voorafgaand aan de bewerking combineert.
    4. Via het bedieningspaneel op de machine, het programma voor stormloop acetonitril van 5% en 95% ultrazuiver water op 0,5 mL/min. laten lopen voor 20-30 min te bereiken van een stabiele druk en basislijn.
    5. Bij de vaststelling van een stabiel basislijn, omzetten in de samenstelling van de oplossing acetonitril van 5% en 95% natrium acetaat mobiele fase. Equilibreer gedurende 30 min.
    6. De lamp in de fluorescentiedetector inschakelen en laat ze om op te warmen.
    7. In de tussentijd, laat ook inschakelen de na kolom pomp met een debiet van 0,1 mL/min. het bereiken van een stabiele druk van ongeveer 500 psi na ongeveer 20 min.
    8. De normen voor te bereiden.
      1. KYNA, begint met een 1 mM stamoplossing en Verdun het om voor te bereiden 5 standaard concentraties (d.w.z., 10 nM 5 nM 2,5 nM, 1 nM, en 500 pM).
        Opmerking: Dit zal een standaard curve variërend van 200 fmoles tot 10 fmoles per 20 μL injectie produceren.
      2. Kynurenine, begint met een 1 mM stamoplossing en Verdun het om voor te bereiden 5 standaard concentraties (d.w.z.10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM en 500 nM).
        Opmerking: Dit zal een standaard curve variërend van 200 pmoles tot 10 pmoles per 20 μL injectie produceren.
    9. De HPLC-systeemsoftware voor de controle van de steekproef reeks parameters en zorgen voor de autoinjections van meerdere monsters opgezet.
      1. Wanneer op het "Run Sample"-scherm, klik op "Bestand" en sleep naar beneden naar "Nieuwe Sample Set maken". Wanneer het nieuwe venster wordt geopend, selecteert u 'Leeg'. Individueel een lijst van alle normen (zie stap 2.3.8) of monsters in de volgorde waarin die ze moeten worden uitgevoerd.
      2. Wijzen de normen en de monsters in de kolom "Functie". De normen moeten worden bepaald aan het begin en einde van de reeks. Injecteren van water tussen elke 5 monsters.
      3. De bewerkingstijd voor elk monster ingesteld op 15 min. injecteren 20 μL van het monster van de normen en de voorbereiding van plasma of injecteren van 30 μL van het monster van de hersenen homogenaat voorbereiding.
      4. De excitatie en emissie golflengten (afhankelijk van de stof wordt beoordeeld) instellen voor kynurenine aan excitatie: 365 nm, emissie: 480 nm, en retentietijd: ~ 6 min, en voor KYNA aan excitatie: 344 nm, emissie: 398 nm, en retentietijd: ~ 11 min.
      5. Zodra alle parameters zijn ingesteld en de machine heeft geëquilibreerd, de volgorde worden uitgevoerd.
      6. Als u wilt de gegevens kwantificeren, navigeer aan het scherm van de "Bladeren Project". Onder het tabblad 'Sample Sets' Dubbelklik op het monster ingesteld worden gekwantificeerd. Uit de lijst met alle injecties, Markeer alle normen en met de rechtermuisknop op. Selecteer "Proces" in het nieuwe venster, en gebruik het drop-down menu om te selecteren "Kalibreren en kwantificeren" naast "Hoe":.
      7. Markeer alle normen opnieuw, klik met de rechtermuisknop en selecteer "Review". Wanneer chromatogrammen opent, gebruik de knoppen aan de bovenkant om te "Integreren" en dan "kalibreren" elke norm; Dit maakt automatisch de standaard curve.
      8. Terug naar het tabblad "Sample Sets" en dubbelklik op de set van de steekproef. Markeer vervolgens alle normen. Herhaal het proces hierboven vermeld, maar in plaats daarvan, "Quantitate" in het drop-down menu te selecteren. Markeer alle monsters weer, vervolgens met de rechtermuisknop op en selecteer "Review". Wanneer chromatogrammen opent, gebruikt u de knoppen aan de bovenkant te "Integreren" en vervolgens "Kwantificeren" elk monster.
        Opmerking: Dit zal de concentratie van elk monster gebaseerd op de eerder gemaakte standaard curve output.

3. passief vermijden paradigma

Opmerking: Deze gedrags experimenten werden ontworpen op basis van onze biochemische bevindingen met de acute kynurenine uitdaging. Maximaliseren van een toename van de hersenen KYNA, werd kynurenine (100 mg/kg) toegediend op ZT 0, 2 h voorafgaand aan de training in het paradigma van de passieve vermijden hippocampal-gemedieerde leren, die plaatsvond op ZT 2 testen. Het apparaat bestaat uit 2 even grote compartimenten (21.3 cm hoog, 20,3 cm breed en 15.9 cm diep) gescheiden door een guillotine deur en deel uitmaakt van een geluidsdichte doos. De twee compartimenten van het testen apparaat worden hierna aangeduid als "light side" en "dark side". De muren van de lichte kant zijn duidelijk, en tijdens de proeven, een lampje zal oplichten om verdere verlichten dit compartiment. De muren van het donkere compartiment vallen volledig te handhaven van de voorwaarde van een black-out.

  1. Dag 1: opleiding proces
    1. Voorafgaand aan het testen, reinig het apparaat met 70% ethanol.
    2. Brengen de dieren naar de testen kamer.
    3. Voorzichtig plaats de proefdieren in de lichte kant van het apparaat en sluit en grendel van de deur van het apparaat en de geluiddichte vak.
    4. Met behulp van de bijbehorende software, om het proces te beginnen. Selecteer in het beginscherm "File" en vervolgens "Open sessie" uit het drop-down menu. In het nieuwe venster, zorg ervoor dat de juiste procedure en apparaten zijn ingeschakeld en klik op "Sluiten". Vervolgens uitgezocht "Configureren" en vervolgens "Signalen". In het nieuwe venster, selecteer het juiste apparaat en klik op "Issue".
      Opmerking: De software zal het initiëren van een licht in de lichte kant van het apparaat inschakelen en open de deur van de guillotine tussen de twee compartimenten. Een timer zal worden ingeleid.
    5. Wanneer het dier volledig de donkere kant van de apparatuur, de guillotine deur wil sluiten, en een onontkoombare voet schok invoert (0,56 mA voor 1 s) zal worden geleverd.
    6. Record de tijdsperiode die is verstreken voordat het dier het donkere compartiment ingevoerd.
    7. Nadat het dier de schok ontvangen heeft, toestaan 30 s van hersteltijd voordat u het dier uit het apparaat verwijdert.
    8. Plaats het dier terug in zijn kooi.
    9. Voordat u begint het proces met het volgende dier, veeg het apparaat schoon met een vochtige handdoek en de afzet van elke fecale pellets.
    10. Nadat alle dieren zijn opgeleid, kunt u ze terug naar het dier faciliteit.
  2. Dag 2: testen proces
    1. Terugbrengen dieren in de test kamer 24 h na de opleiding proces. Het testende proces voor het eerste dier beginnen door het plaatsen van het in de lichte kant van het apparaat, sluiten en de deur en de geluiddichte vak arrêtering.
    2. Starten van het testende proces met behulp van de opdrachten voor dezelfde software als de vorige dag; het lampje zal oplichten in de lichte kant van het apparaat en de guillotine deur tussen de twee compartimenten opent. Een timer zal worden ingeleid.
    3. Wanneer het dier in het donker compartiment, wordt de guillotine deur gesloten. Record de tijd verstreken.
      Opmerking: Het proces zal worden beëindigd via de software na een maximum van 300 s als het dier aan de lichte kant van de test apparatuur blijft.
    4. Plaats het dier terug in hun kooi en reinig het apparaat (zoals beschreven in stap 3.1.9) voordat u begint het proces met het volgende dier.

4. slaap analyse

  1. Chirurgische implantatie van een Analoger Funksender EEG/EMG
    Opmerking: De telemetrische zenders moeten worden gesteriliseerd en bereid voorafgaand aan de operatie.
    1. Gebruik een scheermesje, zachtjes verwijderen een kleine lengte van de plastic coating te onthullen dat de draad leidt. Plaats de zenders in een conische tube van 50 mL, gevuld met het steriliseren van de oplossing [bvWavecide (2,65% Glutaaraldehyde)].
      1. Laat de zenders in de desinfecterende oplossing voor ten minste 12 uur. Vervolgens, voorafgaand aan de operatie, breng de oplossing over in een afval container. Spoel de zender met een steriele zoutoplossing.
    2. Op de dag van de operatie, weeg het dier vóór de plaatsing ervan in een zaal van de verdoving. 3 – 5% Isofluraan met 100% O2induceren.
    3. Na een succesvolle anesthesie, verwijderen van het dier en zorgvuldig scheren, met behulp van een elektrisch scheerapparaat, de top van het hoofd en de nek, en een klein stukje haar op de achterkant van het lichaam, net iets links en onder de ribbenkast.
    4. Carprofen (5 mg/kg) subcutaan voor postoperatieve analgesie beheren.
    5. Plaats een thermostatisch gecontroleerde warm-water verwarming pad ingesteld bij 37 ° C onder het dier op het handhaven van de lichaamstemperatuur van de dieren tijdens de operatie.
    6. Plaats het dier in een stereotaxic frame, op een neus kegel te handhaven van de verdoving voorwaarde en oor bars om te stabiliseren van het hoofd. De geschoren huid steriliseren door afwisselend swabs van betadine scrub en 70% ethanol. Opthalamic zalf toepassen in de ogen te smeren ze.
    7. Gebruik de teen-snuifje test om voldoende anesthesie voorafgaand aan de eerste snede.
    8. Maak met een steriel scalpel een incisie van net achter de ogen naar de achterkant van de nek. De schedel en de dorsale cervicale nek spieren dienen te worden blootgesteld.
    9. Indien nodig de schedel bloot te stellen, gebruik katoen-tipped applicatoren te verwijderen elke membranen. Micro-bulldog klemmen kunnen worden gebruikt om de huid uit de buurt van de schedel. Zoek en markeer de positie van de bregma. 2 burr-gaten boren en invoegen van metalen schroeven 2.0 mm anterior / + 1,5 mm lateraal en 7,0 mm posterieure /-1,5 mm lateraal ten opzichte van de bregma. Volledige 2 omwentelingen te Draai de schroeven. Betrekking hebben op de blootgestelde schedel met een stuk gaas.
    10. Met behulp van steriele chirurgische scharen, maken een insnijding in de lichaamsholte, net onder de ribben.
    11. Controleer op het chirurgische blad, of om te registreren het serienummer van de zender om te worden ingeplant.
    12. De steriele zender binnen de lichaamsholte invoegen De draad leidt moet nog steeds buiten het lichaam.
    13. Gebruik absorbeerbare draadjes steek de spier muur, ervoor te zorgen dat alle van de leads worden verzameld op één uiteinde van de incisie.
    14. Verwijder het gaas van het hoofd en til de huid net onder de incisie. Loopt een paar lange steriele hemostats onder de huid van de hoofd incisie tot de incisie in de zijkant. Houden de druk op de huid om te minimaliseren van de schade.
      1. Zodra de hemostats zichtbaar in de buurt van de lichaam-incisie zijn, clip een membraan dat kan dek ze af met chirurgische scharen en pak die de vier zender met de hemostats leidt. Langzaam trekken uit de hemostats, zodat de draden onder de huid leggen en tot de schedel oplopen.
    15. Aanwijzen welke 2 leads zal worden aangesloten op de schedel. Met behulp van Tang, pak het eind van een draad met de ene hand en net onder het einde van het kunststof omhulsel met de andere. Trek op de draad tot individuele lussen kunnen alleen worden gemaakt.
    16. Strak wikkel de blootgestelde draad rond een van de metalen schroeven 3-4 x. Zodra het veilig is, draai de schroef vast om te voorkomen dat de draad ontrafelen en clip uit een extra draad. Herhaal dit met de tweede lood en schroef.
    17. Trek beide EEG leidt van de lichaamsholte zodat zij knus tegen de schedel zitten.
    18. Tandheelkundige cement gebruiken ter dekking van de schroeven en corticale leidt, het creëren van een GLB over de blootgestelde schedel. Ervoor zorgen dat geen tandheelkundige cement aan huid of spieren stokken en dat er geen scherpe randen zijn gemaakt. Laat de tandheelkundige cement te drogen.
      Opmerking: Het GLB moet klein genoeg dat de huid kan worden ingehecht over bovenkant.
    19. Pak voor de EMG leads, het einde van de draad en plastic omhulsel zoals beschreven in stap 4.1.15. Rek de draad tot de individuele loops duidelijk waarneembaar zijn.
    20. Voer een naald 22 G onder de spieren van de nek aan de rechterkant voor 2 – 3 mm alvorens het naar voren. Plaats nonabsorbable hechtingen met een enkele, losse hechtdraad rond de ingesloten naald.
    21. Rijg de EMG draad in de naald en trek de naald uit, waardoor de EMG draad met de draad onder de spier. Draai de hechtdraad om de draad op zijn plaats blijft en clip de extra draad die kan voortkomen uit de spier te waarborgen.
    22. Herhaal stap 4.1.20 en 4.1.21 voor de tweede EMG lood, ongeveer 1 mm naar beneden van de eerste lead.
    23. Trek beide EMG leidt van de lichaamsholte zodat zij knus tegen de spier zitten.
    24. Gebruik nonabsorbable steken om te sluiten van het hoofd en de hals snede. Tuck alle extra draad onder de huid van het lichaam en wond clips te sluiten de incisie lichaam gebruiken.
    25. Lidocaïne zalf toepassen op beide locaties van de snede om te helpen het dier met de postoperatieve pijn.
    26. Het dier terug naar haar kooi, waardoor de kooi te zitten op de verwarming pad totdat het dier is hersteld van de narcose.
      Opmerking: Het dier moet herstellen voor 7-10 dagen voor het begin van de opnamen.
  2. EEG/EMG opname
    Opmerking: In dit protocol, we toegediend zoutoplossing of kynurenine op ZT 0 en vervolgens opgeslagen van het dier slaap-waak patronen gedurende 24 uur.
    1. Voltooi alle slaap opnamen in een aangewezen ruimte waar de dieren niet zal worden onderbroken gedurende de duur van de opname.
    2. Plaats de kooi van het dier (gezien de geïmplanteerde EEG/EMG-zender) op een ontvanger. Zet de chirurgisch geïmplanteerde zender met behulp van een magneet.
      Opmerking: Een licht moet verschijnen op de ontvanger wanneer de zender wordt geactiveerd.
    3. De opname van de EEG/EMG gegevens met behulp van de bijbehorende software instellen
      1. Selecteer "Experiment" en vervolgens "Create" in het drop-down menu. Naam van het experiment, en vervolgens op te slaan. Vervolgens Selecteer "Hardware" en vervolgens "Bewerken MX2 Configuration".
      2. In het nieuwe venster, selecteert u alle zenders gebruikt in het experiment en aangeven welke ontvangende pad is gekoppeld. Als u klaar bent, start de opname door op "Start alle continue" te drukken.
    4. Aan het einde van de experimenten, selecteer "Stop alle continue" in de bijbehorende software en uitschakelen van de zenders die met behulp van de magneet.
    5. De dieren euthanaseren door CO2 verstikking gevolgd door een cardiale lekke band. Verwijder de zender zorgvuldig door heropening van de incisie langs de bovenkant van het hoofd met een chirurgische schaar en snijden van de leads die vrij van de tandheelkundige cement en nek spieren.
    6. Volgende, open de lichaamsholte, zoek de zender en verwijder het langzaam uit het lichaam.
  3. EEG/EMG analyse
    1. De bijbehorende software gebruiken om de slaap-waak-gegevens te analyseren. Open het programma en selecteer 'Toevoegen nieuwe locatie'. In het nieuwe venster Selecteer de gegevens te importeren in de Score software.
      Opmerking: Dit zal een nieuw bestand binnen de software met alle ruwe golfvormen verzameld tijdens het experiment maken.
    2. Handmatig scoren de waakzaamheid Staten voor de gewenste experimenten. Na het noteren, analyseren de parameters zoals de totale duur, het aantal periodes en de duur van de gemiddelde bout van de verschillende staten van de waakzaamheid [rapid eye movement (REM), non - REM NREM en wake].
      Opmerking: De analyse kan worden uitgevoerd over de hele opname of afgekort tot specifieke tijdstippen van belang. Hier is de analyse werd uitgevoerd voor de opname periode tussen ZT 0 ZT 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor het valideren van het gebruik van een intraperitoneaal kynurenine injectie als een methode om de hersenen KYNA verheffen, werd een HPLC analyse van weefsel uitgevoerd. Standaard curven (Figuur 1) werden geconstrueerd met behulp van de bijbehorende software en voor de kwantificering van de weefselmonsters toegestaan. Representatieve chromatogrammen voor kynurenine en KYNA worden weergegeven in Figuur 2. Kynurenine werd waarge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor een betrouwbare beoordeling van KYNA in de hersenen na de toediening van een perifere kynurenine is het essentieel om te combineren en interpreteren van biochemische en functionele experimenten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee nieuwe gebruikers om te voorzien in doeltreffende methoden voor het meten van het plasma kynurenine en de hersenen KYNA van ratten. De meting van kynurenine in het plasma bevestigd de nauwkeurige injectie en de meting van de metaboliet KYNA bevestigt de DOVO syn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De huidige studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 NS102209) en een donatie van de Clare E. Forbes Trust.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Wistar rattenCharles River Laboratoriesvolwassen mannetje, 250-350 g
L-kynureninesulfaatSai Advantium
ReproSil-Pur C18 kolom (4 mm x 150 mm)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
Montagematerialen schroevenPlasticsOne00-96 X 1/16
Niet-absorbeerbare hechtdradenMedRep Express699BCP Medical Monomid Black Nylon Hechtdraden, 4-0, P-3, 18", DOOS VAN 12
Absorbeerbare hechtdradenEthiconJ310H4-0 Gecoat Vicryl Violet 1X27'' SH-1
TandcementStoelting Co.51458
BoortjeStoelting Co.5145510,45 mm
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alliance HPLC-systeem
E2695 scheidingsmoduleWaters176269503
2475 fluorescentiedetectorWaters186247500
post-kolom reagent managerWaters725000556
Lenovo-computerWaters668000249
Empower-softwareWaters176706100
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Passieve vermijdingsbox voor rat
Extra hoge MDF geluidsdempingscabineMedAssociatesENV-018MDInterieur: 22" (B) x 22" (H) x 16" (D)
Middenkanaal modulator shuttlebox kamerMedAssociatesENV-010MC
Roestvrij stalen roostervloer voor ratMedAssociatesENV-010MB-GF
Automatische guillotinedeurMedAssociatesENV-010B-S
Snelle ontkoppelingsharnas voor shuttlebox roostervloer voor ratMedAssociatesENV-010MB-QD
Stimuluslicht, 1" witte lens, gemonteerd op modulair paneelMedAssociatesENV-221M
Sonalert-module met volumeregeling voor ratkamerMedAssociatesENV-223AM
SmartCtrl 8 invoer/16 uitvoer pakketMedAssociatesDIG-716P2
8-kanaals IR-besturing voor shuttleboxenMedAssociatesENV-253C
Infraroodbron en detectiearraystripsMedAssociatesENV-256
Tabelinterfacekast, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080C
Dual range constant current aversieve stimulatiemoduleMedAssociatesENV-410B
Solid state roostervloer scrambler moduleMedAssociatesENV-412
Dual A/B shockbesturingsmoduleMedAssociatesENV-415
2' 3-Pin mini-molex verlengkabelMedAssociatesSG-216A-2
10' Shockuitgangskabel, DB-9 M/FMedAssociatesSG-219G-10
Shuttleshockbesturingskabel 15', 6MedAssociatesSG-219SA
Kleine tafelkast en voeding, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080D
PCI-interfacepakketMedAssociatesDIG-700P2-R2
Shuttlebox vermijdbaarheidsutilitypakketMedAssociatesSOF-700RA-7
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Slaap-waakmonitoringapparatuur
Ponehmah-softwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interfaceData Sciences International (DSI)PNM-P3P-MX204
Dell-computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bitData Sciences International (DSI)271-0112-013
Dell 19" computermonitorData Sciences International (DSI)271-0113-001
Ontvangers voor plastic kooien, 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
Cisco RV130 VPN-routerData Sciences International (DSI)RV130
Matrix 2.0Data Sciences International (DSI)271-0119-001
NetwerkswitchData Sciences International (DSI)SG200-08P
Neuroscore-softwareData Sciences International (DSI)271-0171-CFG
Twee biopotentiaalkanaalzendontvanger, model TL11M2-F40-EETData Sciences International (DSI)270-0134-001
```

Referenties

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kynureninepadpassief vermijdingsparadigmaslaap waakarchitectuurcontextueel geheugentestenplasma kynurenine metingcerebrale KYNA vormingHPLC analysefluorescentiedetectie
Een High-performance Liquid Chromatography-meting van Kynurenine en Kynurenic zuur: Biochemie voor cognitie en slaap in ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.