Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

9.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58140

⸱

3 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2LGI Flow Cytometry Core Facility, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Samenvatting

Myelodysplastic syndromes (MDS) zijn een diverse groep van hematopoietische stamcellen aandoeningen die zijn gedefinieerd door ineffectieve Haematopoiese, perifeer bloed cytopenias dysplasie en een neiging voor transformatie naar acute leukemie. NUP98-HOXD13 (NHD13)-transgene muizen recapituleren menselijke MDS in termen van perifeer bloed cytopenias, dysplasie en transformatie naar acute leukemie. Wij zijn het er eerder blijk gegeven dat MDS kunnen worden overgebracht van een genetisch gemanipuleerde muis met MDS naar wild-type ontvangers door het transplanteren van MDS nucleated beenmergcellen (BMNC). Om meer duidelijk te begrijpen de MDS-cel van oorsprong, hebben we benaderingen transplantatie specifieke, immunophenotypically gedefinieerd hematopoietische deelverzamelingen. In dit artikel beschrijven we het proces van isoleren en verplanten specifieke populaties van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen. Na transplantatie beschrijven we benaderingen om de efficiëntie van transplantatie en persistentie van de cellen van de MDS donor te beoordelen.

Inleiding

Myelodysplastic syndromes (MDS) vertegenwoordigen een gevarieerde set van klonen bloed stoornissen, gekenmerkt door ineffectieve Haematopoiese, morfologische bewijs van dysplasie en een neiging voor transformatie naar acute myeloïde leukemie (AML)1,2 ,3,4. Ineffectieve Haematopoiese is erkend als een arrestatie van de rijping in het beenmerg en resultaten in perifeer bloed cytopenias ondanks een hypercellular beenmerg1,3. De incidentie van MDS meermalen heeft geraamd als 2-12 gevallen per 100.000 personen per jaar in de Verenigde Staten, en de incidentie van MDS toeneemt met de leeftijd, waardoor dit een belangrijke voorwaarde om te begrijpen gezien de veroudering van de Amerikaanse bevolking3, 5. Hoewel de meeste gevallen van MDS geen duidelijke etiologie hebben, worden sommige gevallen van MDS verondersteld te wijten aan de blootstelling aan bekende genotoxische agentia, met inbegrip van oplosmiddelen, zoals benzeen, en kanker chemotherapie6.

MDS-patiënten kunnen mutaties in de MDS cellen7meestal hebben verworven. Hoewel relatief zeldzaam, hebben een aantal MDS-patiënten verworven evenwichtige chromosomale translocaties waarbij genen zoals NUP98, EVI1, RUNX1 en MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Ons laboratorium heeft een jarenlange interesse in chromosoom translocaties, waarbij de NUP98 gen8. Transgene muizen dat uitdrukkelijk een transgenic NUP98-HOXD13 (NHD13) geregeld door de promotor van de Vav1 en enhancer elementen alle van de belangrijkste functies van MDS, met inbegrip van perifeer bloed cytopenias, morfologische bewijs van dysplasie en transformatie naar AML9 tonen .

Hoewel MDS voor meer dan 60 jaar10zijn bekroond, en worden beschouwd als een stoornis van de cel van de stam van de klonen, inspanningen om de engraft van menselijke MDS cel in immunodeficiëntie muizen geweest grotendeels mislukte, omdat de MDS cellen slecht11, engraft 12,13,14 en de muizen niet klinische ziekte ontwikkelen. In een poging om te identificeren welke hematopoietische cellen kunnen overbrengen MDS, we wendde zich tot het NHD13-model, en toonde dat we MDS als een ziekte-entiteit die alle kardinaal functies van menselijke MDS engraft konden toonde, met inbegrip van perifeer bloed cytopenias, heupdysplasie, en transformatie naar AML15. In dit rapport presenteren we de technische details van deze experimenten, alsmede risicobeheersingsmethoden naar verdere fractionate van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPC), in een poging om de MDS-initiëren cellen opsporen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dieren in dit artikel beschreven procedures door het National Cancer Institute in Bethesda Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd, en voldoen aan het beleid deel uitmaakt van het beleid op volksgezondheidsgebied Service op Humane zorg en gebruik van proefdieren, de Dierenwelzijn Act, en de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. cel voorbereiding

  1. Oogsten beenmerg genucleëerde cel (BMNC)
    1. Gebruik alleen steriele materialen. Herbruikbare instrumenten met behulp van een stoom-autoclaaf steriliseren. Aankoop naalden, spuiten, en plastic consumptieaardappelen in steriele recipiënten eenpersoonsgebruik. Alle dieren en cel manipulaties uitvoeren in een klasse II, Type A2 biologische veiligheid kabinet.
    2. BMNCs bereiden in een 14 mL ronde onderkant buis met 3 mL HF2 (Henks uitgebalanceerd zout oplossing aangevuld met 2% foetale runderserum).
    3. Euthanaseren C57Bl6 donor muizen (positief voor CD45-allel CD45.2), leeftijd meestal 2-6 maanden, met behulp van een CO2 -kamer.
    4. Steriliseren de muis karkas in 70% ethanol over het hele lichaam te spuiten met een spray fles. Schil de huid van de benen, uit het bekken naar de enkel.
    5. Verwijder de dijbenen en tibiae van het karkas met behulp van steriele schaar (rechte, scherp/sharp, 11,5 cm) en pincet (Graefe, gekarteld, 0.8 mm tip breedte). Trim bijgevoegde spieren duidelijk.
    6. Snij de proximale en distale uiteinden van de tibia met de schaar. Houd het onderbeen met een tang en plaats een 27-gauge 3 mL injectiespuit met 2,5 mL HF2 in de holte van de tibiale beenmerg DISTAAL eind van de tibia (enkel). Spoel de beenmergcellen van de tibia met zachte druk in de 14 mL ronde onderkant buis.
      1. Herhaal voor de andere tibia.
    7. Snijd de proximale en distale uiteinden van het dijbeen met een schaar. Flush de dijbeen beenmerg holte door het invoegen van een 20-gauge-naald gekoppeld aan een 3 mL spuit die 2,5 mL HF2 in het distale einde van de dijbeen beenmerg Holte en zachte druk uit te oefenen op de spuit.
      1. Herhaal voor de andere dijbeen, verzamelen van alle beenmerg van beide tibiae en dijbenen in de dezelfde 14 mL ronde onderkant buis.
    8. De massa van het beenmerg verspreiden door zuigen op en neer meerdere malen met de dezelfde 20-gauge-naald, gekoppeld aan de 3 mL spuit.
  2. Antilichaam kleuring van BMNC
    1. Graaf BMNC. Voeg toe 20 µL van een azijnzuur-oplossing van 3% aan 20 µL van de ophanging van de BMNC gegenereerd in stap 1.1.8. Dan rekenen met behulp van een hemocytometer en een omgekeerde Microscoop.
    2. De BMNC pellet door zachte centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet met HF2 met behulp van 90 µL per 107 cellen en voeg 10 µL van biotinyleerd anti-bloedlijn antilichaam cocktail aan de celsuspensie.
    3. Wassen na incubatie gedurende 20 minuten bij 4 ° C, de gekleurde cellen met 3 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Resuspendeer de BMNC met 100 µL van HF2 per 107 cellen. Voeg 2 µL van allophycocyanin (APC) geconjugeerd anti-Biotine antilichaam aan de celsuspensie, gevolgd door incubatie bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
    5. Spoel de gekleurde BMNC met 3 mL PBS en resuspendeer de BMNC met HF2 aangevuld met 0,2 µg/mL propidium jodide (PI) voor het sorteren van stroom cytometry cel.
  3. Stroom cytometry cel sorteren van BMNC
    1. Stroom cytometry cel sorter kalibreren. Optimaliseer alle fotomultiplicator buizen (PMTs), spreidings- en fluorescentie parameters onbevlekt cuvetten en ingesteld binnen het lineaire bereik van elke detector.
    2. Bereiden onbevlekt, PI-gekleurd en APC Label lineage cocktail cellen parallel geschakeld vanaf stap 1.2. Analyseren spectrale schadevergoeding.
    3. Doublet cellen discrimineren door sequentiële gating van FSC-H vs. SSC-H 640-WS-A vs. 640-WS-H en 640-WS-S vs. 640-WS-W.
    4. Nonviable cellen met behulp van PI opgewonden op 561 nm en emissie verzameld met een 614/20 band pass filter uit te sluiten. Excite lineage APC cellen op 640 nm en verzamelen emissie aangeduid met een 671/30 band pass filter.
    5. Fluorescentie waarden als spanning hoogte registreren en verzamelen van ten minste 100.000 gebeurtenissen in lijst modus gegevensbestanden te visualiseren van de bevolking moeten worden gesorteerd.
    6. Berekenen van de spectrale compensatie na het verwerven van drie monsters van 10.000 cellen voor het volgende: ongelabelde cellen, PI label cellen en anti-bloedlijn antilichaam cocktail geconjugeerd met APC label cellen.
    7. Drie regio's te sorteren Lineage negatieve (LN), Lineage positief (LP) met dim fluorescentie intensiteit (LP1) en LP bevolking met heldere fluorescentie (LP2) in 5 mL buisjes met 0,5 mL 10% FBS media instellen
    8. Soort cellen een één druppel omhullen en zuiveren afbreken modus.
    9. Post sorteren analyses uitvoeren met 1.000 totaal aantal cellen op elk gesorteerde monster te bevestigen de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen.
    10. Gesorteerde cellen verzamelen door centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet van de cel met 0,5 mL HF2.
    11. Bevestigen gesorteerde cel nummer met hemocytometer en Trypan blauw. Aanpassen van het aantal cellen met HF2 voor transplantatie.
      Opmerking: Een breed spectrum van BMNC bevolking kan worden geïsoleerd voor transplantatie met behulp van extra combinaties van fluorescerende-geconjugeerde antilichamen in stap 1.2.2 hierboven.

2. ontvangende muizen voorbereiding en hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT)

  1. Voorbereiding van transplantatie ontvangers
    1. Diergeneeskunde en veehouderij verzorging congenisch ontvangende muizen (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een specifieke pathogene vrije (SPF) dier faciliteit handhaven.
    2. Verstrekken van steriel water met 100 mg/L ciprofloxacine naar de geadresseerden voor 7 dagen vóór de letale dosis (9 Gy) bestraling voor profylactische saneren van de gastro-intestinale track, en gedurende 14 dagen na bestraling.
    3. Bieden een dodelijke dosis (9 Gy) bestraling van een Cs-bron als volgt. Een opgeleide, gecertificeerde Cs-operator gebruiken. Stel het Cs source instrument te leveren 70 cGy/min totale lichaam gamma bestraling. 10 muizen plaats in een speciaal ontworpen houder en de houder aansluit op de irradiator-zaal. Leveren van bestraling van de gehele lichaam 9 Gy in 13 minuten en de muizen terug te keren naar hun kooien.
  2. Hematopoietische stamceltransplantatie
    1. Meng wild type (WT) BMNC van een congenisch ontvanger muis (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in een dosis van de cel van 2 x 10,5 cellen per muis met 2 tot 5 x 104 cellen van gezuiverde detest die BMNC bereid met stroom cytometry sorteren als beschreven in 1.3 hierboven. Meng cellen in dezelfde spuit.
      Opmerking: De WT-BMNC bieden een straling sparen-effect aan de ontvangende muis en ondersteuning voor het voortbestaan van de ontvangende muis als de test cellen ondersteunen geen Haematopoiese. De WT-BMNC gebruikt in dit type experiment uitdrukkelijke de CD45.1-allel, en dus kan worden onderscheiden van de cellen van de test met behulp van antilichamen die onderscheid tussen CD45.1 en CD45.2 maken. De WT BM cellen worden aangeduid als "helper cellen", "straling-sparend cellen" of "concurrent cellen".
    2. Stel het volume mengsel cel naar 200 µL per geadresseerde met steriele HF2 voor het vergemakkelijken van de injectie.
    3. Overplanten de mengsels van de cel aan de dodelijk bestraalde ontvangende muizen via intraveneuze staart veneuze injectie met 1 mL spuit en naald 28-gauge, binnen de 24u van bestraling. Plaats de muis staart onder een warmte lamp, zoals warmte leidt tot staart veneuze dilatatie.
      Opmerking: Euthanaseren van alle de ontvangende muizen aan het einde van de studie en de progressie van de ziekte door necropsie, histologie en stroom cytometry te evalueren.

3. engraftment-Assay met behulp van Stroom Cytometry

  1. Verzamelen om te beoordelen donor cel engraftment, perifeer bloed (PB) van de ontvangende muizen op 6de week, 12e week en 16e week na de transplantatie.
  2. Warm de geadresseerden in de kooi met warmte lamp voor ongeveer 1 minuut en plaats van de muis in een afdekking.
  3. Snijd de ader van de staart met een scalpel (mes 10, #3 scalpel handvat) en het verzamelen van 100 µL van PB per geadresseerde met een microcapillary-buis met EDTA als een antistollingsmiddel.
  4. De verzamelde PB in twee gelijke aliquots verdelen door het plaatsen van 50 µL in een steriele microcentrifuge buis. Gebruik één aliquot voor een geautomatiseerde complete blood count (CBC) (uitgevoerd de NCI histopathologie kern) en gebruik het tweede monster voor antilichaam kleuring en stroom cytometry.
  5. U wilt opsporen donor engraftment door stroom cytometry, lyse de rode bloedcellen (RBC) door toevoeging van 1 mL hypotone RBC lysis-buffermengsel (8.29 g/L van NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0.037 g/L Na2EDTA, pH 7,2) aan 50 µL van de verzamelde PB. Vortex het monster te mengen en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  6. Centrifugeer het lysed PB bij 4.600 x g voor 1,5 min. zorgvuldig gecombineerd het supernatant en gooi deze weg.
  7. Gedeeltelijk de cel pellet te verstoren door zachtjes te tikken of "flicking" de onderkant van de buis. Voeg in de pellet 1.3 mL PBS gelegen in buis en centrifugeer bij 4.600 x g gedurende 1,5 min. zorgvuldig aspirate en gooi het supernatant.
  8. De cel pellet te verstoren door te tikken of flicking, en voeg 200 µL van HF2 aangevuld met 5% rat serum om de cel-pellet.
  9. Toevoegen van anti-CD45.2 antistof (1 µL) geconjugeerd met allophycocyanin (APC) naar de celsuspensie. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 30 minuten, en kort vortex het mengsel.
  10. Na de kleuring, wassen van de cellen tweemaal zoals hierboven beschreven en resuspendeer met 400 µL van HF2 aangevuld met 1 µg/mL PI.
  11. Engraftment met behulp van een 4-kleurige stroom cytometer detecteren. Het verkrijgen van aanvullende informatie over de soorten van de cellen in het perifere bloed door toevoeging van extra antilichamen op te sporen specifieke celtypen, zoals B of T-lymfocyten.
  12. Seriële engraftment gegevens met behulp van een spreadsheet voor verdere analyse van de gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wij tonen de representatieve cijfers voor resultaten van verschillende experimenten. Figuur 1 toont een representatieve stroom cytometry sorteren experiment. Tijdens normale hematopoietische differentiatie, cellen naarmate zet zich in voor een specifieke hematopoietische bloedlijn, ze verwerven lineage-definiëren cel oppervlakte markeringen en verliezen van de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing. Daarom, in wild-type muizen, zelf-vernieuwing van stamcellen is...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

MDS weliswaar een stoornis klonale hematopoietische stamcellen, de MDS "stammen" of initiatiefnemende cellen, hebben nog niet gekenmerkt. Wij eerder aangetoond dat MDS kunt transplanteerbaar aan WT muizen met behulp van het beenmerg van NHD13 muizen door HSCT, gekenmerkt door macrocytische anemie, leukopenie, neutropenie en morfologische bewijs van dysplasie15. Bovendien, concurrerende herbevolking tests geïdentificeerd een voordeel van de groei van cellen uit het beenmerg van NHD13 MDS. Deze bevi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Wij hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van het National Cancer Institute, National Institutes of Health (verlenen nummers ZIA SC 010378 en BC 010983).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
14 mL rondbodembuisjeFalcon352057
Hank's gebalanceerde zout oplossingLonza10-527F
Anti-CD45.2 antilichaamSouthern Biotech1800-15LOT# A077-T044O
3 mL SpuitMonoject8881513934
27-G naaldBD305109
20-G naaldBD305176
Lineage CocktailMiltenyi130-090-858LOT# 5170418221
Anti-Biotin antilichamenMiltenyi130-113-288LOT# 5171109046
1 mL SpuitExcelint26027Insulinspuit
VerwarmingslampThermo Fisher ScientificE70001901
FACS-apparaatCytecFACScan2 lasers, 5 kleurendetectoren
FACS-sorteerapparaatBeckman CoulterMOFLO ASTRIOS5 lasers, 23 parameters, 6 populaties sorteren gelijktijdig
Propidium JodideThermo Fisher ScientificP3566
GammastralingsinstallatieBest TheratronicsGammacell 40
BloedopvangbuisRAM scientific76011
OntvangermuizenCharles RiverB6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 muizenn/aC57Bl/6, CD45.2Colonie gehandhaafd bij NIH
5 mL rondbodembuisjeFalcon352058

Referenties

  1. Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
  2. Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
  3. Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
  4. Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
  5. Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
  6. Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
  7. Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
  8. Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
  9. Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
  10. Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
  11. Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
  12. Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
  13. Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
  14. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  15. Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
  16. Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  17. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  18. Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Genucleerde beenmergcellenflowcytometrietotale lichaamsbestralingcellsortingadoptieve transferCD45 2 markerlineage negatieve cellenanalyse van perifeer bloed
Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.