Beoordeling van de synaptische Interface van primaire menselijke T-cellen uit perifeer bloed en lymfoïde weefsel

Summary

Het protocol beschrijft een techniek om te bestuderen van de mogelijkheid van primaire polyklonale menselijke T cellen vormen van synaptic interfaces met behulp van vlakke lipide bilayers. We gebruiken deze techniek te laten zien van de differentiële synapse formatie vermogen van menselijke primaire T-cellen afgeleid van lymfeklieren en perifeer bloed.

Abstract

Het huidige begrip van de dynamiek en structurele kenmerken van T-cel synaptic interfaces is grotendeels bepaald door het gebruik van glas-gesteund vlakke bilayers en in vitro-afgeleide T-cell klonen of lijnen van^{1,2 ,3,4}. Hoe deze bevindingen van toepassing zijn op de primaire menselijke T-cellen geïsoleerd van bloed of lymfoïde weefsels niet bekend is, deels te wijten aan de grote moeilijkheden bij het verkrijgen van een voldoende aantal cellen voor analyse⁵. Hier aanpakken we dit door middel van de ontwikkeling van een techniek die exploitatie van meerkanaals stroom dia's om te bouwen van vlakke lipide bilayers met activeren en hechting van de moleculen. De geringe hoogte van de stroom dia's bevordert snelle cel sedimentatie om te synchroniseren van cel: dubbelgelaagde bijlage, waardoor onderzoekers de dynamiek van de formatie van het synaptische interface en de kinetiek van de release van de korrels te gaan studeren. We passen deze benadering voor het analyseren van de synaptische interface van zo weinig als 10⁴ naar 10⁵ primaire cryopreserved T cellen geïsoleerd uit lymfklieren (LN) en perifeer bloed (PB). De resultaten onthullen dat de roman vlakke lipide dubbelgelaagde techniek de studie van de biofysische eigenschappen van primaire menselijke T-cellen afgeleid van bloed en de weefsels in het kader van gezondheid en ziekte maakt.

Introduction

Wetenschappelijke kennis van de structurele kenmerken van T-cel immuun synapsen en hun link naar de functionele activiteit van T cellen is gegenereerd voornamelijk uit de studie van cellijnen en klonen afgeleid van PB. In welke mate deze bevindingen hebben betrekking op primaire T-cellen verkregen uit blijft bloed of menselijke lymfoïde weefsels onduidelijk, zoals de synaptische interfaces van T-cellen die woonachtig zijn in de lymfoïde en andere weefsels hebben tot nu toe niet is geanalyseerd. Belangrijker, suggereren opkomende gegevens dat weefsel-ingezetene en lymfoïde-orgel-afgeleide T-cellen kunnen aanzienlijke verschillen in hun fenotype en functionele activiteit in vergelijking met PB^6,7. Dit heeft verder verhard de noodzaak om de functies van de T-cel synaptic interface in primaire menselijke T cellen beter te begrijpen.

Daartoe hebben we een aanpak van de nieuwe mini schaal benutten van lipide bilayers ingebouwd in meerkanaals stroom dia's, zodat we kunnen uitvoeren van de beeldvorming van T-cel/dubbelgelaagde interfaces met minder dan 10⁵ primaire T cellen geïsoleerd van menselijke PB en LN. Deze nieuwe techniek maakt het mogelijk de studie van de biofysische eigenschappen van primaire menselijke T-cel synaptic interfaces om beter model en in vivo cel interacties begrijpen.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle deelnemers, en bloed-en lymfeklier werden verworven met de goedkeuring van de institutionele Review Board aan de Universiteit van Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Alle proefpersonen waren volwassenen. Koord bloedmonsters werden beschikbaar gesteld door arbeid en levering van de afdeling Obstetrie & gynaecologie aan de Thomas Jefferson University. Alle monsters waren-geïdentificeerde.

1. isolatie van CD4⁺ T cellen voor een beeldanalyse

1. Ontdooi een hoeveelheid van 1 mL met 10⁷ bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of lymfeknoop mononucleaire cellen (LNMCs) uit verzamelde monsters. Meng in een steriele kap, de ontdooide cellen 9 mL RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine en glutamine.
   1. Centrifugate de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 ° C, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL aangevuld RPMI bevattende 10 gewichtspercenten FBS (volledige medium). Incubeer de cellen overnachting in een CO₂ incubator bij 37 ° C.
2. De volgende dag, zuiveren CD4⁺ T cellen door negatieve immunomagnetic sorteren met behulp van een commercieel beschikbare kit volgens de instructie van de fabrikant.
3. Voor het meten van het aantal CD4 vers gezuiverde⁺ T cellen, Meng 5 µL van de celsuspensie met een gelijk volume van de oplossing van een trypan blauw. Laden van een hemocytometer met een cel-trypan blauwe mengsel en tellen de levende cellen binnen de 5 onderdelen van de hemocytometer.
4. Neem het gemiddelde van het aantal cellen en bepalen van het aantal cellen in de oorspronkelijke celsuspensie: het aantal cellen/1 mL = het gemiddelde aantal x 2 x 10-⁴. Als het totale aantal geïsoleerde cellen te klein is, gebruikt u de cellen zoals hij is zonder het tellen.
5. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer hen in een assay buffer (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM nb₂HPO₄, 5 mM D-glucose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂en 1% menselijk serumalbumine) op 10^{5 < /C13 > cellen/50 µL of minder en houden van de cellen bij 4 ° C (voor 1-2 h) tot klaar voor gebruik in de experimenten.}
6. Verwijdering van alle biologische afval volgens de relevante institutionele richtlijnen.
7. Indien gewenst als een controle-celpopulatie, bereiden van geactiveerde CD8 T-cellen uit navelstrengbloed PBMC, plaatst u 10⁷ cellen in 5 mL voor volledige medium in een maatkolf van T25 cultuur bedekt met een mengsel van antilichamen van de anti-CD3 en anti-CD28 op 10 µg/mL en 1 µg/mL , respectievelijk.
8. De volgende dag, de geactiveerde koord bloedcellen verwijderen uit de kolf, was ze 1 x met verse medium voltooien en uit te breiden van de cellen in het bijzijn van recombinante IL-2 (100 U/mL) voor 2 weken.
9. Zuiveren van de CD8 navelstrengbloed⁺ T cellen door negatieve immunomagnetic sorteren met behulp van de verkrijgbare kit volgens de instructie van de fabrikant. Cellen tellen en de media aan de assay buffer te wisselen zoals beschreven in stappen 1.3-1.6 voor LN en PB CD8⁺ T cellen.

2. onderdelen voor de bereiding van de vlakke lipide-Bilayers

1. 3 soort liposomen zoals elders beschreven⁵bereiden: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-fosfocholine) liposomen, (b) 0.4 mM DOPC liposomen met 33% van de mol honden-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glycero - 3-[(N-(5- amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic zuur) succinyl] (ammoniumzout)) lipiden, (c) 0,4 mM DOPC liposomen met 4 mol % Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glycero-3-phosphoethanolamine - N-(GLB biotinyl) (natriumzout)).
2. 5% caseïne-oplossing te bereiden als eerder beschreven⁵.
   1. Los 5 g caseïnepoeder in 100 mL ultrazuiver water en Voeg 350 µL van 10 M natriumhydroxide-oplossing. Roer alles op een regelmatige magneetroerder met een langzame snelheid volgens de beschikbare schaal, bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en dan 's nachts bij 4 ° C. Breng de pH op 7.3 en ultracentrifuge de oplossing voor 2 h bij 100.000 x g bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof filteren met een 0,22 µm steriele filter en bewaar de oplossing in aliquots bij-80 ° C.
      Let op: natriumhydroxide-oplossing kan veroorzaken chemische brandwonden en permanente blindheid bij aanraking met de ogen veroorzaken. Gebruik rubberen handschoenen, veiligheidskleding en bescherming van de ogen bij de behandeling van deze chemische stof of haar oplossingen.
3. Label anti-CD3 antilichaam met biotine voor de productie van mono-bionylated antilichamenmolecules met een eerder beschreven aanpak⁸.
   1. Bereid een oplossing van biotine-PEO4-NHS in dimethylsulfoxide (DMSO) op 0,1 mg/mL. Voeg 3.7 µL van de Biotine-PEO4-NHS-oplossing tot 1 mg van antilichaam in 0,5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 100 mM natriumbicarbonaat.
   2. Laat het mengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur inwerken. Bereid een oplossing van Alexa Fluor 488 NHS ester 10 mg/ml in DMSO. De Alexa Fluor 488 NHS ester oplossing aan het antilichaam gelabeld door Biotine-PEO4-NHS op een 10-fold molaire overmaat toevoegen.
   3. Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met langzaam roeren op een regelmatige magneetroerder. De niet-afhankelijke kleurstof met behulp van grootte-uitsluiting chromatografie te scheiden.
   4. De antilichaam-concentratie te bepalen door het meten van de extinctie van de oplossing van het antilichaam bij 280 nm (een₂₈₀). Meet de extinctie van de gelabelde antilichamen op 577 nm (een₅₇₇).
   5. Het bepalen van de verhouding van de kleurstof-naar-antilichaam met behulp van de volgende vergelijking:
      
      Opmerking: Extra details vinden in protocol van de fabrikant.
4. Express een recombinant oplosbare ICAM-1 proteïne in een systeem van Drosophila expressie, zoals eerder beschreven van^3,4,9,10.
   1. Kloon, met cDNA codering, de ectodomain van ICAM-1 in Drosophila expressie vector bet/V5-zijn met een afleidbare metallothionein promotor te produceren een recombinant eiwit toegevoegd met een zijn₆ -tag op het einde van de C-terminal.
   2. Co transfect S2 cellen met de resulterende ICAM-1 met plasmide en een G418 expressie vector. Selecteer stabiele transfectants met behulp van Schneiders Drosophila Media aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 0,5 mg/mL G418 voor 3 weken. Vouw de cellen in serumvrij insect medium en veroorzaken een eiwit expressie met 0,5 mM CuSO₄ voor 3 d.
   3. Concentreer je de cultuur supernatant 10 x en dialyze tegen PBS via een tangentiële stroom concentrator als eerder beschreven¹¹.
   4. De geconcentreerde cultuur supernatant van toepassing op een kolom met Sepharose met een covalent geïmmobiliseerdet anti-ICAM-1 monoclonal antilichaam en elueer de afhankelijke ICAM-1 met een 50 mM glycine buffer, pH 3.0. Het eluted eiwit ICAM-1 met een 2 M Tris buffer, pH 8,0 onmiddellijk te neutraliseren.
   5. Dialyze van het eluted materiaal tegen PBS, pH 8.0 en de dialyzed materiaal toevoegen aan een kolom met Ni-NTA agarose. Elueer oplosbare ICAM-1 met 200 mM imidazool, pH 8,0. Dialyze het eluted materiaal tegen een PBS-buffer, pH 8,0.
   6. Label de gezuiverde ICAM-1 met Cy5 NHS ester volgens de instructie van de fabrikant.
      Opmerking: De beste definitieve kleurstof-naar-eiwitverhouding is 1:1.
5. Produceren van Fab fragmenten van een anti-CD107a antistof door papaïne spijsvertering en zuiveren van de Fab fragmenten door ionenwisselingschromatografie zoals eerder beschreven van³. Label de Fab-met Alexa Fluor 568 NHS ester volgens de instructie van de fabrikant fragmenten.

3. vorming van vlakke lipide glas-ondersteunde Bilayers

1. Bereid een fris zure piranha-oplossing door het mengen van 140 mL geconcentreerd zwavelzuur en 60 mL van 30% waterstofperoxide. De coverslips van het glas voor de stroom dia's wassen door inweken hen in de zure piranha-oplossing voor 30 min. Hold het glas dekglaasje aan met polypropyleen scissor-type pincet.
   Let op: Piranha-oplossing is een zeer sterke oxidator. Vergeet niet om slijtage veiligheidsbril of bril of een full-face schild samen met dikke rubberen handschoenen te allen tijde tijdens het verwerken van de oplossing. Werken alleen met piranha-oplossing in een zuurkast. Vermijd Verwarming, het vervoer, of het schudden op elk gewenst moment tijdens het gebruik, zoals het kan ontploffen. De piranha afval in een glazen fles met een gat van lood-bevattende verzamelen. Neem contact op met de institutionele Veiligheidscommissie over juiste afval-gebruik.
2. Spoel de gewassen coverslips 7 x met ultrazuiver water door het overbrengen van hen opeenvolgend in bekerglazen met vers water. Set de natte coverslips opzij te laten de resterende water uit het schone glas rollen, het droog glas achterlaat.
   1. Ook gebruiken een uiteinde van de pipet gekoppeld aan een vacuümpomp om zorgvuldig de resterende waterdruppels van de coverslips.
3. In de steriele kap, uitgevoerd door verdunningen van verschillende lipiden te produceren van de liposomen mix voor het maken van bilayers. Eerst, 37 µL van DOPC liposomen en 3 µL van Biotinyl-Pet-PE liposomen te combineren. Ten tweede, meng 14 µL van DOPC liposomen en 15 µL van honden-NTA liposomen. Derde, voeg 1 µL van de eerste mix aan 29 µL van de tweede mix te fabriceren van het definitieve liposoom mengsel.
4. Een werkruimte met droge coverslips dicht door instellen in de steriele kap. Aliquot 2 µL van het mengsel van definitieve liposoom (zie stap 3.3) precies in het midden van een zelfklevende dia-kanaal. Onmiddellijk en zeer nauwkeurig uitlijnen een schoon en droog dekglaasje aan de dia en zachtjes lager het dekglaasje aan aan de plakkerige kant van de dia.
   1. Als meer dan één dia voorbereidt, werken op één dia tegelijk omdat het liposoom mengsel snel verdampt. Het omdraaien van de dia en gebruik van de buitenste ring van polypropyleen scissor-type verlostang om een zachte druk uitoefenen op het perifere contact van het dekglaasje aan de dia, ervoor te zorgen dat de slip stevig is aangesloten op de dia te sluiten van lekkage.
      Opmerking: Druk niet op tegen de kanalen van de dia te voorkomen breken of barsten van het dekglaasje aan.
   2. Zet de dia opnieuw en markeer de positie van de gevormde dubbelgelaagde, die eruit als een druppel tussen het dekglaasje aan en de dia kanaal door tekening 4 stippen met een permanent marker rond de dubbelgelaagde aan de kant van de externe dia van de vergadering ziet.
5. Voordat de eerste injectie van een vloeistof in het kanaal, één poort van het kanaal aanwijzen als de ingangshaven en de andere als de uitlaatopening en onderhouden van deze benaming gedurende het gehele experiment.
6. Voorkom vorming van bubbels, het einde van het uiteinde van de pipet direct invoegen de ingangshaven van het kanaal. Langzaam vullen van de kanalen van de dia met 50 µL van warme (ten minste kamertemperatuur) assay buffer (zie stap 1.5 voor de samenstelling van de buffer).
7. Bereid een 0.5 M nickel(II) chloride oplossing. Ontdooi een 2 mL hoeveelheid caseïne oplossing in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 minuten en vullen met een nikkel-chloride oplossing bij een eindconcentratie van 200 µM.
8. De bilayers door het eerst injecteren 100 µL van de caseïne-oplossing in de ingangshaven van het kanaal en vervolgens onmiddellijk 100 µL van de uitlaatopening op de dia te verwijderen door pipetteren wassen. Blokkeren de bilayers met dezelfde oplossing door het injecteren van 100 µL van de caseïne-oplossing in de ingangshaven van elk kanaal en de dia gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
9. Ontdooi aliquots van Cy5-ICAM-1-zijn₆ en daar eiwitten. De eiwitten in de buffer van de bepaling in de definitieve concentratie van 2 µg/mL elke combineren. Centrifugeer de oplossing voor 30 min op 20.000 x g en 4 ° C tot het verwijderen van eventuele aggregaten.
10. De rest van de blokkerende oplossing uit de uitlaatopening van de dia-kanaal verwijderen door pipetteren. Breng 100 µL van de oplossing met ICAM-1 en daar in de ingangshaven.
11. Laat de dia gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Elke overschrijding van de eiwit-oplossing uit de uitlaatopening verwijderen. Wassen van de dubbelgelaagde 2 x door het eerst injecteren 100 µL van de buffer van de bepaling in de ingangshaven van het kanaal en vervolgens 100 µL van de uitlaatopening onmiddellijk te verwijderen.
12. Verdun een Alexa Fluor-488-gemerkte anti-CD3 antilichaam met de assay buffer een eindconcentratie van 2 µg/mL. Injecteren van 100 µL van de antilichaam-oplossing in de ingangshaven van de dia en laat het gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Elke overschrijding van de eiwit-oplossing uit de uitlaatopening verwijderen. Wassen van de dubbelgelaagde 2 x met 100 µL van de buffer assay zoals in stap 3.11.

4. beeldvorming van de T-cellen interactie met de vlakke dubbelgelaagde

1. Verwarm de fase en de doelstelling van een Microscoop confocal of totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), totdat de temperatuur wordt geëquilibreerd bij 37 ° C. Instellen van de dia met de bilayer(s) in het verwarmde werkgebied. Het werkgebied verplaatsen naar een juiste positie volgens de inkt merken en focus op de dubbelgelaagde fluorescentie van Cy-gelabelde ICAM-1 moleculen in dienst.
   1. Gebruik een 61 X doelstelling voor de confocal microscoop, of een 100 X doelstelling voor de TIRF-Microscoop, met passende filterinstellingen.
2. Voor de submodule release beeldvorming door TIRF microscopie, toevoegen van Alexa Fluor-568-gelabelde anti-CD107a antistof Fab fragmenten aan de celsuspensie op een eindconcentratie van 4 µg/mL vóór het injecteren van de cellen in de havens van de ingang.
   1. Resuspendeer de bereid CD4⁺ T cellen geïsoleerd van LN, de PB of koord bloed en 50 µL van de celsuspensie injecteren de ingangshaven van het kanaal van de dia met de dubbelgelaagde.
3. Kies het gewenste aantal velden en records beelden van elk veld 1 x om de 2 min voor 30 min na de injectie.
4. Helder-veld, gereflecteerde licht en fluorescerende kanalen (Alexa 488 en Cy5) van de confocal microscoop te verwerven van de beelden misbruiken. TIRF modus gebruiken voor Alexa-Fluor-488 en Alexa-Fluor-568 fluorescentie en widefield voor Cy5 fluorescentie, evenals lichte-veld imaging, op de TIRF-Microscoop.

5. de beeldanalyse

1. Analyseer de verworven beelden met behulp van de juiste software. Observeren cel morfologie in de doorvallend licht beelden en uitsluiten geclusterd en zichtbaar beschadigd of apoptotic cellen uit de analyse. Deelnemen aan de analyse alleen die cellen die productief samenwerken met het dubbelgelaagde oppervlak (dat wil zeggen, cellen accumulatie van Alexa-Fluor-488 fluorescentie (anti-CD3 antistoffen) bij de interface).
2. Bepaal de grootte van de cel adhesie gebied in 20 min. na de inleiding van de cel-dubbelgelaagde interactie.
   Opmerking: De hechting area is de donkere ontwikkeld op het raakvlak van de cel-dubbelgelaagde op de interferentie reflectie microscopie (IRM) beelden.
3. Observeer een accumulatie van Cy5-ICAM-1 fluorescentie en een formatie van het kruispunt van de ring door gescheiden Cy-ICAM-1 moleculen in de cel-dubbelgelaagde interface. Als een opgebouwde ICAM-1 moleculen gevormd een hechting ring afslag van ten minste twee opeenvolgende beelden, wijzen dergelijke cellen als cellen ontwikkelen een perifere supramoleculaire activerend cluster (pSMAC)¹².
4. Evalueren de submodule release door het meten van de intensiteit van de fluorescentie Alexa-Fluor-568 op het raakvlak van T-cel-dubbelgelaagde over de achtergrond fluorescentie buiten de contactpunten in de nabijheid van de cel. Cellen met een ratio van Alexa-Fluor-568 signaal-naar-achtergrond van ten minste 1,3 als degranulating cellen aanwijzen.

Results

Eerst, vergeleken we de structuur van de synaptische interface gevormd door geactiveerde koord-bloed-afgeleide CD8⁺ T cellen blootgesteld aan lipide bilayers gebouwd ofwel in traditionele grootschalige stroom cel systemen (Zie de Tabel van materialen voor details)^{1 ,2,3,4} of in meerkanaals stroom dia's. De bilayers bevatte TL-geëtike...

Discussion

De nieuwe techniek hier beschreven maakt gebruik van soortgelijke reagentia moeten bouwen vlakke bilayers in de conventionele stroom cel⁵ en met succes kan worden toegepast voor het uitvoeren van de beeldvorming van primaire menselijke T-cel-dubbelgelaagde interfaces^{3,4 ,15}. De techniek biedt een significante vermindering van het gebruik van fluorescerend moleculen en vereist 10 – 20 x minder T-cellen te...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD4 T cell isolation kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
DOGS NTA	Avanti Polar Lipids	790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	870273C
Human Serum Albumin	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608
Coverslips for sticky-Slides	ibidi	10812
Bioptech FCS2 Chamber	Bioptech	060319-2-03
anti-CD3 antibody	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	OKT3 clone, hybridoma cellen zijn verkrijgbaar bij ATCC
anti- CD28 antibody	Genetex	GTX14664	9.3 clone
Casein	Sigma	C5890
Biotin-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit met kolom voor gelabelde eiwitzuivering	Thermo Fisher Scientific	A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit met kolom voor gelabelde eiwitzuivering	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Life Science	PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 Drosophila expressievector voor positieve selectie	ATCC	37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	De hybridoma secreteert antilichaam tegen ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B	Sigma-Aldrich	C9142	Gebaat voor de bereiding van Sepharose met covalent gebonden anti-ICAM antilichaam.
MasterFlex tangential flow concentrator	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Gebaat voor ICAM-1 bevattend supernatant concentratie en dialyse van ICAM-1 bevattend supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems	Pall Laboratory	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Gebaat voor ICAM-1 bevattend supernatant concentratie en dialyse van ICAM-1 bevattend supernant
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30210
Dialysis tubing	Spectra/Por	131384
Papain uit papayalatex	Sigma	P3125
muis anti-mens antilichaam tegen CD107a	BD Bioscences	555798	Clone H4A3
Ansell Natural Blue Handschoenen	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene Polypropyleen Scissor-Type Pincetten	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
Streptavidin	ProZyme	SA10
Confocale microscoop	Nikon		Nikon TiE omgekeerde microscoop uitgerust met PFS voor lange termijn beeldstabiliteit controle, 60X olie objectieven, 4 lasers met excitatielijnen op 405, 458, 488, 514, 561 en 640 nm, 2 GaAsP detectoren en 2 hoge gevoeligheid PMT's, DIC getransmitteerd licht, Programmeerbare X,Y,Z fase voor meerdere posities en samenvoeging van grote gebieden, time lapse functies, Tokai-Hit temperatuur en CO2-gecontroleerde kamer voor live beeldvorming, en anti-vibratie isolatie tafel
TIRF microscoop	Andor		Andor Revolution XD systeem uitgerust met Nikon TIRF-E verlichter, Lasers met 405,488,561 en 640 lijnen, DIC getransmitteerd licht, Yokogawa CSU-X1 spinning disk hoofd voor confocale beeldvorming, 100/1.49 NA objectief, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objectief verwarmer, en een piëzo-elektrische gemotoriseerde fase met Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software	Molecular devices