Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Samenvatting

In de afgelopen jaren gebaseerd atomaire kracht microscopie (AFM) enkel molecuul kracht spectroscopie (SBF) uitgebreid van ons begrip van de moleculaire eigenschappen en functies. Het gaf ons de mogelijkheid om te ontdekken een veelheid van biofysische mechanismen, bijvoorbeeldhoe bacteriële adhesines bind aan de oppervlakte receptoren host in meer detail. Onder andere factoren hangt het succes van de SBF experimenten in de functionele en de native immobilisatie van de biomoleculen van rente op vaste oppervlakken en AFM tips. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de covalente koppeling van eiwitten aan silicium oppervlakken met behulp van silane-PEG-carboxyls en de gevestigde N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemie in volgorde om te ontdekken de interactie van pilus-1 adhesine RrgA van de gram-positieve bacterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) met de extracellulaire matrix eiwit fibronectine (Fn). Onze resultaten tonen aan dat de oppervlakte functionalization tot een homogene verdeling van Fn op het glasoppervlak en tot een geschikte concentratie van RrgA op de AFM cantilever tip, herkenbaar door de streefwaarde van maximaal 20% van de interactie gebeurtenissen tijdens de SBF leidt metingen en geopenbaard dat RrgA aan Fn met een gemiddelde kracht van 52 pN bindt. Het protocol kan worden aangepast aan paar via specifieke gratis thiol sitegroepen. Dit resulteert in een vooraf gedefinieerde eiwit of molecuul oriëntatie en is geschikt voor andere biofysische toepassingen naast de SBF.

Inleiding

Naast optische en magnetische pincet, de atomaire kracht Microscoop (AFM)^1,2 heeft ontpopt als een nuttig instrument om te analyseren en manipuleren van moleculen en peilen naar hun eigenschappen en functies, met inbegrip van hun reactie op externe kracht^{3 ,4}. In tegenstelling tot methoden zoals het enzym gekoppelde immunosorbent analyse (ELISA), oppervlakte plasmon resonantie (SPR) of quartz crystal microbalans (QCM) opstellingen, AFM staat voor het meten van interacties op de enkel molecuul (SBF)⁵ en eencellige niveau (SCF)⁶ . Deze technologieën leverde waardevolle inzicht in bindende mechanismen als de obligaties van de vangst gevonden voor de interactie van E. coli pilus eiwit die FimH met mannose⁷, of de tandem β-rits herhaalt gevormd door Fn bindende proteïnen uit S. aureus bij binding met Fn⁸. Konden we onlangs te tonen dat de pilus-1 adhesine RrgA^9,,¹⁰ van de gram-positieve bacterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)¹¹ vermag binden aan fibronectine¹² met haar twee terminal domeinen. Dit bleek een nieuwe twee-domein bindend mechanisme dat verschilt van de tandem β-rits en piliated pneumokokken te vormen en onderhouden van een voorbijgaande contact naar fibronectine-bevattende host oppervlakken¹³kan inschakelen.

Het succes van de SBF experimenten is kritisch afhankelijk van de functionele en de native immobilisatie van de biomoleculen op vaste oppervlakken en AFM tips. Als er hoge krachten kunnen optreden tijdens de SBF metingen, moeten de eiwitten bij voorkeur worden covalent gekoppeld aan het oppervlak. Er zijn een groot aantal verschillende koppeling methoden voor de immobilisatie van eiwitten en andere biomoleculen, evenals de hele cellen op (anorganisch) vaste oppervlakken, nano-deeltjes en andere apparaten die zijn beschreven in de literatuur^{14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27}. Deze protocollen maken vaak gebruik van gevaarlijke stoffen, zijn moeilijk te voeren en/of het vereisen van speciale uitrusting (b.v., plasma reiniger). Een eenvoudige manier om paar moleculen tot glas is een dikkere laag van het polymeer van heterobifunctional crosslinkers met een silane-reactieve groep aan de ene kant en een amine-reactieve groep aan de andere kant hechten. Afhankelijk van de toepassing, de koppeling agenten kunnen bestaan uit flexibele hydro-koolstof ketens met een variabele lengte, bijv., polyethylenglycol (PEG). Ze onderdrukken van niet-specifieke interacties van de gemodificeerde oppervlakken (bijvoorbeeldhydrofobe, elektrostatische en interacties van-der-Waals) en de gekoppelde molecuul roterende vrijheid kunnen bieden.

Hier beschrijven we een algemeen protocol voor de covalente koppeling van eiwitten met een of meer vrije amino groepen (-NH₂) naar het glazen oppervlakken en siliciumnitride AFM tips via een heterobifunctional ethoxy silane-PEG-carboxyl (-COOH). Dit protocol kan worden gebruikt in de SBF experimenten, die wordt geïllustreerd op basis van de interactie tussen RrgA en de extracellulaire matrix eiwitten Fn (Zie Figuur 1 voor een overzicht).

De eerste stap is de silanization van de oppervlakte^28,29,30,31. Het gaat om de hydrolyse van de ethoxy groepen de koppelmiddel om zeer reactieve SiOH groepen vormen. Deze kunnen reageren met SiOH groepen op de drager vervagen. In een primaire condensatie stap, deze silanols formulier waterstofbruggen en verspreid over het substraat. In een secundaire condensatiereactie (die meestal vereist warmte of vacuüm om water te verwijderen), siloxaan obligaties worden gevormd. Dit resulteert in een laag covalent bijgevoegde organo-silane.

De tweede stap is de koppeling van de eiwitten aan de functionele (-COOH) groepen die uit te van de polymeer-^{32 breiden}. Ten eerste, het zuur wordt geconverteerd naar een reactieve N-hydroxysuccinimid (NHS) ester gevorderde, die is opgedaan door de gevestigde NHS/EDC (1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid chemie³³ en ondergaat nucleofiele substitutie tot slot een amide om binding te vormen met primaire amines op de eiwitten.

Op deze manier RrgA was gekoppeld aan siliciumnitride AFM tips en menselijke Fn glazen substraten in een willekeurige oriëntatie en hun interactie krachten werden geanalyseerd op het niveau van één molecuul. Onze resultaten tonen aan dat de beschreven Oppervlaktechemie tot een homogene verdeling van Fn op het glasoppervlak en tot een geschikte concentratie van RrgA op de tip, herkenbaar door de streefwaarde van maximaal 20% van de interactie gebeurtenissen tijdens de SBF metingen leidt. Deze chemie vermindert aspecifieke achtergrond interacties, is weinig vrijblijvend tijdens data-acquisitie en is daarom uitermate geschikt voor nauwkeurige SBF experimenten.

Protocol

1. de immobilisatie van eiwitten via functionele Silane koppeling agenten

Opmerking: Figuur 1 geeft een overzicht van de oppervlakte chemie toegepast in dit protocol.

Let op: In het volgende protocol, verschillende chemische stoffen met corrosieve en irriterende eigenschappen huid gebruikt. Draag passende (zuur-bestendige) handschoenen, veiligheidsbril en laboratorium jas en werken onder de zuurkast bij de voorbereiding van oplossingen om te voorkomen dat de inademing van dampen.

1. Functionalization van glazen oppervlakken en siliciumnitride cantilever met silane koppeling agenten
   1. Verwijder grof stof en verontreinigingen uit glas dia's met isopropanol en precisie pluisvrije doekjes en gesneden van de dia's in de gewenste grootte (optioneel).
      Opmerking: Naast glas kunnen de stevige ondergrond kiezelzuur, kwarts en stikstofoxiden van aluminium, koper, tin, titanium, ijzer, chroom, zirkonium, nikkel en zink.
      Let op: De dia's van glas snijden kan leiden tot scherpe randen.
   2. Plaats het glas dia's in een kleuring pot gevuld met zoutzuur (33% HCl) verdund met dubbel gedestilleerd water (ddH₂van O) tot 3-5% (v/v), sluit de pot met passende deksel en plaats het in een ultrasoonbad gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: De gebruikte pot heeft een diameter van 6 cm en een geschatte grootte van 65-70 mL. Een juiste hoeveelheid verdunde HCl voor de pot 50 mL met 5 mL is 33% HCl en 45 mL ddH₂O. De HCl effectief verwijdert niet-bindende metaalionen, met name natrium, kalium en calcium en vermindert het silicium om te produceren een hydroxyl verzadigde glazen oppervlak.
      Let op: HCl is corrosief en huid irriteren. Draag passende zuur-bestendige handschoenen, veiligheidsbril en laboratorium jas en werken onder de zuurkast bij de voorbereiding van de oplossing om te voorkomen dat de inademing van dampen.
   3. Plaats de siliciumnitride AFM cantilever-sondes op een schone glasplaatje met het topje naar boven en bestralen met ultra violet licht van bovenaf voor ten minste 90 min.
      Opmerking: Voor één molecuul kracht spectroscopie, uitkragingen met een constante nominale lente van 0.01-0,1 N m^-1 zijn geschikt. Bestraling van het oppervlak van de ' Freischwinger ' met UV-licht verwijdert organische contaminanten, voornamelijk vet stoffen, en maken het hydrofiele aan de ene kant. Als de andere kant is zwaar verontreinigd - wat niet het geval moeten zijn, of als de ' Freischwinger '-sondes worden gebruikt vers uit de leveranciersverklaring doos - het invloed kan zijn op de meting van de SBF. Een grondige reiniging van de hele cantilever-chip met behulp van piranha-oplossing, die is gebruikt in vele studies³⁴, kan helpen.
      Let op: UV-licht is schadelijk voor de ogen; bestraling van de ' Freischwinger '-sondes moet daarom worden uitgevoerd in een UV licht ondoordringbare kamer. Piranha-oplossing is zeer reactieve en huid, papier en andere organisch materiaal kan branden. Gebruik geen plastic verpakkingen. Als geplaatst in gerechten of potten zelfs met kleine hoeveelheden organische verontreinigingen oppervlakte (b.v.uit vorige gebruik), kan het snel reageren.
   4. Vervang het zoutzuur in de kleuring pot met ddH₂O zonder het glasoppervlak droog en plaats de pot terug in het ultrasoonbad voor een ander 10 min. laten vervangen het water twee vaker gedurende 10 minuten respectievelijk te goed afwassen de zoutzuur zuur.
   5. In de tussentijd ontbinden ethoxy (of methoxy) silane polyethyleenglycol zuur (Si (OC₂H₅)³-PEG-COOH) in een mengsel van ethanol en ddH₂O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 aangepast met azijnzuur) tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mg mL ^-1. Bewaar de oplossing hermetisch afgesloten om te voorkomen dat de verdamping van de ethanol.
      Opmerking: Silane koppeling agenten zijn gevoelig voor vocht en temperatuur. Daarom moeten zij worden opgeslagen onder inert gas (N₂), bij lage temperatuur (-20 ° C) en onder droge omstandigheden. Alvorens de kolf te openen, zorg ervoor dat de silanes kamer temperatuur om te minimaliseren van hydratatie hebben bereikt en daardoor passivering van reactieve groepen. Heterobifunctional PEG koppeling agenten zijn beschikbaar met vele verschillende functionele groepen en verschillende spacer lengtes. Voor willekeurige immobilisatie van eiwitten via moet hun vrije amino groepen (NH₂), zoals beschreven in dit protocol, de aanvulling op de ethoxy/methoxy silane functiegroep een ester van de NHS. Naast de aankoop van een agent silane met NHS ester, is een eenvoudige manier om te winnen van dergelijke NHS ester te activeren van een carboxylgroep (-COOH) met 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) en NHS (zie 1.2.1. en 1.2.2.).
      Let op: Ethanol is brandbaar en huid irriteren. Azijnzuur is brandbaar en bijtend. Wees voorzichtig niet te krijgen van reactieve silanes naar de huid of ogen. Draag passende handschoenen, veiligheidsbril en laboratorium jas en werken onder de zuurkast teneinde inhalering van dampen.
   6. Giet de oplossing silane in twee aparte petrischalen, plaats de voorbereide cantilever sondes en glas dia's in een petrischaal respectievelijk, hermetisch verzegelen (bijvoorbeeld parafilm) te voorkomen van verdamping van de ethanol en incubeer stationaire voor 90 min op kamertemperatuur.
      Opmerking: De optimale omvang van de petrischaal hangt af van het aantal cantilever sondes en de grootte van de glazen dia's die moeten worden matiemaatschappij. De grootte van een diameter voor de goede behandeling en lage reagens volume is 50-60 mm. Voorkom ongewenste buigen van de uitkraging terwijl dringen via de lucht water interface de uitkraging moet plaatsvinden in een hoek van 90° aan de lucht-water-interface. De incubatie van de dia's van glas (maar niet de ' Freischwinger '-sondes) kan optioneel worden uitgevoerd op een roteerschudapparaat.
   7. Spoel de cantilever en glas dia's in drie opeenvolgende Bekerglazen met pure ethanol te volledig wassen van de niet-afhankelijke silane-verbindingen.
      Opmerking: Om te voorkomen dat ongewenste buigen van de uitkraging terwijl dringen via de lucht water interface, de uitkraging moet plaatsvinden in een hoek van 90°.
   8. Plaats de matiemaatschappij glas dia's in de kleuring kruik en de uitkraging op een schone glasplaatje en uitharding bij 110 ° C gedurende 30 minuten.
      Opmerking: Genezen met warmte induceert de vorming van covalente siloxaan bindingen en de verwijdering van water. Als het glas waren alleen de dia's matiemaatschappij aan de ene kant, zorg ervoor dat goed aan de gecoate zijde.
   9. Sla de gesilaneerde glas monsters en cantilever-sondes in een vacuüm exsiccator voor maximaal een week.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. Willekeurige immobilisatie van eiwitten op gesilaneerde glas en silicium nitride cantilever
   Opmerking: Om te voorkomen dat ongewenste buigen van de ' Freischwinger ', de ' Freischwinger '-sonde moet plaatsvinden in een hoek van 90° tijdens het penetreren van alle lucht-water-interfaces.
   1. Een oplossing met 42 mg mL^-1 van EDC en 20 mg mL^-1 NHS in standaard fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7.4) voorbereiden.
      Let op: EDC is corrosieve en irriterende van de huid en kan leiden tot ernstige oogbeschadigingen. Draag passende handschoenen, veiligheidsbril en laboratorium jas.
   2. Dekking van de dia's van silane gecoat glas met de oplossing en gesilaneerde cantilever sondes in een daling van de EDC/NHS-oplossing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Voor de incubatie van de ' Freischwinger '-sondes is de originele cantilever doos geschikt. Te koppelen eiwitten via hun vrije amino groepen naar de carboxyls (-COOH) van de heterobifunctional silane-PEG agenten, de COOH - groep is geactiveerd met de gebruikte EDC/NHS-chemie. EDC paren NHS aan de carbonzuur, vorming van een "stabiele" NHS ester waardoor efficiënte vervoeging tot primaire amines bij fysiologische pH in een volgende stap.
   3. Spoel de cantilever en glas dia's grondig met PBS in drie opeenvolgende bekers om volledig wassen van buitensporige EDC/NHS.
      Opmerking: Deze wassen stap is essentieel als resterende EDC/NHS kan dwarslijn eiwitten en daardoor veranderen hun functionaliteit.
   4. De geactiveerde glas dia's met broeden en de uitkraging sondes in een druppel van de gewenste eiwit-oplossing in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. De eiwit concentratie en incubatie tijd moet worden aangepast om te voldoen aan de eisen van het experiment. In het algemeen, een concentratie tussen 0,5 tot 1 mg mL^-1 en incubatie tijden van 30 min tot en met 2 h zijn geschikt voor de meeste proteïnen. In het geval van fibronectine (op glasplaatje) en pilus-1 tip eiwit RrgA (op cantilever), een molaire concentratie van 1,5 µM en 3 µM, respectievelijk, en een incubatietijd van 2 h volstaan.
   5. Wassen van de dia's van glas en de uitkraging sondes grondig met PBS in drie opeenvolgende bekers om te afwassen met niet-afhankelijke eiwitten.
   6. Verzadig de resterende NHS-ester met tris (hydroxymethyl)-aminomethan door het plaatsen van de sondes in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Deze stap vermindert ongewenste covalente koppeling van eiwitten tussen het functionalized oppervlak van de AFM tip en het glas, want de amino groepen van Tris kunnen binden aan de resterende geactiveerde COOH groepen op het oppervlak cantilever en substraat.
   7. Wassen van de dia's van glas en de uitkraging sondes grondig PBS en bewaar ze in aparte petrischalen met PBS tot gebruik bedekt.
      Opmerking: De monsters moeten vers worden bereid en gebruikt dezelfde dag.

2. atomic Force microscopie gebaseerd enkel molecuul Force spectroscopie

Opmerking: In dit werk, werd een atomic force microscope uit JPK instrumenten gebruikt en de set ups voor verkrijgen van force-afstand curven is gedefinieerd met de RampDesigner van kracht.

1. Cantilever kalibratie met de thermische ruis methode³⁵
   Opmerking: Voor cantilever kalibreren, volg de stap in de handleiding van de fabrikant. De meeste cantilever leveranciers staat een geschatte lente-constante, die is meestal berekend op basis van de nominale cantilever vorm (lengte, breedte, dikte) en is dus niet erg betrouwbaar. Als de juiste veer constante is van cruciaal belang, is het raadzaam na te gaan de hieronder beschreven in drievoud cantilever-kalibratie en de gemiddelde waarden van optische hendel gevoeligheid gebruiken voorjaar constante. Het kan zinvol zijn om te registreren de cantilever uitwijking in volt (V) tijdens het experiment en de omzetten te dwingen (pN) daarna met behulp van de optische hendel gevoeligheid en spring constante gemiddelde waarden. De veer constante en optische hendel gevoeligheid kan worden bepaald vóór en/of na het experiment, zolang de positie van de laser wordt niet veranderd op de uitkraging (de positie van de teruggekaatste laser kan worden aangepast op de fotodiode).
   1. Een schone, frisse glasplaatje Fix op de AFM-monsterhouder en bedek het met PBS buffer.
      Opmerking: De kalibratie moet worden uitgevoerd op een harde ondergrond (bijvoorbeeld, glas) en in de dezelfde buffer als de feitelijke experimenten.
   2. Vaststellen dat de sonde bereid cantilever de cantilever-houder, plaats het in het hoofd van de AFM en zorgvuldig nat de uitkraging met een daling van PBS buffer.
      Opmerking: De bevochtiging van de cantilever vermindert de oppervlaktespanning verschijnen tijdens penetratie in de buffer van de PBS op de kalibratie glasplaatje en aldus ongewenste buigen van de uitkraging.
   3. Langzaam de uitkraging naar het oppervlak van de kalibratie te verplaatsen totdat de uitkraging is volledig ondergedompeld in de PBS-buffer, maar nog steeds uit de buurt van het oppervlak van de kalibratie.
   4. De optische Microscoop van het bovenaanzicht van de AFM gebruiken of (indien beschikbaar) de omgekeerde Microscoop onder de AFM positie van de laser van de AFM op de achterkant van de uitkraging. Plaats de laser plek in de buurt van het einde van de uitkraging dicht bij waar het puntje zich bevindt.
      Opmerking: De laser spot moet worden gevestigd dicht bij het einde van de ' Freischwinger ', maar het moet nog volledig op de uitkraging. Als geen optische Microscoop beschikbaar is, gebruik een stuk papier voor zichtbare laser diodes of een laser detector kaart voor infrarood laser diodes, zet het onder het hoofd van de AFM en verplaats de plek van de laser naar de rand van de ' Freischwinger '-chip, waar de uitkragingen zich bevinden , tot u de plek op de kaart van papier of detector ziet. Verplaats de laser parallel aan de rand. Wanneer de vlek verdwijnt, is het op een ' Freischwinger '-arm. Voor lineaire uitkragingen, de plek aan het einde van de arm van de hefboom te verplaatsen totdat het webonderdeel op het papier/detector kaart en zet het terug verschijnt totdat het weer op de arm van de hefboom (verdwijnt uit het papier/kaart). Voor driehoekige, plaatst u de plek in het midden tussen de twee takken van de uitkraging en verplaats het naar het einde van de ' Freischwinger ', totdat het verdwijnt uit het papier/kaart. Controleer of u in het midden van de ' Freischwinger ' bent door het bewegen van de plek loodrecht op de lengteas van de uitkraging.
   5. Pas de positie van de vier Kwadrant detector fotodiode van de AFM op zodanige wijze dat de gereflecteerde laserstraal is gepositioneerd in het midden van de fotodiode.
      Opmerking: Ga als volgt te werk: gebruik de micrometer schroeven in de buurt van de diode detector te verhuizen van de diode in horizontale en verticale richting, totdat het signaal van de som van alle vier kwadranten is gemaximaliseerd. Verplaats de diode in verticale richting, totdat het verticale afbuiging signaal nul is, en verplaats de diode in horizontale richting, totdat de zijwaartse afbuiging signaal nul is. Silicon siliciumnitride cantilevers meestal hebben een gouden coating en zijn daarom een bimetal met twee verschillende coëfficiënten van thermische expansie. Dit resulteert in een thermische drift (herkenbaar in het signaal van de verticale afbuiging) vooral in de oplossing. Verklein deze drift tijdens de metingen en laat u het hele systeem equilibreer gedurende een paar minuten voordat de kalibratie.
   6. Open de calibratie manager in de software van de AFM en de cantilever gevoeligheid en lente-constante van de uitkraging kalibreren met de thermische ruis-methode als volgt.
   7. Zorgvuldig aanpak van het oppervlak van het substraat en het opnemen van een kracht-afstand-curve.
   8. Het bepalen van de gevoeligheid van de optische hefboom in nm/V door het aanbrengen van een rechte lijn naar het steilste deel van de curve van de kracht retractie, waar de tip is in contact met het oppervlak van het substraat. De gevoeligheid laat de cantilever voorjaar constante omzetten in pN/nm.
      Opmerking: De helling van de curve retractie is de piezo reis afstand vs. de verandering in fotodiode spanning (gemeten in nm/V).
   9. Het opnemen van verschillende spectra van de thermische ruis van de uitkraging met de cantilever ongeveer 100 µm of meer uit de buurt van het oppervlak om uit te sluiten van elk oppervlak demping.
   10. De veer constante van de uitkraging in pN/V bepalen door het aanbrengen van een harmonische oscillator verstrekt door de software van de AFM aan de spectra van thermische ruis.
   11. Langzaam de uitkraging intrekken en het opzeggen van de oplossing.
   12. Plaatsvervanger het glasoppervlak gebruikt voor cantilever kalibratie met het oppervlak van de steekproef die de geïmmobiliseerdet eiwitten bevatten. Zorg ervoor dat de uitkraging en het monster oppervlak (en daarmee de eiwitten) niet doen droog terwijl het veranderen van de dia's van glas.
2. Interactie dwingen experimenten op het niveau van één eiwit
   1. Langzaam bewegen de vochtige cantilever naar het oppervlak van het monster, totdat de uitkraging volledig door PBS buffer, maar nog steeds uit de buurt van het oppervlak van het substraat gedekt is.
      Opmerking: Verklein de thermische drift tijdens het experiment en laat het hele systeem instellen voor een paar minuten vóór het begin van de metingen van de spectroscopie kracht.
   2. Aanpak van het oppervlak en opnemen van meerdere kracht-afstand curven (≥ 500) op verschillende locaties van het monster oppervlak, met een contactkracht van 250 pN, een contacttijd van 1 s, een retractie lengte van 2 µm en een retractie snelheid van 1 µm s^-1.
      Opmerking: Voor de algemene kracht spectroscopie aanpassingen, volg de handleiding van de fabrikant. Variaties: De retractie snelheid kan variëren tussen 0,1 en 5 µm s^-1 om kinetisch gegevens afhankelijk van de toenemende kracht belasting te berekenen. De tijd van de interactie kan worden gevarieerd om te analyseren de versterking van de afhankelijke bond van de tijd. In plaats van de retractie snelheid constant te houden, kan men de werking constante (klem-modus forceren) houden.
3. Data-analyse
   Opmerking: Data-analyse werd uitgevoerd met behulp van de software van de gegevensverwerking. Afhankelijk van de geïmmobiliseerdet eiwitten, de contacttijd of de snelheid van de intrekking, of een voetafdruk opgericht of niet en andere variabele parameters, bevatten de kracht-afstand curven meerdere verschillende informatie. Data-analyse en interpretatie kunnen sterk variëren tussen verschillende SBF experimenten en kunnen daarom niet worden omschreven in detail hier. Wat betreft de interactie tussen RrgA en Fn, kan het volgende protocol worden een eerste stap voor de analyse van de SBF gegevens.
   1. De gemeten kracht kromme bestanden openen door de Open Batch van dwingen Scan pictogram te selecteren en verwerken van de curven van de kracht-afstand als volgt:
   2. De cantilever uitwijking (V) omzetten in de recht evenredig kracht (F) door de (her) kalibreren de V-uitwijking door gevoeligheid aan te passen en constante voorjaar pictogram te selecteren.
      Opmerking: Als cantilever kalibratie voordat het experiment werd uitgevoerd, de waarden worden opgeslagen in de bestanden van de scan kracht en worden automatisch gebruikt tijdens de kalibratie van de V-uitwijking. Indien de kalibratie na het experiment was verricht, gebruikt de software de standaardwaarden, die kunnen worden gewijzigd in waarden die zijn gemeten.
   3. Aftrekken van de basislijn van het kanaal van de intrekking in een regio van de kracht-curve ver van het oppervlak te stellen de nul kracht door het pictogram Aftrekken van de basislijnte selecteren.
      Opmerking: In sommige gevallen de intrekking kan niet dezelfde constante kracht waarde hebben en een lineaire tilt, die kan worden verwijderd door het selecteren van de Offset + kantelenkan worden weergegeven door de curve.
   4. Definiëren van het punt waar het puntje in contact met het monster krijgt door het Contact Point bepaling pictogram te selecteren.
   5. De hoogte-signaal omzetten in tip-monster scheiding door de Scheiding van de Tip-Sample -pictogram te selecteren. Naast het aftrekken van de positie van het contactpunt, trekt deze procedure de uitkraging buigen voor het berekenen van de afstand tussen het oppervlak van het substraat en AFM-tip.
      Opmerking: Voor montage van polymeer elastische modellen, zoals het extensible worm-achtige-ketting-model, en de bepaling van de lengtes van de interactie, de scheiding van de tip-monster, die wordt gecorrigeerd voor het buigen van de ' Freischwinger ', is meer nodig. Om te bepalen de kracht tarief uit de helling van de curve van de kracht en de snelheid van de z-piezo laden, moeten de curves van de niet-gecorrigeerde kracht worden gebruikt.
   6. Het scherm van de kracht-afstand sporen voor kracht pieken plaatsvinden op breuk lengtes boven 70 nm (lengte van de gestrekte PEG spacer)³⁶ te regelen niet-specifieke interactie en het uitbreidbare worm-achtige-ketting-model toepassen om de geselecteerde pieken door te selecteren de Past een polymeer keten Model pictogram en koos de uitbreidbare Worm-achtige keten Model. De pieken in de curve retractie kracht zal voorzien zijn van dit model en breuk krachten en lengtes worden verkregen, samen met de elastische parameters van het polymeer.
   7. De gegevens weergeven als histogrammen tonen de kracht en lengte distributies. Gebruik minstens 100 vrijblijvend evenementen voor de histogrammen.

Resultaten

Het protocol beschreven hier resultaten in een covalente immobilisatie van eiwitten via hun toegankelijk primaire amines met willekeurige oriëntatie (Figuur 1). Figuur 2 toont een beeld van de AFM van een gesilaneerde glazen oppervlak met (links) en zonder (rechts) Fn geïmmobiliseerd, afgelezen na de uitdroging van de monsters onder een zachte stroom van stikstof. De silane polymeer laag toont alleen kleine oppervlakte golvingen met een hoogte van ongeveer 2-5 nm (Figuur 2, rechts), terwijl op het oppervlak matiemaatschappij met Fn, ongeveer 10 nm hoog Fn moleculen zijn herkenbaar (Figuur 2, links). In close-ups, kan de dimeric structuur van de Fn worden herkend. De Fn-moleculen lijken te zijn met een hoogte van 4-5 nm boven de oppervlaktelaag van PEG en een lengte van compacte ~ 120 nm (Zie inserts).

Om te onderzoeken van de krachten van de interactie van RrgA met Fn, die onlangs door onze fractie¹³in detail werd beschreven, was de RrgA gekoppeld aan een siliciumnitride AFM uiteinde en menselijke Fn op het glas-substraat (Figuur 3a). Figuur 3 toont representatieve tip monster scheiding curven van de interactie van RrgA met Fn opgenomen met een trekken snelheid van 1 µm s^-1. De gebruikte oppervlakte chemie leidde tot een lage achtergrond interactie en goed gevormde enkel (of dubbel) interactie gebeurtenissen (Figuur 3a), werden uitgerust met behulp van een extensible worm als ketting (eWLC) model (rode lijnen). Uitzetten van de resultaten van de pasvorm (breuk kracht en -lengte, Zie Figuur 4) laat zien dat na het overwinnen van aspecifieke oppervlakte interacties tussen AFM tip substraat en de linkers PEG (> 70 nm), die zich uitstrekt tot ~ 19% van de kracht-curven toonde breuk evenementen met een gemiddelde breuk kracht voor de RrgA - Fn interactie van ~ 52 pN op een tip-monster afstanden van ongeveer 100 nm. In contrast, een niet toepasbaar Oppervlaktechemie (hier weggelaten blussen met Tris gebufferde zoutoplossing Figuur 3b) zal een belemmering vormen voor een duidelijke evaluatie van één interactie evenementen als gevolg van aspecifieke interacties, meerdere eiwit bindende (sporen 2 en 3) en/of covalente koppeling van eiwitten tussen het oppervlak van het monster en de AFM cantilever tip. Dit leidt tot hoge breuk krachten (spoor 1), eventueel vergezeld van de ontplooiing van het eiwit (Fn) domeinen (sporen 4 en 5).

Figuur 1: overzicht over de Oppervlaktechemie. De hydrolyse van ethoxy silane-PEG-carboxyl wordt gevolgd door de condensatie op de gehydrateerd glasoppervlak en de vorming van crosslinks siloxaan. De reactie van EDC met de carboxylgroepen resulteert in een reactieve o- acylisourea, een amine-reactief intermediair met een extreem korte halfwaardetijd in waterige oplossing (hydrolyse). De intermediaire wordt gestabiliseerd door de vorming van een ester van de NHS die ondergaat nucleofiele substitutie om te vormen tot slot een amide-binding met primaire amines op de eiwitten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Immobilisatie van fibronectine op een glazen substraat via heterobifunctional ethoxy silane PEG carboxyl koppelmiddel. AFM beelden van matiemaatschappij glazen oppervlakken met (links) en zonder (rechts) voetnoot aantallen wijzen op individuele Fn moleculen, die zijn homogeen verdeeld over het substraat oppervlak (insert). De moleculen vast een dimeric en compacte structuur met een hoogte van 4-5 nm boven de PEG coating en een lengte van > 100 nm. Dit lijkt op de structuur van Fn in oplossing en is in overeenstemming met eerdere AFM gegevens op andere oppervlakken, bijvoorbeeld mica (schaal staaf-van-inlays = 500 nm)³⁷. Hieronder de AFM zijn beelden hoogte profielen langs de lijnen die zijn aangegeven in de beelden van de AFM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: illustratie van een SBF experiment en vertegenwoordiger dwingen afstand curven van de RrgA - Fn interactie. (a) RrgA en Fn waren covalent gekoppeld via de heterobifunctional ethoxy silane PEG carboxyl koppelmiddel aan een siliciumnitride AFM cantilever uiteinde en een glazen oppervlak, respectievelijk. Vertegenwoordiger SMFS dwingen afstand curven voor RrgA - Fn interactie met een retractie snelheid van 1 µm s^-1 met de beschreven immobilisatie van RrgA en Fn verkregen worden weergegeven. Rode curven vertegenwoordigen de uitbreidbare worm-achtige ketting past toegepast om ruptuur krachten en lengtes te verkrijgen. De figuur is gewijzigd van Becke, et al., ACSnano 2018¹³. (b) de vertegenwoordiger van de SMFS dwingen afstand curven verkregen voor de RrgA - Fn interactie zonder blussen met Tris gebufferde zoutoplossing. In dit geval de primaire amine van Tris afwezig was zodat de resterende actieve NHS esters bleven onverzadigde, tijdens het experiment. Dit leidde tot multi eiwit bindende (sporen 2 en 3) en de klemmen van eiwitten tussen het oppervlak en de AFM tip wat in hoge breuk resulteerde troepen begeleid door (Fn-) domein ontvouwen (spoor 1, 4 en 5; Let op de verschillende schalen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: kracht en lengte verdeling van één RrgA - Fn interacties. Scheuren van de kracht en bijbehorende breuk lengte histogrammen verkregen RrgA - Fn SBF interactie metingen (n = 1400) met een snelheid van de intrekking van 1 µm s^-1. De histogrammen onthullen een meest waarschijnlijke breuk kracht f_MP van 51.6 pN (Gauss past, zwarte lijn) en een opeenstapeling van breuk lengtes ongeveer 100 nm. De figuur is gewijzigd van Becke, et al., ACSnano, 2018¹³. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Sinds de invoering van de AFM op basis van de SBF, het uitgegroeid tot een veel gebruikte techniek om direct sonde intra en intermoleculaire krachten van de individuele eiwitten, nucleïnezuren en andere biomoleculen^3,4,5. Voor succesvolle experimenten van de SBF is een passende oppervlak koppeling strategie een voorwaarde. Om de sonde de intramoleculaire krachten in natuurlijke en synthetische polymeren, kunnen de polymeren rechtstreeks worden gekoppeld aan het substraat oppervlak en de AFM tip^{36,38,39,40,41}. Voor het onderzoek van Inter moleculaire interacties, zoals de moleculaire obligaties, het is echter raadzaam om het gebruik van flexibele linker moleculen zoals hetero-bifunctionele PEG linkers of polypeptide kettingen, hechten de interactie-partners aan het uiteinde van de AFM en de substraat oppervlak, zodat de correcte oriëntatie van de bindende-partners, te korte afstand oppervlaktekrachten overwinnen en denaturatie en ontplooiing van eiwitten^{21,22,23, te vermijden 24,25,26,27,42}. We beschreven daarom een eenvoudig en ongecompliceerd protocol voor de covalente immobilisatie van eiwitten via hun toegankelijk primaire amines met hetero-bifunctionele PEG afstandhouders.

We toonden de toepasbaarheid ervan met het onderzoek naar de interactie tussen adhesine RrgA van S. pneumoniae en de extracellulaire matrix eiwitten Fn, zoals onlangs in detail beschreven elders¹³.

De oppervlakte chemie is een gevestigde en geanalyseerd en soortgelijke benaderingen zijn met succes gebruikt in meerdere SBF experimenten^{19,42,43,44,45}. De silylether gebruikt voor het koppelen van het polymeer silane aan het oppervlak, is onderworpen aan de hydrolyse. De graad van hydrolyse is afhankelijk van de hoeveelheid gevormde siloxaan obligaties, die tijdens het silanization-proces kan worden gecontroleerd. Als hoge interactie krachten (≥ 1000 pN) verwachting tijdens de SBF metingen, moet de silanization worden uitgevoerd via damp-fase afzetting³⁰ die in de vorming van een continue laag van siloxanen resulteert. Wat veel experimenten (bijv., veel eiwit-eiwitinteractie) zijn de krachten van de interactie in het bereik van een paar honderd pN, en de beschreven procedure, welke siloxaan vorming is uitgevoerd door afzetting van een waterige fase en unbound organo-silanes zijn zorgvuldig afgewassen met ethanol (stap 1.1.7) gevolgd door het genezen met warmte (stap 1.1.8), is voldoende.

Een andere belangrijke stap is om te wassen van de resterende EDC en NHS moleculen uit het oppervlak (stap 1.2.3), zoals restjes naar de activering van carboxylgroepen op de eiwitten leiden zal. Dit kan ofwel resultaat in crosslinking van eiwitten op hetzelfde oppervlak, waardoor hun functionaliteit kan worden gewijzigd of covalent paar eiwitten aan andere eiwitten op het tegenovergestelde oppervlak geactiveerd. Dit kan leiden tot het klemmen van de eiwitten tussen het oppervlak en de AFM tip, wat in hoge breuk krachten resulteert, eventueel vergezeld van domein ontvouwen (Zie Figuur 3b, spoor 1, 4 en 5, ontplooiing van Fn domeinen)⁴⁶. Hetzelfde probleem kan optreden, als de actieve NHS-esters van de pin spacer onverzadigde zitten. Daarom wordt de incubatie met Tris gebufferde zoutoplossing aanbevolen (stap 1.2.6), omdat de primaire amine van Tris de resterende amino reactieve groepen lest.

Volgens het protocol stapsgewijze leidt tot een homogene verdeling van Fn op het gesilaneerde glas oppervlak (Zie Figuur 2), waardoor een dimeric vorm van het eiwit. Dit lijkt op Fn´s structuur in de oplossing en is in overeenstemming met eerdere AFM gegevens over andere monster oppervlakken³⁷. Daarnaast wordt een geschikte concentratie van RrgA op het puntje van de AFM verkregen, die genereert een streefwaarde van ~ 20% van welomschreven interactie gebeurtenissen tijdens de SBF metingen (Figuur 3 en Figuur 4). Een andere elegante manier om te bepalen welke van moleculen die zijn gekoppeld aan de steekproef substraat en cantilever tip naast variërend van de eiwit-concentratie en/of incubatie tijden, is de combinatie van silane-agenten met verschillende secundaire functionele groepen. Door het veranderen van de verhouding van eiwit reactieve groepen zich uitstrekt van de PEG-polymeer, kunnen het aantal geïmmobiliseerdet eiwitten gecontroleerde^15,16,17,18.

Het protocol hier beschreven kan ook worden gebruikt om te immobiliseren andere -NH₂ met moleculen of worden aangepast aan paar eiwitten aan andere siliciumoxide oppervlakte naast glas en silicium nitride. Afhankelijk van het ontwerp van de eiwitten, de reactieve carboxylgroep van amine kan worden gewijzigd in een sulfaatzuurstof reactieve groep (bijvoorbeeld, maleimide of ortho-pyridyl-disulfide) te koppelen de eiwitten via zijn vrij-SH-groepen. Voor Fn resulteert dit in een vooraf gedefinieerde oriëntatie^13,17,20.

Kortom, dit protocol dienen verschillende eisen kan worden aangepast en is geschikt voor andere biofysische toepassingen naast enkel molecuul kracht spectroscopie experimenten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
2-Propanol	Carl Roth	6752
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	03450	EDC
Azijnzuur	Carl Roth	3738	100 %; analytische zuiverheid
Tweevoudig gedestilleerd water
Ethanol	Carl Roth	9065	≥ 99,8 %; analytische zuiverheid
Ethoxy silane polyethyleenglycolzuur	Nanocs	PG2-CASL-5k	5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Zoutzuur	Carl Roth	X896	32 %
N-Hydroxysuccinimide	Merck	804518	NHS; voor synthese
Fosfaatbufferoplossing - Dulbecco	Biochrom	L1825	PBS
Sondevoeler bijv. Fibronectine, menselijk plasma	Sigma-Aldrich	F1056
Sondevoeler bijv. RrgA			Geproduceerd in laboratorium
Natriumchloride	Carl Roth	9265	NaCl
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan	Carl Roth	AE15	≥ 99,3 %; TRIS; bufferkwaliteit
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Uitrusting
Bekers
Glazen snijder
Glazen schuifjes	Carl Roth	0656
Inerte gas-droger	Sicco
Inverteer microscoop - Zeiss Axiovert 200	Zeiss
JPK NanoWizard 1	JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM en DP-software	JPK Instruments
Laboratoriumoven	Binder
Magneetroerder	IKA
Microschuiver
Microcentrifugebuisjes
Microsoft Excel	Microsoft
Parafilm M	Brand	701606
Petrischalen
pH-meter	Knick
Pipetten	Starlab		10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Precisiebalans	Acculab
Siliciumnitride cantilever - MLCT	Bruker AXS S.A.S		Veerconstante ≤ 100 pN/nm
Ultrasoonbad	Bandelin
Kleurvat
Stereomicroscoop - Zeiss Stemi	Zeiss
Reerstaaf
Kimtech science precision wipes	Kimberly-Clark
Tweez
UV PenRay	UVP, LLC	90-0012-01	Kwikspectrum met de primaire energie op 254 nm
Vakuumdroger
Vakuumpomp
Vortexmixer	VWR
Weegpapier	Carl Roth	TP64