Methodenartikel

Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij

DOI:

10.3791/58173

⸱

14 september 2018

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te testen de remmende effecten van farmacologische agenten op phospholipase C (PLC) in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij, presenteren we een biochemische assay voor het meten van de PLC activiteit in die regio's. Deze bepaling zou kunnen zijn handig voor het vergelijken van PLC activiteit onder weefsels, alsook tussen de bijen verschillende gedragingen vertonen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De honingbij is een modelorganisme voor het evalueren van complexe gedrag en hogere hersenfunctie, zoals leren, geheugen en verdeling van de arbeid. De paddestoel lichaam (MB) is een hogere hersenen centrum voorgesteld als de neurale substraat van complexe honingbij gedrag. Hoewel eerdere studies geïdentificeerd genen en proteïnen die differentieel op de MBs en andere hersengebieden worden uitgedrukt, zijn de activiteiten van de eiwitten in elke regio nog niet volledig begrepen. Om weer te geven van de functies van deze eiwitten in de hersenen, farmacologische analyse is een haalbare aanpak, maar is het eerst nodig om te bevestigen dat farmacologische manipulaties inderdaad veranderen als u de activiteit van het eiwit in deze hersengebieden.

Wij eerder een hogere uitdrukking van genen coderend voor phospholipase C (PLC's) in de MBs dan in andere hersengebieden, en farmacologisch beoordeeld de betrokkenheid van PLC in het gedrag van de honingbij. In deze studie, wij biochemically twee farmacologische agenten getest en bevestigd dat ze PLC activiteit in de MBs en andere hersengebieden daalde. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van hoe te detecteren PLC activiteit in honingbij hersenen homogenaat. In dit systeem assay homogenates afgeleid van verschillende hersengebieden zijn reageerde met een synthetische fluorogenic substraat en fluorescentie die voortvloeien uit de activiteit van de PLC is gekwantificeerd en vergeleken tussen hersengebieden. Ook beschrijven we onze evaluatie van de remmende effecten van bepaalde drugs op de activiteit van de PLC met behulp van hetzelfde systeem. Hoewel dit systeem waarschijnlijk beïnvloed door andere endogene fluorescentie-verbindingen en/of de absorptie van de onderdelen van de test en de weefsels is, de meting van de activiteit van de PLC met behulp van dit systeem is veiliger en gemakkelijker dan dat het gebruik van de traditionele bepaling, die vereist radiolabeled substraten. De eenvoudige procedure en de manipulaties laten te onderzoeken PLC activiteit in de hersenen en andere weefsels van honingbijen die betrokken zijn bij verschillende sociale taken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Europese honingbij (Apis mellifera L.) is een insect eusociale en vrouwelijke bijen Toon kaste-afhankelijke reproductie en leeftijd-afhankelijke verdeling van de arbeid. Bijvoorbeeld in de steriele kaste van bijen hierna aangeduid als "werknemers", voedt jongere personen de broedsels, terwijl oudere nectar en pollen buiten de korf-1 voedergewassen. Leren en geheugen, vermogen is kritisch belangrijk in het leven van de honingbij, omdat foragers moet herhaaldelijk gaan heen en weer tussen voedselbronnen en hun nest en vervolgens de locaties van goed voedselbronnen aan hun nestmates door middel van dans communiceren mededeling1. Vorige studies aangetoond dat de MB, een hogere centrum van de hersenen bij insecten, bij de mogelijkheid van het leren en geheugen van de honingbij2,3,4 betrokken is. Differentially uitgedrukte genen en eiwitten zijn geïdentificeerd in verschillende hersengebieden van de honingbij5,6,7,8,9,10 ,11, suggereren dat ze gerelateerd zijn aan de unieke functies van elke regio van de hersenen. Hoewel de farmacologische remming of activering van een proteïne van belang een goed gebruikt aanpak is te onthullen van de functie van het eiwit in honingbij gedrag12,13,14, is het niet bekend of alle drugs functionele gevolgen hebben in verschillende gebieden van de hersenen van de honingbij. De validatie van de functies van dergelijke drugs zal versterken conclusies in studies van gedrags farmacologie.

Hier, richten we ons op PLC, één van de enzymen die betrokken zijn bij muis cognitie15,16,17,18. PLC triggers calcium signalering door vernederende phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2) in inositol-1,4,5-trisphosphate (IP-3) en diacylglycerol (DAG)19,20,21. IP-3 opent IP-3 receptoren op het endoplasmatisch reticulum (ER), wat leidt tot de vrijlating van calciumionen uit de ER. Het vrijgegeven calcium activeert zowel calcium/Calmoduline-afhankelijk proteïne kinase II (CaMKII) met Calmoduline en proteïne kinase, C (PKC) in aanwezigheid van de DAG. Beide kinases eiwitten zijn betrokken bij het leren en geheugen22,23, consistent met de betrokkenheid van PLC in dit proces. NV's zijn onderverdeeld in subtypes, waaronder PLCβ, PLCγ en PLCε, op basis van hun structuren20. Elk subtype PLC is geactiveerd in een andere context20en genen coderend voor deze subtypen worden differentieel uitgedrukt in verschillende weefsels. Wij eerder aangetoond dat honingbij MBs express genen coderend voor PLCβ en PLCε subtypen op een hoger niveau dan de resterende hersenen regio's24, en dat twee pan-PLC-remmers (edelfosine en neomycine sulfaat [neomycine]) afnemen PLC activiteit in verschillende regio's brain en, inderdaad, invloed hebben op het leren en geheugen van de honingbij24.

Traditioneel, heeft de enzymatische activiteit van PLC is gemeten met behulp van radiolabeled PIP225, waarvoor passende opleiding, apparatuur en faciliteiten. Onlangs, een synthetische fluorogenic substraat van PLC geweest gevestigde26, waardoor het gemakkelijk is om te beoordelen PLC activiteit in het standaard laboratorium. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te detecteren PLC activiteit in verschillende hersengebieden van de honingbij met behulp van het substraat fluorogenic en vervolgens de remmende effecten van edelfosine en neomycine op PLC in deze weefsels te testen. Omdat het protocol alleen elementaire manipulaties vereist, kan zij toepassing op studies van PLC activiteiten in andere weefsels of hersengebieden in bijen toegewezen aan verschillende sociale taken worden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. capture van foerageren honingbijen

  1. Aankoop van bijenvolken van een lokale distributeur.
  2. Met behulp van een insect net, vangen forager bijen die naar de korf met stuifmeel tassen op hun achterpoten terugkeren. De bijen overbrengen in een standaard 50 mL plastic conische buis en cap van de buis (Figuur 1). Zet de buis op ijs te anesthetize van de bijen.
    Opmerking: Draag de aangewezen jassen voor de bijenteelt te vermijden bijensteken. Verpleegkunde bijen kunnen ook worden verzameld zijn afhankelijk van het experiment. Te vangen de verpleegster bijen, observeren van het gedrag van de honingbij's op de wax kam en vangen verpleegkundige bijen, die hun hoofden in brood cellen steken te voeden van de larven, door de vleugel of borststuk met pincet. Dan, plaats de bijen in een plastic buis van 50 mL, cap de buis, en zet het op ijs zoals vermeld in stap 1.2.
  3. 12 foragers willekeurig vastleggen.
    Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van twee bijen per partij, wat resulteert in zes partijen. Meerdere bijen kunnen worden gevangen in een buis, en het aantal bijen in een enkele buis is niet belangrijk, zoals bijen in elke partij later worden gecombineerd (zie stap 3.1.1). Houd de buis-koel in de zomer, als de hoge temperatuur in de buis de bijen verwondt.

2. van honingbij hersendissectie

  1. Plaats in het laboratorium, de 50 mL-buis op ijs voor ten minste 30 min6 tot en met anesthetize van de bijen.
  2. Ter voorbereiding van de dissectie-fase, vouw een stukje tand wax in helft (de resulterende grootte is ongeveer 3.5 x 7,5 cm) en duw in een kunststof schotel (60 x 15 mm).
    Opmerking: De gevouwen was stevig houdt de insect pins.
  3. Onder een binoculaire loep, scheiden de bee's hoofd van zijn lichaam met een pincet en repareren op de tandheelkundige was door het invoegen van insect pins aan de basis van elke antenne aan houd de voorste van het hoofd in een opwaartse positie(Figuur 2).
    Opmerking: Wassen het pincet vóór gebruik, met behulp van ethanol of gesteriliseerd water.
  4. Giet genoeg zoutoplossing (0.13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl en 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) op het hoofd te bedekken. Doorboren het hoofd weer met de pinnen als het hoofd in de oplossing zweeft. Gebruik een ijskoude zoute oplossing, indien nodig.
    Opmerking: Dit protocol werkt echter zonder de koude zoutoplossing.
  5. Verwijder de antennes met pincet (Figuur 2B).
  6. Maak een horizontale snede in de buurt van de grondslagen van de antennes, en lengterichting op de grens van de samengestelde ogen, met behulp van een scalpel. Vervolgens maakt u een horizontale snede aan de bovenkant van het hoofd. Verwijder de cuticle een om venster te openen over de hersenen (Figuur 2C).
    Opmerking: Indien nodig, wassen de scalpel met ethanol of gesteriliseerd water vóór gebruik.
  7. Verwijder de retinae uit de ocelli en de tracheae op het voorste oppervlak van de hersenen, gebruik pincet (Figuur 2D).
  8. Vouw de snede op de rand van de samengestelde ogen dorsally en ventrally, met behulp van de scalpel(Figuur 2). Verwijder vervolgens het bindweefsel tussen de epidermis van de samengestelde ogen en retinae door het invoegen van het pincet direct onder de ogen cuticle (Figuur 2F).
  9. Gooi de epidermis van de samengestelde ogen. De dorsale toppen van de retinae van de samengestelde ogen halen met een pincet en verplaats de pincet in de ventrale richting zorgvuldig schil af de retinae (Figuur 2G).
  10. Verwijder voorzichtig de resterende tracheae op het voorste oppervlak van de hersenen, gebruik pincet (Figuur 2H).
  11. Knip het bindweefsel tussen de hersenen en rond de weefsels, gebruik pincet, en ontleden de hersenen van de hoofd capsule (Figuur 2H).
  12. Afschilferen van de tracheae op het achterste oppervlak van de hersenen, met behulp van het pincet (Figuur 2ik).
  13. Met behulp van een scalpel, snijd de verbinding tussen de MBs en andere hersengebieden naast de verticale lobben, die een onderdeel van de MBs (Figuur 2J zijn).
  14. Plaats de ontleed MBs en resterende hersenen weefsels in 1.5-mL buizen en snel bevriezen ze met droog ijs of vloeibare stikstof (Figuur 2K). De bevroren weefsels bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
    Opmerking: Omgaan met vloeibare stikstof met de aangewezen handschoenen en ventilatie koude branden en verstikking te voorkomen. Droogijs moet ook zorgvuldig worden behandeld met handschoenen. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De dissectie en de opslag van de hersenen weefsels moeten worden uitgevoerd een honingbij tegelijk om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit.

3. voorbereiding van de hersenen Homogenates

  1. Voeg 10 µL van homogenisering buffer bestaande uit 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl en 1,0 mmol/L CaCl2 naar de bevroren brain weefsel en meng het weefsel in de 1.5-mL-buis door handmatig toe te passen druk met een kunststof stamper. Lijn van het weefsel ten minste 200 x.
    Opmerking: Voer de manipulaties zoals beschreven in sectie 3 op ijs. Gebruik een stamper passend recht in de buis voldoende smash de weefsels, die gemakkelijk zweven in de homogenisering buffer.
    1. Breng de oplossing van de gehomogeniseerde weefsel aan het volgende weefsel in de lot en meng het weefsel op dezelfde manier.
      Opmerking: De honingbijen in elke partij worden gecombineerd bij deze stap. Dit protocol maakt gebruik van zes vele.
  2. Voeg 30 µL van de homogenisering buffer.
  3. Centrifugeer het gehomogeniseerde weefsel monster gedurende 10 minuten op ongeveer 900 x g27 en 4 ° C.
  4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 1.5-mL-buis en Centrifugeer het opnieuw gedurende 20 min op ongeveer 9,500 x g27 en 4 ° C.
  5. Plaats de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1.5-mL-buis. Het bewaren van het homogenaat bij-20 ° C tot gebruik.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  6. Bepaal de concentratie van de eiwitten met behulp van de bicinchoninic zuur (BCA) bepaling.
    1. Verdun 2,5 µL van het homogenaat met 17,5 µL van gesteriliseerd water (dus verdunnen het homogenaat acht maal) en alle de verdunde homogenaat gebruiken.
      Opmerking: Bemonstering homogenaat met behulp van een micropipet moet zorgvuldig uitgevoerd worden vanwege haar hoge viscositeit.
    2. De BCA-bepaling met behulp van 0, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 en 2,0 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) in 20 µL als normen uit te voeren.
      Opmerking: Veranderen de omvang van de BCA-bepaling indien nodig, op basis van het volume van het homogenaat en standaard monsters. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. PLC reactie in de hersenen Homogenates

  1. De stockoplossing van de fluorogenic substraat WH-1526 opgelost in gesteriliseerd water op 50 µmol/L voor te bereiden en op te slaan bij-80 ° C.
    Opmerking: Betrekking hebben op de oplossingen met het substraat met folie om te voorkomen dat vervagen.
  2. Voorbereiden van het voormengsel reactie in het vereiste volume voor het bereiken van de volgende samenstelling in 10 µL van reactiemengsel: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2.0 mmol/L dithiothreitol, 50 mg/L BSA en 12,5 µmol/L WH-15.
  3. Verdun het homogenaat met homogenisering buffer, indien nodig.
  4. Meng de reactie voormengsel en homogenaat met 1.3 µg van eiwitten in een polymerase-kettingreactie (PCR) buis tot een eindvolume van 10 µL van het reactiemengsel.
    1. Twee soorten controle mengsels voor te bereiden voor de statistische analyse: de homogenaat maar niet WH-15 in mengsel (controle mengsel 1), en vice versa (controle mengsel 2).
      Opmerking: De reactie mengsels en controle mengsels op ijs ter voorkoming van eiwit-afbraak- en reactieproducten van PLC voorbereiden. Controle mengsels 1 en 2 worden gebruikt voor het detecteren van fluorescentie van het homogenaat en vrije substraat, respectievelijk.
  5. Leegmaken van de buis en het broeden in een thermische cycler gedurende 30 minuten bij 25 ° C.
  6. Zet de reactie stop door toevoeging van 2 µL van 25 mmol/L ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur.
    Opmerking: Juiste eiwit bedragen en reactietijden verschillen experimenten. Dus, voor het optimaliseren van de conditie van de reactie, kan het nodig zijn de procedures die zijn beschreven in stap 4.1-5.3 in de voorbereidende experimenten door het veranderen van het eiwit bedrag en incubatie tijd totdat de fluorescentie lineair verhoogt herhalen. Ter referentie, wanneer de homogenaat afgeleid uit de andere hersengebieden wordt gebruikt, werkt de reactie meestal lineair met 1.3 µg of minder eiwitten binnen 30 min, maar de lineariteit afneemt ten minste 2.7 µg eiwitten hetzij met een incubatietijd van 90 min of lo nger.

5. opsporing van fluorescentie die voortvloeien uit de activiteit van de PLC

  1. Centrifugeer het reactiemengsel en controle mengsels voor 5 min op ongeveer 310 x g28 en 10 µL van het supernatans overbrengen in verschillende putten op een 384-well microplate die van toepassing zijn voor de detectie van de fluorescentie.
    Opmerking: Om te voorkomen dat fading en een verontreiniging met stof, betrekking hebben op de plaat met folie.
  2. Spoel de microplate met behulp van een centrifuge voor de microplate.
  3. Zet de plaat in een microplate-lezer en fluorescentie met een technische drievoud detecteren.
    Opmerking: De excitatie en emissie golflengten zijn 344 nm en 530 nm, respectievelijk. Indien van toepassing (afhankelijk van de microplate-lezer), meng het mengsel van de steekproef voor 5 s vóór elke detectie. Het protocol kan hier worden gestopt.

6. test van de remmende werking van farmacologische agenten

  1. Bereiden van stamoplossingen van edelfosine en neomycine bij de juiste concentraties en hen bewaren tot gebruik: edelfosine op 5,0 mmol/L en -20 ° C; neomycine bij 550 mmol/L en 4 ° C.
  2. Bij de voorbereiding van het voormengsel reactie, zoals beschreven in stap 4.2., remmers toevoegen aan het voormengsel tot de juiste eindconcentraties: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomycine, 0.55 mmol/L.
  3. Voeg het homogenaat aan de reactie voormengsel en passende controle mengsels zoals in stap 4.4.
    1. Drie soorten controle mengsels bereiden: het homogenaat en remmer, maar niet het substraat gebracht met controle mengsel 1; toevoegen van het substraat en remmer maar niet het homogenaat in controle mengsel 2; en zet de Inhibitor van de omwenteling, maar niet het homogenaat of substraat in controle mengsel 3.
  4. De reactie van de PLC en detectie van fluorescentie zoals beschreven in stappen 4.5-5.3 uitvoeren.

7. statistische analyse

  1. Voor de detectie van PLC activiteiten met behulp van de mengsels zoals beschreven in sectie 4, berekenen de fluorescentie verkregen door aftrekken van de fluorescentie die wordt uitgestoten uit de homogenaat of vrije substraat als volgt van de reactie tussen PLC en het substraat.

    FL (PLC activiteit) = Fl (reactie mix) - {Fl (CTRL + 1) + Fl (CTRL + 2)}
    ​
    Opmerking: Fl (PLC activiteit), Fl (reactie mix), Fl (CTRL + 1) en Fl (CTRL + 2) duiden bona fide fluorescentie afgeleid van PLC activiteit, fluorescentie gedetecteerd in het reactiemengsel en controle mengsels 1 en 2, respectievelijk.
    1. Na de meting van fluorescentie in de mengsels zoals beschreven in stappen 4.1-5.3, Fl (PLC-activiteit) worden berekend volgens de vergelijking in stap 7.1, en vervolgens het gemiddelde Fl (PLC activiteit) van de technische drievoud voor elke homogenaat.
    2. Met behulp van de gemiddelde Fl (PLC activiteit) van de technische drievoud verkregen in stap 7.1.1, berekenen opnieuw de gemiddelde Fl (PLC activiteit) van biologische wordt gerepliceerd van de MBs en andere hersengebieden en vergelijken de waarden tussen de weefsels van de hersenen.
  2. Voor de behandeling van PLC activiteit in aanwezigheid van remmers met behulp van de mengsels zoals beschreven in sectie 6, berekenen de fluorescentie als volgt afgeleid uit de reactie tussen de homogenaat, substraat of remmer.

    FL (PLC activiteit met remmer) = Fl (reactie mix) - {Fl (CTRL + 1) + Fl (CTRL + 2)} + Fl (CTRL + 3)

    Nota: Hier, Fl (PLC activiteit met remmer) is bona fide fluorescentie die voortvloeien uit PLC activiteit in aanwezigheid van de Inhibitor van de omwenteling. FL (reactie mix), Fl (CTRL + 1), Fl (CTRL + 2) en Fl (CTRL + 3) zijn fluorescentie signalen gedetecteerd in het reactiemengsel, controle mengsel 1, controle mengsel 2 en controle mengsel 3, respectievelijk.
    1. Na de meting van fluorescentie in de mengsels zoals beschreven in stappen 6.1-6.4, Fl (PLC activiteit met remmer) worden berekend volgens de vergelijking in stap 7.2. Vervolgens krijgen de gemiddelde Fl (PLC activiteit met remmer) van de technische drievoud voor elke homogenaat.
    2. Met behulp van de gemiddelde waarde berekend in stap 7.2.1, berekenen het gemiddelde Fl (PLC activiteit met remmer) van biologische replicatieonderzoeken afgeleid van elke hersenweefsel. Vergelijk de Fl (PLC activiteit met remmer) en de Fl (PLC activiteit) in stap 7.1.2 in elke hersenweefsel verkregen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De concentraties van de eiwitten in de hersenen Homogenates:
Wij homogenates met behulp van forager bijen. De berekende eiwit-concentraties in de oorspronkelijke homogenates zijn afgebeeld in Figuur 3. De geschatte eiwit-concentraties in de oorspronkelijke homogenaat waren als volgt: 1,5 mg/mL in de MBs en 2.3 mg/mL in andere hersengebieden. We gebruikten twee bijen per partij en zes veel werden geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het biochemisch onderzoek van eiwit activiteit is uiterst belangrijk voor het begrip van de moleculaire signalering in de hersenen, omdat de activiteit van het enzym wordt beïnvloed door verschillende moleculen, zoals substraten en inhibitors, en dus mee kunt wijzigen dierlijk gedrag (b.v., leren en geheugen)5. In studies van de honingbij, worden enzymen zoals cyclisch AMP-afhankelijk proteïne kinase A, cyclisch GMP-afhankelijk proteïne kinase PKC, gefosforyleerd CaMKII en adenylaat cycla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 4B - 4 D werd van Suenami et al. gewijzigd 24 met toestemming van Open biologie. De auteurs zijn dankbaar aan de uitgever voor de machtiging. Dit werk werd gesteund door het Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) Shota Suenami en Ryo Miyazaki.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227Het reagentenkit voor het meten van de eiwitconcentratie
Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mLThermoFisher Scientific23209De standaardmonsters die worden gebruikt in BCA-test
ParaffinewasGC13B1X00155000141Tandwas die wordt gebruikt als dissectiestadia
InsectpinShigaNr. 0Roestvrij, vaste kop
PLCglowKXT BioKCH-0001Een fluorogeen substraat van PLC
384-well microplateCorning4511Plate met laag volume en ronde bodem in zwarte kleur
Gemini EM microplate readerMolecular Devices
EdelfosineSanta Cruz Biotechnologysc-201021pan-PLC remmer
NeomycinesulfaatSanta Cruz Biotechnologysc-3573pan-PLC remmer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
  2. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3(2008).
  3. Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
  4. Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
  5. Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
  6. Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
  7. Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408(2009).
  8. Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213(2010).
  9. Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732(2013).
  10. Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
  11. Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841(2016).
  12. Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
  13. Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
  14. Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
  15. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  16. Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
  17. Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
  18. Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986(2015).
  19. Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
  20. Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
  21. Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
  22. Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
  23. Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
  24. Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
  25. Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
  26. Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
  27. Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
  28. Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
  29. Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
  30. Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
  31. Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
  32. Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
  33. Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Honingbijbreinfluorogeen substraatpaddenstoelenlichaamPLC inhibitieweefseldissectiefluorescentiekwantificeringfarmacologische analyseneurowetenschap van de honingbij

Gerelateerde artikelen