Hier beschrijven we een eenvoudige methode om te induceren van klinisch relevante huid decubitus (PUs) in een muismodel van dwarslaesie (SCI). Dit model kan worden gebruikt in pre-klinische studies naar scherm voor verschillende therapeutics voor genezing PUs in SCI patiënten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Decubitus (PUs) zijn gemeenschappelijk invaliderende complicaties van traumatische dwarslaesie (SCI) en de neiging om het optreden in zachte weefsels rond benige uitsteeksels. Er is echter weinig bekend over de invloed van het GCB op huid wond genezing in de context van diermodellen in gecontroleerde experimentele instellingen. In deze studie wordt een eenvoudige, niet-invasieve, reproduceerbare en klinisch relevante muismodel van PUs in het kader van de volledige SCI gepresenteerd. Volwassen mannelijke muizen (Balb/c, 10 weken oud) waren geschoren en onthaard worden. Na ontharing (24u), muizen werden onderworpen aan laminectomie gevolgd door volledige ruggenmerg transect (T9-T10 wervels). Onmiddellijk na, was een vouw van de huid aan de achterkant van de muizen opgeheven en ingeklemd tussen twee magnetische schijven op zijn plaats voor de volgende 12 h, waardoor een ischemische gebied dat zich ontwikkeld tot een PU in de volgende dagen gehouden. De gewonde gebieden aangetoond weefsel oedeem en epidermale verdwijning door dag 3 na magneet toepassing. PUs spontaan ontwikkeld en genezen. Genezing was, echter langzamer in de SCI muizen vergeleken om te beheren niet-SCI muizen wanneer de wond is gemaakt onder het niveau van SCI. omgekeerd, werd geen verschil in genezing gezien tussen SCI controle niet-SCI muizen en wanneer de wond is gemaakt boven het niveau van SCI. Dit model is een potentieel nuttig instrument om te bestuderen van de dynamiek van huid PU ontwikkeling en genezing na SCI, evenals over het testen van therapeutische benaderingen die kunnen helpen deze wonden helen.
Inleiding
Decubitus (PUs) zijn grote secundaire complicaties van traumatische SCI1. PUs zijn gelokaliseerde verwondingen aan de huid en/of de onderliggende weefsels, die meestal na verloop van benige uitsteeksels waar lichaamsgewicht is geconcentreerd optreden, terwijl de patiënt is zittend of liggend1. De huid vet en de spieren worden blootgesteld aan deze constante druk die tot de ontwikkeling van gelokaliseerde ischemie, ontsteking van het weefsel, mechanische schade en necrose2,3 leidt.
De ontwikkeling van PUs is beïnvloed door een aantal lokale factoren, met inbegrip van de grootte van de druk en shear, duur, huid vocht en temperatuur, letsel levensduur en algemene huid hygiëne laden. Er zijn ook systemische factoren die een rol, zoals de algemene lichamelijke conditie, bot en spier weefsel morfologie en sterkte4patiënten leeftijd, hematologische maatregelen, gender en zelfs sociaal-economische factoren spelen, met inbegrip van burgerlijke staat, onderwijs, en inkomen4,5.
De preventie en behandeling van PUs blijven belangrijke uitdagingen bij SCI patiënten. SCI patiënten ontwikkelen PUs in ~ 30-40% van de gevallen met een tarief van de re-voorkomen van 60-85%, wellicht als gevolg van de zwakke littekenweefsel en gebrek aan beschermende sensatie1. Dus, PUs leidt vaak tot opnieuw ziekenhuisopname van SCI patiënten, en over het geheel genomen vormen een aanzienlijke financiële last (80% meer vs. SCI alleen) naar de gezondheidszorg systeem5,6,7,8,9 , 10.
Tot de beste van onze kennis, zijn er geen studies in gecontroleerde experimentele instellingen te onderzoeken van het effect van het GCB op het genezingsproces van PU vanwege het gebrek aan geschikte diermodellen. Hier, wordt een reproduceerbare en klinisch relevante muismodel van PU in de huid beschreven. Dit model kan worden gebruikt om te studeren van de dynamiek van PU begin- en latere genezing, alsmede om te testen potentiële therapeutische benaderingen ter voorkoming van PU of verbeteren van PU genezing in de context van SCI.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren omgaan en chirurgische ingrepen werden uitgevoerd overeenkomstig een protocol goedgekeurd door de Rutgers Universiteit institutionele Animal Care en gebruik Comité. Muizen werden gevoed standaard voeding en water ad libitum.
1. bereiding van chirurgische en niet-chirurgische instrumenten
- De chirurgische en niet-chirurgische instrumenten in een autoclaaf steriliseren.
- Schoonmaken van het chirurgische operatietafel met 70% ethanol en warm een verwarming pad tot 37 ° C.
- Plaats de verwarming pad op de operatietafel en bedek het met steriele afdeklakens.
Opmerking: In alle procedures van de overleving, wordt de "No-Touch"-techniek hier gebruikt om de steriliteit.
2. voorbereiding van de dieren en het uitvoeren van de T9-T10 spinale laminectomie
- Volwassen (Balb/c) 10-week-oude mannelijke muizen aanschaffen. Verdoving in elk dier de begin van een inhalator met 5% Isofluraan veroorzaken, en vervolgens dalen tot 2-3% te handhaven van sedatie voor de rest van de procedures.
- Bevestig volledige verdoving door aanleiding kunnen geven tot geen reactie is op een staart/paw snuifje geïnduceerde Nociceptie stimulatie.
- Scheren van het haar over het dorsum (kop tot staart) met een elektrische clipper, en vervolgens toepassen de ontharende room (3 min) als u wilt verwijderen van de resterende haren. Tot slot was het dorsum met stromend water/nat scrub en de dieren terugkeren naar hun kooien.
Opmerking: Dit is nodig om het vermijden van extra irritatie van de huid en chemische verontreiniging op het moment van huid verwonding - De volgende dag, toepassing ophthalmic zalf op het hoornvlies te beschermen de ogen tegen het drogen tijdens de chirurgische ingreep en dan, scrub de huid met 3 alternatieve voorbereidingen van betadine scrub en 70% ethanol.
- Met een scalpel, uitvoeren van een huid incisie (~1.0-1.5 cm) langs de middellijn aan de achterzijde op het niveau van T8-T12 wervels.
Opmerking: Het niveau van de wervels wordt geïdentificeerd door het terug tellen de wervel van T13 met behulp van de locatie van drijvende ribs die met T13 wervel11,12 corresponderen. - Schakel het onderhuidse vetweefsel om toegang tot de paraspinal spieren en vervolgens ontleden ze langzaam om de spinous processen en laminae aan beide kanten bloot te stellen.
Opmerking: Doen deze procedure zeer zorgvuldig om te voorkomen dat overtollige bloeden of schade aan het ruggenmerg, op dit punt. - Een laminectomie blootstellen het ruggenmerg (T9-T10 wervels) door het voorzichtig peeling uit de spinale lamina microdissecting pincet gebruiken uitvoeren
Opmerking: Voer de laminectomie zodat een overmaat van het ruggenmerg is blootgesteld aan het vergemakkelijken van de oprichting van de schade. In de controlegroep, wordt alleen de laminectomie uitgevoerd.
3. uitvoeren van de Complete dwarslaesie van de T9-T10
- Met behulp van Tang, beveiligen de wervelkolom op T8 en lift omhoog te overdrijven de kromming van de wervelkolom.
- Met behulp van fijn schaar, sectie het ruggenmerg tussen de T9 en T10 wervel helemaal naar de bodem van het kanaal vertebral, om ervoor te zorgen volledige transect.
- Plak een stukje van onderhuids vet over deze laminectomie site voor extra bescherming voor het ruggenmerg vóór het sluiten van de chirurgische site na het observeren van de volledige transect onder een chirurgische Microscoop.
- Ten slotte sluit de wond en suture van de paravertebral spieren, oppervlakkige fascia, met behulp van continue hechtdraad en sluit vervolgens de huid met behulp van de12clips hechtdraad.
- Post-SCI, observeren de stoelgang op de eerstvolgende dag; echter de urineblaas worden beheerd door handmatige blaas evacuatie.
Opmerking: De Basso muis schaal (BMS) kan worden gebruikt om de voortgang van het stuk functionele herstel post-gcb op dag 2 en vervolgens per, Zie aanvullende figuur 111,12,13.
4. de inductie van cutane ulceratie van de druk na volledige SCI
- Onmiddellijk na de operatie van SCI, schrobben de achterkant van het dier met betadine en 70% alcohol.
- Voor een PU onder de SCI-site, injecteren in de dorsale huid in de buurt van het heiligbeen, een zeer kleine hoeveelheid (10 µL) 0,125% bupivacaine-oplossing met behulp van een 25 G naald equidistante plaatsen ~0.5-1.0 cm uit elkaar, in een ellips rond de magneet toepassing site.
Opmerking: Injecteren voor een PU boven de SCI-site, de dorsale huid in de buurt van de cervicale regio. - Zachtjes til een vouw van de huid op de rug van de muis en het sandwich tussen 2 magnetische schijven (5 × 12 mm diameter, 2,4 g/stuk, 3800 G magnetische kracht) (Figuur 1). 11 , 12
- Onmiddellijk na de toepassing van de magneet, terugkeer dieren naar één kooien geplaatst op weer een verwarming pad totdat volledige bewustzijn is (Figuur 1).
- Na 12 h van magneet toepassing, licht anesthetize dier met Isofluraan en verwijder de magneten. Neem een foto van de wond sites, om vast te leggen van de eerste verschijning van PU (dag 0 punt). Dekking van de wond met transparante dressing film (3M) drogen of besmetting te voorkomen.
5. post-operatieve dierenverzorgers, euthanasie en weefsel collectie voor histologie
- Onmiddellijk na de operatie, door het dier te injecteren met 1 mL van 0,9% zout subcutaan voor hydratatie.
- Subcutaan injecteren buprenorfine-SR (1 mg/kg) onmiddellijk voor analgesie.
- Injecteren subcutaan dierlijke dagelijkse meloxicam (1 mg/kg), en cefazolin (50 mg/kg gedurende 3-7 dagen), en tweemaal dagelijks handmatige blaas evacuatie.
- Plaats van dieren in één kooien en zorgen voor toegankelijke voedsel en water ad libitum. Muizen met volledige SCI kunnen lopen met behulp van hun voorpoten en aanpak van de voedsel en water zonder problemen.
- Verwijder chirurgische clips 7 dagen na de operatie van SCI.
- Op de gewenste tijdstippen na SCI en het verwonden van de huid, euthanaseren dieren na inademing CO2 (3-5 min), overeenkomstig de richtsnoeren van de AVMA inzake euthanasie14.
- Gewonde huid monsters verzamelen en oplossen in 10% formaline gedurende 24 uur op te slaan in 70% ethanol bij 4 ° C tot segmenteren.
- Voor het verwerken van weefsels, inbedden in paraffine en dunne gedeelten (5 µm) over een microtoom te genereren. Vlek met haematoxyline en eosine (H & E) te visualiseren weefsel morfologie (Figuur 3). Voor immunohistochemistry studies (Figuur 4), vlek secties met behulp van passende antilichamen voor Ki67 (proliferatie), CD31 (angiogenese), en alpha-gladde spier actine (α-SMA) zoals beschreven in Kumar et al.12
Opmerking: De software van de analyse van de afbeelding kan worden gebruikt te kwantificeren afbeelding functies12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol creëert een PU in de omgeving van volledige SCI. kort (zoals wordt geïllustreerd in Figuur 1), alle muizen met of zonder volledige SCI getolereerd de magneten heel goed, die bleef in hun originele positie voor de volledige 12u (figuren 1 c, 1 d, 1f, 1 h ). Alle de muizen ontwikkeld twee cirkelvormige wonden, gescheiden door een brug van normale weefsel (Figuur 1e, 1 g, 1i). Het initiële antwoord van ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol in deze studie beschrijft een nieuwe experimentele model van PUs te evalueren van het effect van het GCB op wondgenezing. De huid PUs waren geïnduceerde via een 12u-toepassing van twee 12 mm diameter schijf magneten op een dorsale huid vouw, boven of onder de SCI-site instellen. Gegevens blijkt dat SCI vertraagt huid wondgenezing in muizen. Nog belangrijker is, deze opmerkingen werden speciaal gemaakt in de huid onder het niveau van de innervatie arm van het GCB, wonden als wonden gemaakt boven het niveau va...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Commissie van de New Jersey op Spinal Cord Research (CSCR15IRG010), het Amerikaanse ministerie van defensie (SC160029) en de Yale departement van chirurgie Arbo Research Grant Program. Wij danken Sean o ' Leary van het W.M. Keck Center for Collaborative Neuroscience, Rutgers voor technische bijstand.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Magnets | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Magnetische kracht |
| Mice standard diet | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standaard voerpellet | |
| Isofluraan | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Beeldanalysesoftware | |
| BETADINE Surgical Scrub | HENRY SCHEIN Animal Health | ||
| Ophtalmisch zalf | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 008897 | |
| NAIR-haarverwijderingslotion | Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloxicam) Injectie | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 mL |
| Cefazolin-natrium | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 054846 | 1 g, 10 mL fles |
| Buprenorfine-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0,9% natriumchloride-injectie USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% neutraal gebufferd formaline | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C mannelijke muis | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Steriele katoenen applicator | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel-hechtklemmetjes | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Chirurgische hechtdraad, U.S.P. | Henry Schein Animal Health | 101-2636 |
Referenties
- Rappl, L. M. Physiological changes in tissues denervated by spinal cord injury tissues and possible effects on wound healing. International Wound Journal. 5 (3), 435-444 (2008).
- Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. Animal models in pressure ulcer research. The Journal of Spinal Cord Medicine. 30 (2), 107-116 (2007).
- Mak, A. F., Zhang, M., Tam, E. W. Biomechanics of pressure ulcer in body tissues interacting with external forces during locomotion. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 29-53 (2010).
- National Pressure Ulcer Advisory Panel. Prevention and Treatment of Pressure Ulcers: Clinical Practice Guideline. , Cambridge Media. Osborne Park, Western Australia. (2014).
- Marin, J., Nixon, J., Gorecki, C. A systematic review of risk factors for the development and recurrence of pressure ulcers in people with spinal cord injuries. Spinal Cord. 51 (7), 522-527 (2013).
- Krause, J. S. Skin sores after spinal cord injury: relationship to life adjustment. Spinal Cord. 36 (1), 51-56 (1998).
- Redelings, M. D., Lee, N. E., Sorvillo, F. Pressure ulcers: more lethal than we thought? Advances in Skin & Wound. 18 (7), 367-372 (2005).
- Kruger, E. A., Pires, M., Ngann, Y., Sterling, M., Rubayi, S. Comprehensive management of pressure ulcers in spinal cord injury: current concept and future trends. The Journal of Spinal Cord Medicine. 36 (6), 572-585 (2013).
- Lala, D., Dumont, F. S., Leblond, J., Houghton, P. E., Noreau, L. Impact of pressure ulcers on individuals living with a spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (15), 2312-2319 (2014).
- Li, C., DiPiro, N. D., Krause, J. A latent structural equation model of risk behaviors and pressure ulcer outcomes among people with spinal cord injury. Spinal Cord. 55 (6), 553-558 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on neovascularization and tissue granulation in mouse model of skin pressure ulcers. Journal of Neurotrauma. 34 (13), A72-A73 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Dash, B. C., Hsia, H. C., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on healing of skin ulcers in mouse models. Journal of Neurotrauma. 35 (6), 815-824 (2018).
- Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois, USA. (2013).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 17 (4), 221-227 (2004).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C., Rodeheaver, G. T. Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat. Wound Repair and Regeneration. 8 (1), 68-76 (2000).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 969618-969625 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
