Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

Samenvatting

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Samenvatting

De demonstratie van tyrosine kinase-remmers (TKIs) bij de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) heeft luidde een nieuw tijdperk in de therapeutiek van kanker. Echter, een kleine bevolking van cellen reageert niet op TKI behandeling, wat resulteert in minimale residuele ziekte (MRD); zelfs de meest potente TKIs ontbreek voor de uitroeiing van deze cellen. Deze cellen MRD dienen als een reservoir te ontwikkelen resistentie tegen therapie. Waarom TKI behandeling is niet effectief tegen MRD cellen is niet bekend. Groeifactor signalering is betrokken bij de ondersteuning van het voortbestaan van MRD cellen tijdens de TKI behandeling, maar een mechanistische inzicht ontbreekt. Recente studies aangetoond dat een verhoogde c-Fos en expressie van Dusp1 als gevolg van convergente oncogene en groeifactor signalering in MRD cellen TKI weerstand bemiddelen. De genetische en chemische remming van c-Fos en Dusp1 maakt van CML prachtig gevoelig voor TKIs en geneest CML in zowel genetische en gehumaniseerd Muismodellen. We deze doelgenen met behulp van meerdere microarrays van TKI-gevoelige en -resistente cellen geïdentificeerd. Wij bieden hier, methoden voor doel validatie met behulp van in vitro en in vivo Muismodellen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op geen doelstelling voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Inleiding

Constitutieve tyrosine kinaseactiviteit van BCR-ABL1 fusion oncogen veroorzaakt CML, waarmee een grondgedachte te richten op het kinaseactiviteit door klein molecuul remmers. Het succes van TKIs bij de behandeling van CML-patiënten een revolutie teweeggebracht in het concept van gerichte therapie^1,2. Anti-kinase therapie als precisie medicijn werd vervolgens ontwikkeld voor verschillende andere maligniteiten, met inbegrip van solide tumoren. Tot nu toe zijn meer dan dertig kinase-remmers goedgekeurd door de Verenigde staat FDA voor de behandeling van verschillende maligniteiten. Terwijl TKI behandeling zeer effectief is in het onderdrukken van de ziekte, is het niet curatief. Bovendien, een kleine populatie van kankercellen aanhoudt tijdens de behandeling: de MRD^3,4,5. Zelfs patiënten die volledige verlossing toonde zitten met MRD, die uiteindelijk resultaten in herval zo niet voortdurend onderdrukt. Daarom is de uitroeiing van MRD cellen die nodig zijn om een duurzaam of curatieve antwoord. CML vertegenwoordigt een waardevolle paradigma voor het definiëren van het concept van precisie geneeskunde, mechanismen van oncogenese, rationeel doel-directed therapeutiek, progressie van de ziekte en resistentie. Echter, zelfs vandaag de dag, het rijden van TKI-veroorzaakte celdood in kankercellen mechanisme niet volledig wordt begrepen, noch waarom MRD cellen (bestaat uit leukemische cellen van de stam [LSCs]) intrinsiek resistent zijn tegen TKIs^4,6. Niettemin, het verschijnsel van de "oncogen afhankelijkheid" mutant kinase oncoprotein is betrokken bij TKI werkzaamheid waar de acute remming van gerichte oncogen door TKIs veroorzaakt een oncogene schok die tot een enorme proapoptotic reactie of onbeweeglijkheid in cel leidt context-afhankelijke manier^6,7,8,9. De mechanistische onderbouwing van oncogen afhankelijkheid ontbreekt echter. Recente studies hebben betrokken dat groeifactor signalering oncogen afhankelijkheid intrekt en bijgevolg weerstand tegen TKI therapie^{10,11,12 verleent}. Daarom, om inzicht te krijgen in het mechanisme van oncogen afhankelijkheid, we uitgevoerd geheel-genoom expressie profilering van het BHG-ABL1 verslaafd en nonaddicted cellen (gegroeid met groeifactoren), waaruit bleek dat c-Fos en Dusp1 kritische bemiddelaars van zijn oncogen verslaving¹³. De genetische schrapping van c-Fos en Dusp1 is synthetische dodelijke tot de BCR-ABL1-uiting van cellen en de muizen gebruikt in het experiment deed niet leukemie te ontwikkelen. Bovendien genezen de remming van c-Fos en DUSP1 door een klein molecuul remmers CML BCR-ABL1-geïnduceerd in muizen. Uit de resultaten blijkt dat de niveaus van de expressie van c-Fos en Dusp1 de apoptotic drempel in kankercellen definiëren, zodanig dat lagere niveaus drug gevoeligheid, verlenen terwijl hogere weerstand tegen therapie¹³veroorzaken.

Ter identificatie van de genen die de afhankelijkheid oncogen rijden, wij meerdere geheel-genoom expressie profilering van experimenten in aanwezigheid van groeifactor en een TKI (imatinib) met behulp van de muis- zowel CML patiënt-afgeleide cellen (K562) uitgevoerd. Deze gegevens werden geanalyseerd in parallel met CML-patiënt gegevenssets verkregen CD34⁺ hematopoietische stamcellen voor en na behandeling met imatinib. Deze analyse bleek drie genen (een transcriptiefactor [c-Fos], dual specificiteit fosfatase 1 [Dusp1], en een RNA-bindende eiwit [Zfp36]) die worden meestal upregulated in TKI-resistente cellen. Voor het valideren van de betekenis van deze genen in de overdracht van resistentie, we stapsgewijze in vitro en in vivo analyse uitgevoerd. De niveaus van de expressie van deze genen werden bevestigd door real-time qPCR (RT-qPCR) en het westelijke bevlekken in resistente cellen. Verder, cDNA overexpressie en knockdown door shRNA haarspelden van c-Fos, Dusp1, en Zfp36 onthuld dat verhoogde c-Fos en Dusp1 expressies zijn voldoende en moeten verlenen TKI weerstand. Dus wij uitgevoerd een in vivo validatie met Muismodellen c-Fos en Dusp1 alleen. Voor de genetische validatie van c-Fos en Dusp1, we ROSACreERT-afleidbare c-Fos^fl/fl muizen (voorwaardelijke knockout)¹⁴ gemaakt en stak ze met Dusp1^{- / -} (rechte knockout)¹⁵ te maken ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} dubbel-transgene muizen. Beenmerg-afgeleide c-Kit⁺ cellen (vanaf c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}-, en c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) uitdrukken BCR-ABL1 werden geanalyseerd in vitro in een kolonie-vormende eenheid (CFU) assay, en in vivo door beenmergtransplantatie in dodelijk bestraalde muizen, voor het testen van de eis van c-Fos en Dusp1 alleen of samen in ontwikkeling van leukemie. Ook de chemische remmingen van c-Fos door DFC (difluorinated curcumine)¹⁶ en Dusp1 door het BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ werden getest in vitro en in vivo met BCR-ABL1-uiting, bot de cellen van het beenmerg-afgeleide c-Kit⁺ van de wild-type (WT) muis. Om te bevestigen de eis van c-Fos en Dusp1 in leukemische cellen van de stam, we gebruikt een CML muismodel waar BCR-ABL1 in de cellen van de stam specifiek was geïnduceerd door doxycycline (Tet-transactivator spreekt onder lymfkliertest stamcel leukemie (SCL) gen 3' enhancer verordening)^18,19. We gebruikten het beenmerg Lin^-Sca⁺c-Kit⁺ (STL) cellen van deze muizen in een in vivo transplantatie assay. Bovendien, wij gevestigd phopsho-p38 niveaus en de uitdrukking van IL-6 als farmaco-dynamic biomarkers voor Dusp1 en c-Fos inhibitie, respectievelijk, in vivo. Ten slotte uit te breiden van de studie voor menselijk relevantie, patiënt-afgeleide CD34⁺ cellen (gelijk aan de c-Kit⁺ cellen van muizen) werden onderworpen aan langdurige in-cultuur-initiëren cel vitrotests (LTCIC) en een in vivo gehumaniseerd muismodel van CML^20,21. De immunodeficiëntie muizen waren getransplanteerde met CML CD34 + cellen, gevolgd door de medicamenteuze behandeling en analyse van overleving van de menselijke leukemische cel.

In dit project ontwikkelen we methoden voor target identificatie en validaties zowel genetische en chemische hulpprogramma's, met behulp van verschillende preklinische modellen. Deze methoden kunnen met succes worden toegepast voor het valideren van andere doelen die ontwikkeling van chemische modaliteiten voor therapeutische ontwikkeling.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Menselijke specimens (normaal BM en dat van CML (p210-BCR-ABL +) leukemie) waren verkregen door middel van institutionele Review Board-goedgekeurde protocollen (institutionele Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) en donor geïnformeerde toestemming van de CCHMC en de Universiteit van Cincinnati.

1. real-time qPCR analyse

1. Isoleren totaal RNA van cellen van de BaF3 groeien in RPMI aangevuld met 10% FBS en 10% WEHI bezig geweest met het kweekmedium als een bron van interleukine-3 (IL-3).
2. Oogsten van de cellen in logaritmische fase (99% levend) uit behandelde (IL-3 en imatinib) en onbehandelde stalen en centrifugeer ze bij 435 x g gedurende 3 minuten. De gezondheid en de groeistadia van de cellen zijn kritisch als hun gen expressieprofielen drastisch kunnen veranderen.
3. RNA isoleren door het zuiveren van totale RNA²². Kwantificeren van de totale RNA; vervolgens, onverminderd het DNase behandeling²³. Converteren van gelijke hoeveelheden DNA-vrije RNA (2 µg) aan cDNA met reverse-transcriptase²⁴.
4. Uitvoeren van qPCRs met de gen-specifieke primers (tabel 1). Verrichten van PCRs in 20 µL reacties in 0,2 mL, dunwandige buizen van de PCR met optische doppen, met behulp van een polymerase van 1 x Meng (Zie Tabel of Materials), 0,5 µM voor elke primer, 1 µL van DNA, en water. Plaats van de reactie in de thermocycler met de volgende cyclus: stap 1, 95 ° C gedurende 10 minuten; Stap 2, 95 ° C gedurende 15 s; Stap 3 bij 60 ° C gedurende 1 min; Stap 4, herhaal de stappen 2-3 40 keer. Het uitvoeren van alle PCRs in triplicates en normaliseren van de real-time gegevens op de expressie van de β-actine vóór het plotten.

2. het westelijke bevlekken

Opmerking: Geheel-cel extracten werden voorbereid door het toevoegen van 250 µL 1 x lysis-buffermengsel, zoals beschreven in Kesarwani et al.¹³ aangevuld met proteaseinhibitor cocktail en fosfatase remmer cocktail 2.

1. Oogst vijf miljoen BaF3 cellen in logaritmische fase (99% levend) van behandeld (IL-3 en imatinib), alsmede van onbehandelde BaF3 cellen door centrifugeren bij 435 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Lyse de cellen in de lysis-buffermengsel (250 µL) door pipetteren op en neer 1 x, gevolgd door een 5 minuten incubatie bij 80 ° C. Bewerk ultrasone trillingen ten de lysate te breken alle het DNA met 5 – 6 pulsen van 5 s, elk in een koude kamer bij 4 ° C.
2. Breng de lysate tot een 1,5 mL koker en Centrifugeer het bij 16.000 x g gedurende 5 min voor het verwijderen van de onoplosbare materiaal. Het extract kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot gebruik. De monsters van de warmte tot 80 ° C gedurende 5 minuten in een warmte blok vóór het laden. Laden 10 µL van het monster met behulp van een gel-laden tip over 10% SDS-pagina gel.
3. De eiwitten bij 150 V oplossen totdat de kleurstof van de verwijzing de onderkant van de gel tot. Het eiwit overbrengen in nitrocellulose membranen door een elektroforetisch overdracht op 1 amp voor 1 h. Na de overdracht, blokkeren de membranen in 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing + 0,1% Tween-20 (TBST) met 5% non-fat melk voor 1 h en sonde 's nachts bij 4 ° C met de juiste antilichamen bij een verdunning 1:1,000.
4. Wassen van de membranen 3 x tot 5 x met TBST voor 10 minuten elk; vervolgens sonde met een HRP-geconjugeerde passende secundair antilichaam (1:5, 000 verdunning) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Het bedrag van TBST gebruikt, is afhankelijk van de grootte van de container. Zorg ervoor dat het membraan in TBST volledig onderdompelen. Wassen van het secundaire antilichaam 3 x voor elke 5 min met TBST.
5. Ontwikkelen van de vlek met behulp van substraat chemiluminescent reagens. Meng gelijke delen van het substraat en de buffer van de twee flessen, vlak voor gebruik. Het substraat toevoegen aan de bovenkant van het membraan te bestrijken het hele membraan met een pipet 1 mL en incubeer gedurende 1 minuut. De vlekken moeten worden beeld binnen 1 – 10 min van het toevoegen van het substraat.
6. Zorgvuldig het membraan plaats met botte pincet op het platform van de imaging systeem (Zie Tabel of Materials), het vermijden van veel van de vloeistof. Selecteer een live weergave en kies blots en chemiluminiscence in het menu. Met behulp van handmatige acquisitie, verwerven meerdere belichtingen op verschillende tijdstippen. Deze bestanden kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd aan de hand van beeldbewerkingssoftware.

3. productie van knock-out muizen

1. C-Fos^fl/fl muizen met ROSACreERT2 muizen voor het genereren van ROSACreERT2c-Fos^fl/fl muizen¹³steken. Als u wilt maken van de dubbel-knock-out (KO) muizen, broeden ROSACreERT2c-Fos^fl/fl muizen met Dusp1^{- / -} muizen voor het genereren van ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} muizen-¹³. Genotype de muizen door staart clips gevolgd door PCR, zoals hieronder beschreven.
2. Genotypering:
   1. Ter voorbereiding van het DNA, een klein deel van de staart knippen met een schaar en zet het in een 1,5 mL-buis. De staart met een verwarmde schaar uitbranden. Voeg 200 µL van 50 mM NaOH naar de geknipte staart in de buis en Incubeer bij 95 ° C in een blok van de warmte gedurende 1 uur.
   2. Vortex de buis goed en, vervolgens, te neutraliseren door toevoeging van 50 µL van 1 M Tris-HCl pH 6.8 en vortex opnieuw. Centrifugeer de buis bij maximumsnelheid voor 1 min.
   3. Verrichten van PCRs in 20 µL reacties in 0,2 mL, PCR dunwandige buizen met 1 x Taq polymerase master mix met kleurstof, 0,5 µM voor elke primer, 1 µL van DNA, en water. Plaatsen van de buizen in de thermocycler en voer de juiste cycli, zoals weergegeven in tabel 2.
   4. Voer het PCR product op 2% agarose gel en beeld met behulp van een documentatiesysteem gel.

4. isolatie van c-Kit⁺ cellen uit het beenmerg

1. De muizen volgens de richtlijnen van de institutionele offeren.
   Opmerking: Hier, de muizen werden blootgesteld aan kooldioxide (CO₂) op een volgens de AVMA aanbevolen debiet tot dood was vastgesteld door de beeïndiging van de ademhaling en hartslag, gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Oogst de beenbotten van de muis — twee dijbeen, twee zijn verbeend, twee iliacs. Schoon uit alle weefsels uit de botten door weg te schrapen met een scalpel. Zet de botten been in koude 1 x PBS op ijs — 5 mL in een tube van 15 mL. Giet de inhoud van de tube in een mortier en pletten met een stamper.
3. Filtreer de celsuspensie door een 70 µm cel zeef in een tube van 50 mL schroefdop met een 10 mL pipet vastgemaakt, met behulp van een precisiepipet. Het wassen van de mortier en een stamper meerdere malen met koud 1 x PBS, verzamelen en celsuspensie toe te voegen aan de tube van 50 mL. Spin down beenmerg bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. verwijderen het supernatant via een vacuüm met een glazen pipet gekoppeld. Suspendeer de pellet cel in 5 mL 1 x PBS met een pipet.
4. Met een pipet, Voeg langzaam geschorste beenmerg naar de top van 5 mL kamertemperatuur (de temperatuur is van cruciaal belang) polysucrose, met grote zorg niet te verstoren, de interface. Spin bij 400 x g bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met de rem uitgeschakeld.
5. Verzamelen van de interface bewolkt mono-nucleaire cel Totaal (TMNC) met een pipet en zet het in een nieuwe tube van 15 mL. Zodat het volume omhoog tot 10 mL met 1 x PBS voor het wassen, het nemen van 20 µL voor het tellen, en draaien op 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. negeren het supernatant en opslaan van de pellet op ijs voor stap 4.6.1.
6. Uitvoeren van c-Kit⁺ cel isolatie.
   1. Volg een microbead kit-protocol voor de c-Kit⁺ cel isolatie. Resuspendeer de pellet cel in 80 µL van EDTA, 1 x PBS + BSA naar 10⁷ cellen. Voeg aan de celsuspensie, 20 µL van CD117 MicroBeads/10⁷ totaal aantal cellen. Meng goed door vortexing en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Zodat het volume tot 10 mL door toevoeging van 1 x PBS + EDTA + BSA en draai bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
   2. Verwijder het supernatant via een vacuüm en opschorten van de cel pellet in 500 µL/10⁸ totaal aantal cellen in het EDTA, 1 x PBS + BSA. De magneet-standaard gebruiken met de magnetische kolom gekoppeld, voeg 3 mL 1 x EDTA, PBS + BSA en laat ze via de zwaartekracht in een tube van 15 mL collectie doorstromen.
   3. Zodra de eerste buffer toevoeging heeft gebeëindigd doorsnijdt de kolom, voeg de celsuspensie naar de kolom, zodat het via zwaartekracht in de tube van 15 mL collectie doorstromen. Deze flowthrough is de Fractie van de ongewenste cel.
   4. Was de kolom 3 keer met EDTA, 3 mL 1 x PBS + BSA elke keer, waardoor zij doorheen via zwaartekracht in de collectie-buis kan stromen. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats op de top van een tube van 15 mL.
   5. Voeg 5 mL 1 x EDTA, PBS + BSA en het onmiddellijk spoelen met de zuiger voorzien van de kolom. Verwijder de zuiger en herhaal de flush met een extra 5 mL 1 x EDTA, PBS + BSA. De cellen in het totale volume met behulp van standaardmethoden tellen.
   6. Draai naar beneden de cellen bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in volledige IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + [50 ng/mL] mSCF FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) voor cultuur. Cultuur die deze cellen overnachting in 2 x 10⁶ cellen/1 mL cel IMDM volledige media door ze te plaatsen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO₂.

5. signaaltransductie

1. Retrovirale plasmide transfectie
   1. Vers ontdooien HEK293 cellen de middag voordat in een waterbad ingesteld op 37 ° C. Draai de cryotube met de cellen van het HEK bij 435 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten verwijderen het supernatant via een vacuüm en het opschorten van de cel pellet in 1 mL van DMEM aangevuld met 10% FBS, glutamine, penicilline en streptomycine.
   2. Cellen tellen en het juiste volume toe te voegen aan een 10 cm behandeld dish (~ 4 x 10⁶ HEK293T cellen). 14 mL van de DMEM 10 media toevoegen aan de schotel en meng dit goed door te schuiven op en neer voor een gelijke verdeling. Plaats de schotel in een 37 ° C, 5% CO₂ incubator's nachts.
   3. Controleer op de volgende ochtend de samenvloeiing van de cellen onder een omgekeerde lichte Microscoop (50% of meer werkt goed).
   4. Combineren van het DNA (gewenste retrovirale plasmide), PclEco (verpakking plasmide) 2 M CaCl₂en H₂0 in een tube van 1,5 mL (= 500 µL) met behulp van een micropipet in de volgende bedragen: 7,5 µg DNA (BHG-ABL1-YFP), pCLeco, 62 µL van 2 M CaCl₂ 7,5 µg , en water tot een eindvolume van 500 µL. Voeg 500 µL van 2 x HBS tot een andere 1,5 mL koker.
   5. Voeg het DNA Meng ontkleuring aan de 1,5 mL-buis met 500 µL van 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES en 1,5 mM nb₂HPO₄) tijdens het mixen. Dit bereiken door een draaikolk instelt op de laagste snelheid en houd de buis van de HBS op het voor het mengen van de constante terwijl het toevoegen van de transfectie mix.
   6. Laat de mix van de Transfectie aan Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens de incubatie, 25 nM chloroquine toevoegen aan de cellen van het HEK en plaats ze terug in de incubator. Na de incubatie, de transfectie mix ontkleuring aan het HEK cellen toevoegen en vervolgens voorzichtig swirl de media om te mengen van de mix van de transfectie gedurende de plaat.
   7. Incubeer de cellen met de mix voor ~ 8 h in een 37 ° C, 5% CO₂ incubator. Media over deze cellen wijzigen door heel langzaam toevoegen 14 mL verse DMEM 10 media. Pipetteren langzaam tegen de muur van de schotel helpt te voorkomen dat eventuele strippen van de cellen van het HEK. Incubeer de cellen 's nachts in de 37 ° C, 5% CO₂ incubator.
   8. Het virale supernatant verzamelen met een 10 mL spuit, trekken de bovendrijvende vloeistof in de spuit en bijvoegen van de filter van de spuit 0,45 µm. Duik de virale bovendrijvende substantie in een nieuwe collectie buis. Neem de eerste collectie van virale supernatant ~ 16 h later.
2. De virale concentratie fibronectine en transductie
   1. Voeg 2 mL van een fragment van de recombinante menselijke fibronectine 0.1 mg in 1 x PBS op onbehandeld 6-well cultuur platen. Zoveel fibronectine zo nodig voor te bereiden, die afhangt van het aantal cellen en genotypen. Een goed genoeg kan transduce 10 miljoen c-Kit⁺ cellen. Incubeer de plaat 's nachts bij 4 ° C.
   2. De volgende dag, verwijder de fibronectine uit de putjes met een pipet, Pipetteer 2 mL steriele 2% BSA in 1 x PBS te blokkeren van de plaat, en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de BSA via een vacuüm en wassen grondig door pipetting 2 mL 1 x PBS en verwijderen via een vacuüm.
   3. Onmiddellijk toevoegen vers verzameld en gefilterd (0,45 µm) virale supernatant tot 5 mL. Centrifugeer bij 435 x g bij 32 ° C voor 2 h. Verwijder het supernatant via een vacuüm en herhaal deze stap met extra supernatans dat vers verzameld is virale en spin opnieuw. Verwijder het supernatant via een vacuüm en was de putjes goed door toevoeging van 2 mL 1 x PBS; Verwijder vervolgens het via een vacuüm.
   4. Voeg dat de c-Kit⁺ -muis cellen dat gekweekte overnachting (stap 4.6.6) de virale gecoate putjes door het mengen van de cel schorsingen goed en hen in de nu virale geconcentreerde fibronectine plaat pipetteren. Draaien op 1.200 x g bij 25 ° C gedurende 90 min. Zet de cellen in een 37 ° C, 5% CO₂ incubator.
   5. 48 h posttransduction, pellet de cellen door centrifugeren op 1200 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en resuspendeer hen in FACS buffer #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) 6 x 10⁶/mL. Het percentage positieve cellen BCR-ABL1 bepalen door het meten van het percentage van de YFP positief met behulp van stroom cytometry.
   6. Verwerven van gebeurtenissen met de standaardprocedure. Ten eerste poort de levende cellen op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter. Vervolgens poort de YFP positieve levende cellen met uitzondering van de YFP-negativecells bepaald door negatieve controle (Figuur 4).

6. kolonie-vormende UnitAssays

1. Ontdooi de methylcellulose met cytokines voor muis bij kamertemperatuur voor 1-2 h. aliquoot 3 mL methylcellulose in een FACS buis met een 5 mL injectiespuit zonder naald. De YFP-positieve cellen in een diasorteerderweergave cel sorteren.
2. Draai de cellen naar beneden en Suspendeer de pellet in IMDM volledige media. De cellen om te worden bekleed en Verdun te verkrijgen van 5.000 YFP-positieve cellen in 100 µL van de volledige media IMDM tellen.
3. Voeg 100 µL van de celsuspensie met 5.000 YFP-positieve cellen en de juiste remmers tot 3 mL van methylcellulose (Zie Tabel van materialen). Vortex op hoog te mengen het voor 10-30 s.
4. Nadat de meeste van de lucht bubbels zijn ontsnapt, kunt een 1 mL spuit 1 mL van de media in drie repliceren 3 cm platen plaat door het uitwerpen van het medium aan de ene kant en langzaam het kantelen van de plaat in een cirkelmotie te gelijkmatig verspreid.
5. De uiteindelijke concentratie van de remmers te gebruiken zijn imatinib op 3 µM, DFC op 0,2 µM en BCI op 0,5 µM, afzonderlijk of in combinaties. Waar nodig, de cellen met 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) toegevoegd aan de methylcellulose plating verwijderen c-Fos.
6. Na de beplating, zet de platen in een grote petrischaal met een open schaal met 2 mL steriel water in het midden. Dekken de grote petrischaal en zorgvuldig uit te broeden bij de 37 ° C, 5% CO₂ incubator. Record de nummers van de kolonie na een week van plating door te tellen het totale aantal kolonies onder een microscoop.
7. Het analyseren van een paar kolonies van passende platen voor c-Fos schrapping door PCR. De kolonies verzamelen door zuigen ze met een tip P1000. De cellen in 500 µL van 1 x PBS verjagen door de tip in de PBS meerdere keren wassen. Draai de schorsingen van de cel bij 6.000 x g gedurende 1 minuut en uittreksel van het DNA van de cel pellet met behulp van een genomic DNA isolatie kit.
8. Gebruik de genomic DNA voor PCR inleidingen mFos-FP3 en mFos gebruiken-RP5, zoals beschreven in tabel 2. Het analyseren van de PCR producten op een 2% agarose gel en beeld met behulp van een documentatiesysteem gel.
9. Vlek voor een grafische voorstelling van de kolonies, de kolonies, met behulp van Iodonitrotetrazolium chloride. Los 10 mg van de Iodonitrotetrazolium chloride in 10 mL water voor een oplossing van 1 mg/mL. Filter steriliseren de oplossing met een Luer-lock met een 0,2 µm filter gekoppeld aan een 10 mL spuit onder steriele omstandigheden in de kap van een weefselkweek.
10. In de weefselkweek kap, voeg 100 µL van de kleurstofoplossing ontkleuring rond de CFU plaat; Wees voorzichtig niet te glijden of verstoren van de koloniën. Incubeer de platen overnachting in een 37 ° C, 5% CO₂ cel cultuur incubator. De kolonies zal verkleuren en worden donker roodachtig bruin. Met behulp van een witte achtergrond in de kap van de steriele weefselkweek, neem foto's van de gekleurde CFU-plaat.

7. transplantatie en sterfte Assay

1. De muizen dodelijk te bestralen met split straling met behulp van een 137 Cs gebaseerde Gamma-ray bij een dosering van 7.0 Gy gevolgd door 4,75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h uit elkaar voordat de transplantatie.
2. Transplantatie van 4 x 10⁴ ongesorteerd YFP-positieve (berekend op basis van het percentage van YFP) cellen met 3 x 10⁵ normale beenmergcellen als een drager in elke muis via staart veneuze injectie.
3. Na een week van transplantatie, bepalen de engraftment door het analyseren van de YFP-positieve cellen uit het perifere bloed met behulp van FACS.
4. Het uitvoeren van een staart ader afloopgebied en FACS analyse.
   1. Warm de kooi van muizen onder een warmte lamp met de nodige voorzichtigheid niet te oververhitten of branden.
   2. Een muis in een muis afdekking bedwingen en nick de staart ader met een steriele mes. Zachtjes melk de staart van anterior to posterior, waardoor een druppel bloed te accumuleren. Verzamelen van het bloed met een heparinized capillair totdat het is gevuld (verzamelen rond 75-100 µL). Duik het bloed uit het gevulde capillaire buis in een bloed collectie buis met EDTA en meng goed.
   3. Lyse de RBC door toevoeging van 30 – 40 µL bloed aan 3 mL 1 x RBC lysis-buffermengsel (ammoniumchloride 150 mM, 10 mM kaliumbicarbonaat en 0.13 mM EDTA). Meng goed, omkeren van de buis meerdere keren. Incubeer bij kamertemperatuur voor 10 – 15 min. Spin bij 1.200 x g bij 4 ° C voor 5 min. Verwijder het supernatant via een vacuüm en Suspendeer de pellet in 2 mL 1 x PBS voor een wasbeurt.
   4. Draaien op 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en Suspendeer het in FACS buffer #1. FACS analyse uitvoeren zoals hierboven beschreven in stap 5.2.5–5.2.66. Op korte termijn winkel het resterende bloed in de buis van de collectie, die kan worden gebruikt voor diverse andere doeleinden, bij 4 ° C.
5. Getransplanteerde muizen die 10-40% YFP-positieve cellen in het perifere bloed toonde werden gebruikt voor het experiment. Muizen die had minder dan 2% van de YFP-positieve cellen werden uitgesloten van de studie.
6. Bereiden van tamoxifen bij 20 mg/mL in maïsolie bij 60 ° C met intermitterende vortexing totdat volledig is opgelost, en sla het bij 4 ° C in het donker voor de duur van de behandeling. Na een week van transplantatie, de c-Fos^fl/fl -allel te verwijderen door het injecteren van tamoxifen (100 mg/kg in maïsolie) intraperitoneally (i.p.) in de muizen, elke dag gedurende drie opeenvolgende dagen. Het is belangrijk dat de muizen worden gewogen om te bepalen hoeveel tamoxifen te injecteren. Na de behandeling met tamoxifen (in voorkomend geval), de muizen voor drug behandelingen groep (n = 5/groep).
7. De muizen voor leukemie progressie en overleving controleren en bepalen de leukemische last (YFP-positieve cellen door FACS) per tot acht weken in muizen te overleven.
8. Analyseer het bloed voor c-Fos verwijdering waar nodig, zoals hierboven beschreven in punt 6. Registreren van het aantal overlevende muizen dagelijks en uitzetten van de curve van de overleving aan het einde van het experiment met behulp van een grafische software.

8. transgene muizen Model van BCR-ABL1 leukemie

1. LSK isolatie
   1. De Scl-tTA transgene muizen op doxycycline chow om te voorkomen dat een expressie van BCR-ABL1 handhaven. Vier weken voor de transplantatie, nemen de muizen uit de doxycycline chow voor BCR-ABL1 expressie.
   2. Isoleren TMNCs van de Scl-tTA transgene muizen zoals hierboven beschreven in punt 4. Opschorten van de TMNCs in FACS buffer #2 (1 x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) te verkrijgen van 10⁶ cellen/mL.
   3. De TMNCs voor afkomst-positieve cellen afbreken door toevoeging van 10 µL van lineage cel detectie cocktail Biotine (Biotine-geconjugeerde monoklonale antistoffen tegen CD5 [rat IgG2a], CD11b [rat IgG2a], CD45R [B220] [rat IgG2a], Anti-7-4 [rat IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rat IgG2a], en Anti-Ter-119 [rat IgG2b]) per 1 x 10⁶ cellen. Incubeer de cellen bij 4 ° C voor 10 min in het donker, gevolgd door een wassen met 5 mL FACS buffer #2, en draaien op 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Aspirate het supernatant volledig en opschorten van de cellen in 400 µL van FACS buffer #2.
   4. 5 µL van anti-Biotine antilichaam-FITC-conjugaat, 1.2 µL van Ly-6A/E (Sca1) PECy7 en 2.4 µL van CD117 (c-Kit) APC antilichamen voor maximaal 10⁸ miljoen cellen toevoegen. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten wassen doordat het volume tot 5 mL met FACS buffer #2; vervolgens Centrifugeer bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet cel in 500 µL van FACS buffer #2.
   5. Filtreer de celsuspensie in een blauw filter-cap FACS buis.
   6. Gate levende cellen met behulp van voorwaartse en zijdelingse scatter. Selecteer vervolgens de lin^- -cellen die MFI toonde (betekenen van de intensiteit van de fluorescentie van minder dan 10²) om LSK cellen c-Kit⁺ en Sca1⁺ op een biexponential plot van het bovenliggende Lin^- , en sorteer ze (Figuur 7 C).
   7. Verzamelen van de gesorteerde cellen samen en centrifugeer ze bij 1.200 x g bij 4 ° C gedurende 5 min.
2. Transplantatie
   1. Dodelijk bestralen de BoyJ muizen met een split stralingsdosis van 7.0 Gy gevolgd door 4,75 Gy na 3 uur voor de transplantatie.
   2. Injecteren 3 x 10-³ op 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK cellen met 0,3 x 10⁶ helper beenmergcellen van WT BoyJ muizen via staart ader (i.v.) in het bestraalde BoyJ muizen.
   3. Vier weken posttransplantation, analyseren de ontvangende muizen voor CD45.1 en CD45.2. Het verkrijgen van de TMNC uit het perifere bloed door de staart ader bloeden zoals beschreven in stap 7.4. Resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS buffer. Incubeer de cellen met 1 µL van het FITC-CD45.1 en CD45.2-PE antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   4. Spoel de cellen doordat het volume tot 3 mL met FACS buffer en draaien op 1.200 x g bij 4 ° C voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer het in 200 µL van 1 x PBS.
   5. Analyseer het percentage op CD45.1 en CD45.2 door het eerste gating de levende cellen op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter, gevolgd door het gating FITC - en PE-positieve cellen op basis van het Onbevlekt monster.
   6. De muizen in vier groepen groeperen (n = 6 per groep). Begin van de behandeling met imatinib (75 mg/kg 2 x dagelijks) alleen en in combinatie met DFC + BCI (beide drugs kregen bij een dosis van 10 mg/kg 2 x dagelijks).
   7. Ook het behandelen van andere groepen met combinaties van imatinib (75 mg/kg) +++ curcumine (150 mg/kg) BCI (10 mg/kg) en imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) gedurende drie maanden, 2 x per dag, door ingespoten i.p.
   8. Analyseren van de muizen 1 x per maand voor zes maanden voor leukemische chimerism door bepaling van het percentage van CD45.2 positieve cellen in het perifere bloed door staart ader bloeden zoals beschreven in stap 7.4.

9. in Vivo evaluatie van BCI en DFC activiteit

1. Phospho-p38 analyse
   1. Neem drie leukemische muizen (8-12 weken oud), die met BCR-ABL1-uiting van c-Kit⁺ cellen, getransplanteerde waren zoals beschreven in paragraaf 7. Injecteer de muizen met BCI (10 mg/kg) door het injecteren van i.p. vier weken posttransplant.
   2. Het meten van phospho-p38 perifeer bloed TMNC met behulp van de fosforylatie stroom cytometry kit volgens de instructies van de leverancier. Het bloed van elke muis verzamelen voordat en 6 uur na de injectie van de drug. Isoleren van de TMNCs door uitputting van de RBC en als volgt corrigeren.
   3. Voeg 4 mL RBC lysis van de oplossing per 100 µL van perifeer bloed. Meng en incubeer op ijs voor 5 min lyse van de RBC. Spin down de cellen bij 1.200 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Herhaal de lysis 1 x meer.
   4. Na de tweede stap van de lysis van de cel pellets met 1 mL 2% BSA in PBS te wassen. Los van de cellen door toevoeging van 100 µL van fixatie en permeabilization oplossingen en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C in het donker. Pellet van de cel door centrifugeren op 1200 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   5. De pellets met 1 mL 1 x wassen van permeabilization wassen. Blokkeren van de cellen door het toevoegen van 300 µL van 2% BSA in permeabilization was buffer bij kamertemperatuur voor 20 min. de cellen verdelen in drie gelijke hoeveelheden van elk 100 µL (~ 1 x10⁶).
   6. Voeg 1 µL van totale p-38 antilichaam, 1 µL van phospho-p38 antilichaam of 1 µL van isotype IgG controle, respectievelijk aan elk aliquot van vaste cellen en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
   7. Wassen van de cellen 1 x met 5 mL 2% BSA in PBS en incubeer met secundair antilichaam (1 µL van Alexa Fluor-488 geconjugeerd) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De cellen 1 x weer wassen en hen op te schorten in 200 µL van 1 x PBS.
   8. De gegevens door FACS verwerven en analyseren door stroom cytometry analysesoftware.
   9. Aftrekken van de MFI's van het IgG-besturingselement aan de MFI van de experimentele monsters. De MFI-waarden van phospho-p38 zijn dan op die van totale p-38 om te bepalen van de phospho-p38 niveaus na de injectie BCI genormaliseerd.
2. Kwantitatieve gen expressie analyse van c-Fos doelgenen
   1. Neem drie leukemische muizen (8-12 weken oud), die met BCR-ABL1-uiting van c-Kit⁺ cellen getransplanteerde waren zoals beschreven in paragraaf 7. Het perifere bloed verzamelen van elke muis en vervolgens het injecteren van de muizen met 10 mg/kg elke DFC + BCI.
   2. Verzamelen het perifere bloed 6 uur na de injectie van de drug. Isoleren TMNCs door uitputting van de RBC, zoals hierboven beschreven. De TMNCs pellet en hen op te schorten in een fenol gebaseerde lysis-buffermengsel (Zie Tabel van materialen).
   3. Analyse van de RT-qPCR (zoals beschreven in sectie 1) uitvoeren voor Bcl2l11, Lif en IL-6 gen-specifieke primers (weergegeven in tabel 1) gebruiken.

10. langdurige cultuur-initiëren cel Assay

Opmerking: Een LTCIC test werd uitgevoerd zoals eerder beschreven²⁵.

1. Een muis fibroblast cellijn MS-5 in MEMα aan confluentie in een maatkolf van T175 weefselcultuur groeien. Trypsinize de cellen zoals hierboven beschreven voor HEK293T. Opschorten van de cellen in MEMα 2 x 10⁶ cellen/ml. Neem 10 x 10⁶ cellen in een conische tube van 50 mL en bestralen op 80 Gy. Verdun de cellen naar 0,5 x 10⁶ cellen/mL in MEMα aangevuld met 10% FBS (M10) media. Plaat van 2 mL per putje in een 12-well-plaat en het in een 37 ° C, 5% CO₂ incubator's nachts uit te broeden.
2. Op de volgende dag, bereiden de hydrocortison natrium hemisuccinate door ontbinding van 2,5 mg in 5 mL MEMα (1 M oplossing). Filter-steriliseren de hydrocortison oplossing 0,2 µm spuit u een filter gebruikt in de kap van de bioveiligheid. Verdun de hydrocortison door seriële verdunning in MEM te verkrijgen van een oplossing van 100 µM. Meng 250 µL van dit 25 mL menselijke op lange termijn kweekmedium (HLTM) (Zie Tabel van materialen) net vóór gebruik, om een eindconcentratie van 1 µM.
3. Draai de CML-CD34⁺ en UCP3 TMNCs schorten hen in de HLTM door korte vortexing en bepalen de graven door een hemocytometer.
4. Vacuüm uit de M10 media van de plaat van de 12-well bezaaid met stroma cellen en te vervangen door de 1 mL van patiënt cel (CML-CD34⁺ [10.000] en UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) schorsing in HLTM. Gebruik drie putten per drug combinatie per celtype.
5. Verdun de drugs voorraden tot 2 x van de vereiste concentratie in HLTM. 1 mL van de media met drugs aan de bovengenoemde cellen tot een concentratie van 1 x drug aan toevoegen. Vervang de helft van de media met vers bereide HLTM elke week gedurende vijf weken.
6. Aan het einde van de periode van zes weken LTC-IC assay, door nonadherent cellen in een buis uit de culturen te verzamelen. Trypsinize Adherente cellen en deze te combineren met de corresponderende nonadherent cellen.
7. Wassen van de cellen en assay voor CFUs in methylcellulose medium met 30% foetaal kalfsserum, Erytropoëtine (3 eenheden/mL), SF (50 ng/mL), en IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), en granulocyt/macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) (20 ng / mL). bepalen van de graven door een hemocytometer.
8. Plaat 5 x 10⁴ cellen in drie wordt gerepliceerd. Bevriezen van de resterende cellen in 20% FBS en 10% DMSO. Rangschik de platen in een grote petrischaal met een open schaal met water in het midden. Bedek de grote petrischaal zorgvuldig en Incubeer het in een 37 ° C, 5% CO₂ incubator voor twee weken.
9. Score van de kolonies twee weken later. In sommige gevallen is slechts een deel van de oogst vehiculumcontrolegroep CFUs). Bereken dat het totale aantal LTCIC aanwezig in de initiële celsuspensie door extrapolatie op basis van de CFUs verkregen uit deel van de oogst van de cel. De gemiddelde CFU output per LTC-IC is 8.
   Opmerking: Bijvoorbeeld, als het in eerste instantie 1 x 10⁶ cellen in een goed, na vijf weken, waren verguld 0,5 x 10⁶ cellen zijn geoogst, CFU, 5 x 10⁴ cellen werden verguld en 50 CFUs werden verkregen. Dit is gelijk aan 500 CFUs/1 miljoen vergulde cellen. Deelt u dit getal door 8 om het LTCIC, oftewel 62,5.

11. gehumaniseerd muismodel met behulp van CML CD34⁺ cellen

1. Sublethally het bestralen van de 8 weken oude knik scid gamma muizen, uitdrukken van menselijke IL3, GM-CSF en SCF (NSGS), met een enkelvoudige dosis van 7.0 Gy (700 rads) met 50 rads/min.
2. Injecteren van 3 x 10⁶ CD34⁺ geselecteerde cellen van BCR-ABL1-positieve CML chronische fase patiënten in de bestraalde muizen door intraveneuze injectie.
3. Na twee weken van transplantatie, bepalen leukemische engraftment in beenmerg door FACS met muis - en mens-specifieke antilichamen tegen CD45.
4. Een FACS analyses uit te voeren.
   1. Neem de beenmergaspiraat van het dijbeen van de getransplanteerde muizen. Lyse van RBC met behulp van RBC lysis buffer zoals hierboven beschreven en de TMNCs verzamelen door middel van centrifugeren. Wassen van de pellet 1 x met koude 1 x PBS.
   2. Blokkeren van de cellen met menselijke FcR blok en muis FcR blok gevolgd door kleuring met anti-mens CD45 FITC en anti-muis CD45 APC^Cy7 's nachts bij 4 ° C. De FACS analyses uit te voeren op LSRII en analyseren van gegevens met behulp van stroom cytometry analysesoftware.
5. De muizen in vier verschillende cohorten groep (n = 6/groep) voor de behandeling met voertuig, imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (beide op 10 mg/kg), of imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (beide op 10 mg/kg). Verdun de voorraad drugs in 1 x PBS (voertuig) en hen te beheren door het injecteren van hen i.p. 2 x dagelijks.
6. De muizen gedurende zes weken behandelen en bepalen de leukemische last om de twee weken, tot week acht na de transplantatie zoals hierboven beschreven in 11.4.

Resultaten

Oncogen verslaving heeft betrokken bij de therapeutische werking van TKIs. De besturen van de afhankelijkheid van oncogen mechanismen worden echter niet begrepen. Wij uitgevoerd meerdere onbevooroordeelde gen expressie analyses ter identificatie van de genetische component die betrokken zijn bij het orkestreren van de verslaving. Deze analyses bleek de opregulatie van drie genen, c-Fos, Dusp1 en Zfp36, in de kankercellen die niet oncogene signalering om te overleven afhankelijk zijn en, d...

Discussie

Voor het grootste deel van kankercellen, is het therapeutisch antwoord op TKI gemedieerd door een blokkade van de tyrosine-kinase-oncoprotein signalen waaraan de tumor verslaafd is. Echter is relatief weinig bekend over hoe een minderheid van kankercellen bij te dragen aan MRD de oncogen afhankelijkheid en therapie⁴ontsnappen. Recente studies is gebleken dat de groeifactor signalering medicamenteuse resistentie bij zowel de leukemie en de solide organ-tumoren bemiddelt. Dit suggereert dat verschil...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biologische materialen
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose voor muis CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose voor menselijke CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0,45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocellulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (chemiluminescentie substraat)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilisatie oplossing)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilisatie en wasoplossing voor fosfo flow)	BD	554723
fosfo p38	Cell Signaling Technologies	4511S
totale p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 geconjugeerd	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Bloed Capillaire buizen	Fisher	22-260-950
Bloed Collectie buis	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media voor LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insuline spuit 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor stamper	Coor tek