Method Article

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

DOI:

10.3791/58194

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De demonstratie van tyrosine kinase-remmers (TKIs) bij de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) heeft luidde een nieuw tijdperk in de therapeutiek van kanker. Echter, een kleine bevolking van cellen reageert niet op TKI behandeling, wat resulteert in minimale residuele ziekte (MRD); zelfs de meest potente TKIs ontbreek voor de uitroeiing van deze cellen. Deze cellen MRD dienen als een reservoir te ontwikkelen resistentie tegen therapie. Waarom TKI behandeling is niet effectief tegen MRD cellen is niet bekend. Groeifactor signalering is betrokken bij de ondersteuning van het voortbestaan van MRD cellen tijdens de TKI behandeling, maar een mechanistische inzicht ontbreekt. Recente studies aangetoond dat een verhoogde c-Fos en expressie van Dusp1 als gevolg van convergente oncogene en groeifactor signalering in MRD cellen TKI weerstand bemiddelen. De genetische en chemische remming van c-Fos en Dusp1 maakt van CML prachtig gevoelig voor TKIs en geneest CML in zowel genetische en gehumaniseerd Muismodellen. We deze doelgenen met behulp van meerdere microarrays van TKI-gevoelige en -resistente cellen geïdentificeerd. Wij bieden hier, methoden voor doel validatie met behulp van in vitro en in vivo Muismodellen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op geen doelstelling voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Constitutieve tyrosine kinaseactiviteit van BCR-ABL1 fusion oncogen veroorzaakt CML, waarmee een grondgedachte te richten op het kinaseactiviteit door klein molecuul remmers. Het succes van TKIs bij de behandeling van CML-patiënten een revolutie teweeggebracht in het concept van gerichte therapie1,2. Anti-kinase therapie als precisie medicijn werd vervolgens ontwikkeld voor verschillende andere maligniteiten, met inbegrip van solide tumoren. Tot nu toe zijn meer dan dertig kinase-remmers goedgekeurd door de Verenigde staat FDA voor de behandeling van verschillende maligniteiten. Terwijl TKI behandeling zeer ef....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Menselijke specimens (normaal BM en dat van CML (p210-BCR-ABL +) leukemie) waren verkregen door middel van institutionele Review Board-goedgekeurde protocollen (institutionele Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) en donor geïnformeerde toestemming van de CCHMC en de Universiteit van Cincinnati.

1. real-time qPCR analyse

  1. Isoleren totaal RNA van cellen van de BaF3 groeien in RPMI aangevuld met 10% FBS en ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oncogen verslaving heeft betrokken bij de therapeutische werking van TKIs. De besturen van de afhankelijkheid van oncogen mechanismen worden echter niet begrepen. Wij uitgevoerd meerdere onbevooroordeelde gen expressie analyses ter identificatie van de genetische component die betrokken zijn bij het orkestreren van de verslaving. Deze analyses bleek de opregulatie van drie genen, c-Fos, Dusp1 en Zfp36, in de kankercellen die niet oncogene signalering om te overleven afhankelijk zijn en, d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het grootste deel van kankercellen, is het therapeutisch antwoord op TKI gemedieerd door een blokkade van de tyrosine-kinase-oncoprotein signalen waaraan de tumor verslaafd is. Echter is relatief weinig bekend over hoe een minderheid van kankercellen bij te dragen aan MRD de oncogen afhankelijkheid en therapie4ontsnappen. Recente studies is gebleken dat de groeifactor signalering medicamenteuse resistentie bij zowel de leukemie en de solide organ-tumoren bemiddelt. Dit suggereert dat verschil.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn G. Q. Daley dankbaar voor het verstrekken van de BaF3 en WEHI cellen en T. Reya voor de MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP bouwt. De auteurs zijn M. Carroll dankbaar voor het verstrekken van de patiënt monsters uit de CML blast crisis. Deze studie werd ondersteund door subsidies te M.A. van de NCI (1RO1CA155091), leukemie Research Foundation en Stichting V en van de NHLBI (R21HL114074-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Materials
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
IMDMCellgro (corning)15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin FragmentTakaraT100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)Stem Cell3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)Stem Cell4434
4-HydroxytamoxifenSigmaH6278
Recombinant Murine SCFProspecCYT-275
Recombinant Murine Flt3-LigandProspecCYT-340
Recombinant Murine IL-6ProspecCYT-350
Recombinant Murine IL-7Peprotech217-17
DFCLKT Laboratories Inc.D3420
BCIChemzon ScientificNZ-06-195
ImatinibLC LaboratoryI-5508
CurcuminSigma458-37-7
NDGASigma500-38-9
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBSAtlanta biologicalS11150
Trypsin EDTA 1xCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutamineCellgro (corning)25-005-CL5 mg/mL stock in water
PuromycinGibco (life technologies)A11138-03
HEPESSigmaH7006
Na2HPO4.7H2OSigmaS9390
Protamine sulfateSigmaP33695 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (corning)25-950-CQC
WST-1Roche11644807001
0.45 μM acro disc filterPALL2016-10
70 μm nylon cell starinerBecton Dickinson352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)Simga1083
PBSCorning21040CV
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Protease Inhibitor CocktailRocheCO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2SigmaP5762
Nitrocullulose MembraneBio-Rad1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)Thermo Scientific34075
CD5eBioscience13-0051-82
CD11beBioscience13-0112-75
CD45R (B220)BD biosciences553092
CD45.1-FITCeBioscience11-0453-85
CD45.2-PEeBioscience12-0454-83
hCD45-FITCBD Biosciences555482
Anti-Biotin-FITCMiltenyi130-090-857 
Anti-7-4eBioscienceMA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)eBioscience13-5931-82
Anti-Ter-119eBioscience13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7BD 558612
CD117 APC BD 553356
BD Pharm LyseBD 555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)BD 554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)BD 554723
phospho p38Cell Signaling Technologies4511S
total p38Cell Signaling Technologies9212
Mouse IgG controlBD 554121
Alexa Flour 488 conjugated InvitrogenA-11034
Calcium ChlorideInvitrogenK278001
2x HBSInvitrogenK278002
EDTAAmbionAM9261
BSASigmaA7906
Blood Capillary TubesFisher22-260-950
Blood Collection TubeGiene Bio-One450480
Newborn Calf SerumAtlanta biologicalS11295
ErythropoieinAmgen5513-267-10
human SCFProspecCYT-255
Human IL-3ProspecCYT-210
G-SCFProspecCYT-220
GM-CSFProspecCYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)Stem Cell Technologies5100
Hydrocortisone Sodium HemisuccinateStem Cell Technologies7904
MEM alphaGibco12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2Becton Dickinson329461
Mortor pestleCoor tek 60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)Butler Schien29405
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicillinSigmaA0166100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)Difco214050
Terrific brothBecton Dickinson243820
AgaroseGenemateE-3119-500
Doxycycline chowTestDiet.com52662modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline 
TamoxifenSigmaT5648
Iodonitrotetrazolium chloride SigmaI10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kitQiagen69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)PromegaM1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)Qiagen217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)Ambion, Life TechnologiesAM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)Invitrogen18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)Bio-Rad1725270
CD117 MicroBead KitMiltenyi130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell AssayStemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubatorThermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810REppendorf
TC-10 automated cell counterBio-RAD
C-1000 Thermal cyclerBio-RAD
Mastercycler Real Plex 2Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)Bio-RAD17001401
Hemavet (boold counter)Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)BD 
Fortessa I (FACS analyzer)BD 
FACSAriaII (FACS Sorter)BD 
Magnet StandMiltenyi
Irradiator J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CAMark I Model 68Asource Cs 137
Mice
ROSACreERT2Jackson Laboratory
Scl-tTA Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6 Jackson Laboratory
NSGSmouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/flMade in house
Cells
BaF3Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHIGift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cellsUniversity Hospital, University of Cincinnati

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
  2. Druker, B. J., et al. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oncogene Dependencec Fos Dusp1Tyrosine Kinase InhibitorsChronic Myeloid LeukemiaMinimal Residual DiseaseBone Marrow IsolationMagnetic Activated Cell SortingRetroviral TransductionColony Forming Unit AssayRT qPCR Western Blot

Related Articles