Meting van de concentratie van de Ion in de ongemengde grenslaag met Open Patch-Clamp pipet: gevolgen in de controle van de ionenkanalen door Fluid Flow

Samenvatting

Mechanosensitive ionenkanalen worden vaak bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met patch-clamp opname. Afhankelijk van het experimentele protocol, kan de uitkomst op vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen echter onjuist. Hier, bieden wij methoden voor het voorkomen en corrigeren van dergelijke fouten met een theoretische basis.

Samenvatting

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-stimulans waarmee veel fysiologische en pathologische processen, zoals vloeibare stroom-geïnduceerde vasodilatatie. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistof stroom/schuifspanning kracht niet volledig begrepen worden, kan kritisch fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating bijdragen. Daarom, fluid flow/schuifspanning kracht gevoeligheid van ionenkanalen is onderzocht met behulp van de patch-clamp techniek. Afhankelijk van het experimentele protocol, kunnen de resultaten en de interpretatie van gegevens echter onjuist. Hier presenteren we experimentele en theoretische bewijzen voor fluid flow-gerelateerde fouten en voorzien in methoden voor het schatten, preventie en het corrigeren van deze fouten. Veranderingen in junction potentiële tussen de Ag/AgCl-elektrode en Baden vloeistof werden gemeten met een open pipet gevuld met 3 M KCl vloeistofstromen kan dan verschuiven de vloeistof/metaal junction potentiële tot ongeveer 7 mV. Omgekeerd, door het meten van de verschuiving van de spanning geïnduceerd door vloeistofstromen, geschat we de ion-concentratie in de ongemengde grenslaag. In de rusttoestand, kunnen de echte ion concentraties grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode of ion kanaal inlaat aan het celmembraan oppervlak bereiken zo laag als ongeveer 30% van die in de voorwaarde van de stroom. Plaatsen van een agarose 3 M kan KCl brug tussen de zwemwater-vloeistof en referentie-elektrode hebben verhinderd indien dit probleem van het verschuiven van potentiële junction. De ongemengde laageffect grenzend aan het oppervlak van de celmembraan kan echter niet worden vastgesteld op deze manier. Hier bieden we een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag met een pipet open patch-clamp, wijzend op het belang van het gebruik van een agarose zout-brug terwijl het bestuderen van de vloeistof stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. Dus, deze nieuwe aanpak, waarin rekening wordt gehouden met de reële concentraties van ionen in de ongemengde grenslaag, nuttig inzicht kan verschaffen over de proefopzet en interpretatie van de gegevens aan vloeistof schuifspanning verordening van ionenkanalen gerelateerde .

Inleiding

Vloeistofstromen is een belangrijke milieu-cue waarmee veel fysiologische en pathologische processen zoals fluid flow-geïnduceerde vasodilatatie en vloeistof schuintrekken kracht-afhankelijke vasculaire remodeling en ontwikkeling^{1,2, 3,4,5}. Hoewel de moleculaire mechanismen voor de biologische reacties op vloeistofstromen schuintrekken kracht niet helemaal begrepen zijn, gaat men ervan uit dat de fluid flow-gemedieerde regulering van ion kanaal gating kritisch tot de vloeistof stroom-geïnduceerde reacties^{5 bijdragen kan , 6 , 7 , 8}. bijvoorbeeld de activering van het endotheel innerlijke gelijkrichter Kir2.1 en Ca^{2 +}-geactiveerde K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) kanalen na Ca^{2 +} toestroom door vloeistofstromen heeft gesuggereerd om bij te dragen tot vloeistof stroom-geïnduceerde vasodilatatie^6,7,8. Daarom veel ionenkanalen, vooral mechanisch-geactiveerde of -geremde kanalen, zijn bestudeerd in termen van vloeistof stroom/schuifspanning kracht gevoeligheid met de patch-clamp techniek^{6,9,10 , 11}. afhankelijk van het experimentele protocol taakuit patch-clamp opnemen, uitkomsten en interpretatie van de gegevens op de vloeistof stroom-Reglement van ionenkanalen kunnen echter foutieve^10,11.

Een bron van vloeibare stroom-geïnduceerde artefacten in patch-clamp opname is vanaf de samenvloeiing potentiële tussen de Badvloeistof en Ag/AgCl referentie elektrode¹¹. Het is algemeen aangenomen dat de vloeistof/metaal-kruising potentieel tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode constant, is zoals de Cl^- -concentratie van de vloeistof zwemmen blijft constant, gelet op de chemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode te zijn:

AG + Cl^-↔ AgCl + elektron (e^-) (vergelijking 1)

Echter, in een geval waar de totale elektrochemische reactie tussen de zwemwater-oplossing en Ag/AgCl-elektrode (vergelijking 1) opbrengst van links naar rechts, de concentratie van de Cl^- van de Baden vloeistof grenzend aan de Ag/AgCl verwijzing elektrode (ongemengde grenslaag^12,13,14,15) wellicht veel lager dan die in de bulk van het zwemwater oplossing, tenzij genoeg convectional transport te waarborgen. Het gebruik van een oude of niet-ideale Ag/AgCl-elektrode met inadequate chlorering van Ag kan dergelijk risico verhogen. Deze vloeistof stroom-gerelateerde artefact op de referentie-elektrode, in feite, kan worden uitgesloten door het simpelweg plaatsen van een conventionele agarose-zout-brug tussen de Baden vloeistof en referentie-elektrode, aangezien het artefact is gebaseerd op wijzigingen in de reële Cl^- concentratie grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode¹¹. Het protocol gepresenteerd in deze studie beschrijft hoe te voorkomen van de mogelijke wijzigingen van de stroom-gerelateerde junction en meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag.

Na het plaatsen van een agarose KCl brug tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode, is er een andere cruciale factor die u moet overwegen: net zoals de verwijzing Ag/AgCl-elektrode fungeert als een Cl^- -elektrode, de ionenkanalen ook kunnen functioneren zoals een ion-selectieve elektrode. De situatie van een ongemengde grenslaag tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode ontstaat tijdens de beweging van ionen tussen de extracellulaire en intracellulaire oplossingen via het membraan ionenkanalen. Dit impliceert dat voorzichtigheid moet worden gebruikt wanneer de interpretatie van het Reglement van ion kanalen door vloeistofstromen. Zoals besproken in onze eerdere studie¹¹, de beweging van ionen via een oplossing waarin een elektrochemische gradiënt aanwezig is via drie verschillende mechanismen kan optreden: diffusie, migratie en convectie, waar diffusie de beweging is geïnduceerd door verloop van de concentratie, migratie is de beweging gedreven door elektrische verloop en convectie is het verkeer door middel van vloeistof-flow. Onder deze drie vervoer mechanismen, draagt convectie modus bij de meeste aan de beweging van ionen¹¹ (> 1.000 keer groter is dan de verspreiding of migratie onder gebruikelijke patch-clamp-instellingen). Dit vormt de theoretische basis van waarom junction potentiële tussen de Baden vloeistof en Ag/AgCl-elektrode kan zeer onder verschillende voorwaarden voor statische en vloeistof-flow¹¹.

Volgens de hypothese voorgesteld hierboven, sommige facilitatory effecten van vloeistofstromen op de huidige ionkanaal kunnen worden afgeleid uit de convectie restauratie van echte ion concentraties grenzend aan de inlaat van kanaal aan de oppervlakte van het membraan (ongemengde grenslaag) ¹⁰. In dit geval de vloeistof stroom-geïnduceerde effecten op ion kanaal stromingen zijn eenvoudigweg ontstaan uit elektrochemische gebeurtenissen, niet van het Reglement van ion kanaal gating. Een soortgelijk idee was eerder voorgesteld door Barry en collega's^12,13,14,15 op basis van strenge theoretische overwegingen en experimenteel bewijs, ook bekend als de ongemengde laag of vervoer nummer effect. Als sommige ionenkanalen voldoende voordoen enkellijns geleidingsvermogen en lang genoeg open-tijd om te zorgen voor voldoende vervoer tarieven via de kanalen (vervoer sneller in het membraan dan in het ongemengde membraan oppervlak), een grenslaag effect . Dus, de convectie-afhankelijke vervoer kan bijdragen tot de uiteindelijke vloeistof-stroom-geïnduceerde faciliteiten van ion huidige^{10,12,13,14,15}.

In deze studie, benadrukken wij het belang van het gebruik van een agar of agarose zout-brug terwijl het bestuderen van vloeistof-stroom-geïnduceerde verordening van ion stromen. We bieden ook een methode voor het meten van echte ion concentraties in de ongemengde grenslaag grenzend aan de Ag/AgCl referentie elektrode en membraan ionenkanalen. Bovendien, de theoretische interpretatie van vloeistof stroom-geïnduceerde modulatie van ion kanaal stromen (dat wil zeggen, convectie hypothese of ongemengde vervoer nummer laageffect) kunnen waardevolle inzichten voor het ontwerpen en het interpreteren van onderzoeken op de shear kracht-regulatie van ionenkanalen. Volgens het ongemengde grenslaag vervoer nummer effect voorspellen we dat ion kanaal stromen via alle soorten membraan ionenkanalen kunnen worden vergemakkelijkt door vloeistofstromen, onafhankelijk van hun biologische gevoeligheid voor vloeistofstromen schuintrekken kracht, maar alleen als de ionenkanalen hebben voldoende enkellijns geleidingsvermogen en open-lang. Hogere ion kanaal huidige dichtheden kan verhogen de ongemengde grenslaag effect op het oppervlak van de celmembraan.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele richtsnoeren van Konkuk Universiteit.

1. Agarose zout bruggen tussen het bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode

Opmerking: Agarose 3M KCl zout bruggen worden geproduceerd zoals eerder beschreven¹² met kleine variaties.

1. Vorming van bruggen
   1. Buig de brand glazen capillaire buizen vormen een U-vormige zo nodig. De binnendiameter van de haarvaten moet groot genoeg zijn voor het verminderen van de serie weerstand bij het opnemen van grote ion stromen. Buizen met een binnendiameter van 2-5 mm zijn meestal acceptabel.
2. Bereiding van agarose 3 M KCl oplossing
   1. Bereiden van 100 mL 3 M KCl oplossing (1 M of 2 M is ook acceptabel).
   2. Weeg 3 g van agarose.
   3. Los de agar in 100 mL KCl (dat wil zeggen, 3% agarose) op een hete plaat tussen 90 en 100 ° C.
3. Laden van de bruggen met 3 M KCl agarose
   1. Dompel de U-vormige glazen bruggen in de agarose-KCl oplossing voor het eenvoudig laden.
      Opmerking: Het is gemakkelijk te graven uit de bruggen van glas als de agarose-KCl oplossing is opgenomen in een ondiep en breed container.
   2. Houd ze 's nachts bij kamertemperatuur (RT) voor de agarose instellen en harden.
   3. Zorgvuldig graven uit de agarose-KCl-loaded glas bruggen uit de reeks/gehard agarose-zout.
4. Opslaan van de bruggen
   1. Genoeg volume voor te bereiden (dat wil zeggen, 500 mL) van de 3 M KCl oplossing in een fles met brede hals.
   2. Bewaar de bruggen agarose-zout bereid in de fles in een koelkast.

2. toepassing van vloeistofstromen Shear kracht naar cellen in een kamer Patch-klemmen

Opmerking: Een schematisch diagram van de experimentele opstelling van patch-clamp is weergegeven in Figuur 1.

1. Plaats een container geladen met zwemwater oplossing (volume en hoogte moeten reeds worden gemeten) boven de patch-clamp-zaal.
2. Vul de patch-clamp-zaal met de zwemwater-oplossing door het suctioning van de buis.
3. Om te stoppen met de vloeistofstromen, illustraties van de buis aan de zijkant van de container voor het blokkeren van de vloeistofstromen en illustraties van de buis aan de zuiging kant om te stoppen met de zuiging op hetzelfde moment. Dit is de voorwaarde "stationair" controle.
4. Om toe te passen vloeistofstromen schuintrekken kracht, opent u beide buizen op de zijkanten van de container en zuig op hetzelfde moment.
5. Voor of na de vloeistofstromen schuintrekken kracht op de cel toe te passen, meten de stroomsnelheid in mL/min.
6. Het debiet berekenen door het meten van de afname van de vloeistof volume na verloop van een bepaalde tijd.
7. Van de gemeten debiet en meetkunde (structuur) van de kamer van de Baden, moet de kracht van de shear die naar de cel door de vloeistofstromen worden geschat (zie sectie discussie).
8. Anderzijds om te bepalen van de stroomsnelheid (voor stappen 2.3-2.6), gebruik een perfusie pomp. In dit geval, wees voorzichtig om ervoor te zorgen een constante in plaats van een gepulseerde stroom.

3. meten van veranderingen in Liquid-Metal Junction potentieel door vloeistofstromen tussen Bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode (figuur 3A)

1. Gebruik de Ag/AgCl-elektrode of pellet, die beschikbaar is vanaf de kant en klare producten, zonder de agarose zoutbrug.
2. Een normale fysiologische zout zout voorbereiden op de zwemwater-zaal (b.v., 143 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.33 mM NaH₂PO₄, 5 mM HEPES, 0.5 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 11 mM D-glucose, pH aangepast aan 7.4 met NaOH).
3. Plaats een patch-pipet met een 3 M KCl oplossing in de zaal om te minimaliseren van de potentiële verschuiving van de kruising tussen de pipet en Baden oplossingen.
4. Bevestigen van de spanning-clamp versterker aan de huidige modus van de klem ("ik = 0" of "CC").
5. Meet na het ontkrachten van de eerste verschoven potentieel, veranderingen in spanning geïnduceerd door verschillende debiet.
6. Om te verifiëren dat de veranderingen in spanning vloeistof/metaal-kruising potentieel zijn, het effect van vloeistofstromen op het potentieel van de kruising met de agarose-zout-brug tussen het bad oplossing en Ag/AgCl-elektrode opnieuw te onderzoeken.

4. experimentele schatting van de concentratie van de echte Cl^- in de ongemengde laag grenzend aan Ag/AgCl-elektrode onder rusttoestand (figuur 3B)

1. Uit de resultaten van stap 3, trekken de kruising potentieel-debiet relaties en schatting van de waarde van de maximale (verzadigen) junction potentiële variatie door het debiet van supra-vloeistof.
2. Bereiden van oplossingen met verschillende concentraties van Cl (dat wil zeggen, 50, 99, 147, 195 en 288 mM van NaCl).
3. Door het veranderen van de Cl^- concentratie in de vloeistof van Baden, tekent u de relatie junction potentiële-[Cl^-]. Merk op dat de vloeistof tarief constant en hoog genoeg moet (> 30 mL / min) om te voorkomen dat de daling van de concentratie van de Cl^- met die van de aangrenzende Ag/AgCl-elektrode.
4. Schatten van de relatie van de twee bochten, de veranderingen in de concentratie van de Cl^- van de gemeten junction potentiële verschuiving.

Resultaten

Hele cel spanning-afhankelijke L-type Ca^{2 +} kanaal (VDCC_L)-stromingen werden geregistreerd in de mesenterische arteriële myocytes enzymatisch verspreide rat, als eerder beschreven¹¹. De arteriële myocytes waren dialyzed met een Cs-rijke Pipetteer oplossing onder de configuratie van nystatine-geperforeerd met divalente kationen-gratis zwemmen oplossing ter vergemakkelijking van de huidige stroom door VDCC_L¹¹

Discussie

In dit onderzoek aangetoond we een methode voor het meten van echte Cl^- -concentratie in de ongemengde laag grenzend aan de Ag/AgCl-elektrode door bepaling van de potentiële vloeistof-metaal-kruising met een open patch-clamp pipet gevuld met een hoge KCl concentratie. De veranderingen in de concentratie van de Cl^- in de grenslaag kan resulteren in een verschuiving van kruising potentieel Wanneer overschakelen van statisch naar vloeistof-stromingscondities. Eenvoudig met behulp van een agarose KCl br...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl elektrodepellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp versterker	HEKA, Duitsland	EPC8
Voltage-clamp versterker	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Vloeistof pomp	KNF Flodos, Zwitserland	FEM08