Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een netto schimmel gebaseerde methode om te maken van driedimensionale steiger-vrije cardiale weefsels met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een roman en eenvoudige netto schimmel gebaseerde methode om het maken van driedimensionale (3-D) cardiale weefsels zonder extra Steiger materiaal. Mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), menselijke cardiale fibroblasten (HCFs) en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) zijn geïsoleerd en gebruikt voor het genereren van een celsuspensie met 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs. Ze zijn samen gekweekt in een ultra-lage "opknoping drop" verbindingssysteem, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer. De cellen samenvoegen en spontaan vormen kloppend spheroïden na 3 dagen van co cultuur. De spheroïden zijn geoogst, zaadjes in de holte van een nieuwe schimmel en gekweekt op een shaker in de incubator. De spheroïden uitgegroeid tot een volwassen functionele weefsel ongeveer 7 dagen na het zaaien. Het resulterende meerdere lagen weefsel bestaan uit gesmolten spheroïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag. Deze nieuwe methode heeft veelbelovende potentieel als een reproduceerbare en kosteneffectieve methode maken van gemodificeerde weefsels voor de behandeling van hartfalen in de toekomst.

Inleiding

Het doel van huidige cardiale weefselengineering is het ontwikkelen van een therapie te vervangen of repareren van de structuur en functie van gewonde myocardiale weefsel¹. Methoden voor het maken van 3D-cardiale weefsel modellen tentoonstellen van de belangrijke eigenschappen van de contractiele en elektrofysiologische van inheemse cardiale weefsel hebben al snel groeiende^2,3. Een verscheidenheid van strategieën zijn onderzocht en gebruikt in studies^4,5. Deze verificatiemethoden variëren van het gebruik van specifieke synthetische en natuurlijke bioactieve hydrogels, zoals collageen, gelatine, fibrine en peptiden⁶, tot bio-inkt afzetting technologieën² en bioprinting technologieën⁷.

Het is aangetoond dat de steiger-vrije methoden vergelijkbare weefsels als biomaterial gebaseerde methoden, zonder de nadelen van de integratie van buitenlandse steigers materiële⁸kunnen produceren. Oren Caspi et al. aangetoond dat de opname van verschillende soorten cellen in staat de generatie van zeer gevacuoliseerd menselijke gemanipuleerde cardiale weefsel^{9 stelt}. Kin et al. ontwikkelde een 3D-afdrukmethode voor cardiale patch creatie van spheroïden. Resulterende patches zijn samengesteld uit cardiomyocytes en fibroblasten, endotheliale cellen in een 70:15:15 ratio¹⁰. Spheroïden hebben aangetoond dat effectieve "bouwstenen" van de steiger-vrije cardiale weefsel schepping, als ze resistent zijn tegen hypoxie en bezitten voldoende mechanische integriteit voor implantatie^11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende fabricage methoden voor sferoïde creatie, met inbegrip van het gebruik van de opknoping drop methode, spinner kolven¹³, microfluidic systemen¹⁴en niet-aanhanger cultuur oppervlakken ongecoat of bekleed met agarose micro-mallen¹⁵. In dit protocol, gebruiken we de opknoping drop apparaat, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer.

Deze studie geeft een roman en efficiënte steiger-vrije methode voor cardiale weefsel creëren, waarin de spheroïden handmatig te zaaien in een vierkante mal Holte en broeden van het weefsel op een shaker voor rijping. Onder gebruikelijke statische kweekomstandigheden is zuurstof diffusie beperkt tot de uiterlijke aspecten van de constructie van weefsel, wat resulteert in centrale necrose. Echter met de netto schimmel, worden alle spheroïden die zaadjes in de mal ondergedompeld in de media met een constante fluidic beweging, rekening houdend met de toegenomen verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof. Bovendien, deze schimmel gebaseerde methode zorgt voor de gelijktijdige oprichting van verschillen in de grootte weefsel patches met minimale handmatige inspanning en het resulterende weefsel kan gemakkelijk worden verwijderd uit de mal. Deze nieuwe methode zorgt voor de efficiënte en reproduceerbare oprichting van steiger-vrije, meerdere lagen cardiale patches.

Protocol

1. bereiding van Cardiomyocytes

1. Jas 6-Wells-platen met kelder membraan matrix en cultuur mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs)¹⁷zoals hiervoor is beschreven.
2. Differentiëren hiPSCs in hiPSC-CMs met behulp van de eerder beschreven methoden¹⁸.
3. Op 16-18 d na differentiatie, schorsen de cardiomyocytes door elk putje met 2 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) spoelen zonder calcium of magnesium, gevolgd door incubatie met 1 mL/goed van trypsine of cel dissociatie reagens (Zie tabel van Materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) cel media aangevuld met B-27 (RPMI/B-27 cel media). Pipetteer omhoog en omlaag om het zelfklevend cellen los.
5. De zwevende cardiomyocytes serologische Pipetteer 10 mL verzamelen en overbrengen naar een conische buis van 50 mL.
6. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen van een cel-pellet.
7. Resuspendeer de pellet in 10 mL RPMI/B-27 cel media.
8. 20 µL celsuspensie combineren met een gelijke hoeveelheid van 0,4% Trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.
9. Gebruik een handmatige hemocytometer te tellen en het verkrijgen van de concentratie en cel levensvatbaarheid van de celsuspensie.

2. voorbereiding van de fibroblasten

1. Het initiëren van een cultuur van een lijn van de cel van menselijke cardiale fibroblast (HCF)-(volwassen ventriculaire type), zoals eerder beschreven¹⁶.
2. Opschorten van de HCFs door aan het broeden ze met een passend bedrag van trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur¹⁶. Voor een T175 kolf, werd 10 mL trypsine of cel dissociatie reagens gebruikt.
3. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume van medium, vervolgens het monster overbrengen in een conische buis van 50 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen een pellet.
4. Resuspendeer de pellet in 10 mL fibroblast groeimedium (Zie Tabel van materialen).
5. 20 µL van de celsuspensie HCF combineren met een gelijke hoeveelheid van 0,4% trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.
6. Gebruik een geautomatiseerde cel teller of handmatige hemocytometer te tellen en de concentratie en cel levensvatbaarheid van de nieuwe celsuspensie te krijgen.

3. voorbereiding van de endotheliale cellen

1. Het initiëren van een cultuur van een lijn van menselijke navelstreng ader endothelial cel (HUVEC), zoals eerder beschreven¹⁷. Opschorten van de HUVECs door aan het broeden ze met een passend bedrag van trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) gedurende 3 minuten op kamer temperatuur¹⁷. Neutraliseren van de trypsine of cel dissociatie-reagens (Zie Tabel van materialen) met behulp van een gelijk volume van medium, vervolgens overbrengen naar een conische buis van 50 mL en centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen van een pellet.
   Opmerking: Voor een T175 kolf, 10 mL trypsine of cel dissociatie reagens werd gebruikt.
2. Resuspendeer de pellet in 10 mL endothelial cel groeimedium (Zie Tabel van materialen).
3. Combineer 20 µL van de HUVEC ophanging en vlek met een gelijke hoeveelheid van 0,4% Trypan blauwe oplossing en meng voorzichtig.
4. Gebruik een geautomatiseerde cel teller of een handmatige hemocytometer te tellen en het verkrijgen van de concentratie en cel levensvatbaarheid van de celsuspensie.

4. oprichting van opknoping Drop spheroïden

1. Plaats de opknoping drop apparaat dat 850 micropores (elk met een diameter van 350 µm) in steriele 6-Wells-platen bevat.
2. Isoleren van de drie soorten cellen zoals hierboven beschreven: hiPSC-CMs, HCFs en HUVECs. Combineer ze in een verhouding van 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs in een conische buis van 50 mL met RPMI/B-27 cel media bij een concentratie van 2,475,000 cellen per mL.
3. Breng 4 mL van de celsuspensie (2,475,000 cellen per mL) aan elk putje van een ultra-lage gehechtheid systeem van de daling (met een schoon diameter van 350 µm) zitten in een 6-well-bord hangen.
4. Spheroïden zal spontaan vormen binnen de 12 uur van de verstrekking van de celsuspensie in de opknoping drop apparaat. Cultuur voor een totaal van 72 uur (3 d) bij 37 ° C, 5% CO₂, en 95% vochtigheid blijven voor de rijping van de spheroïden.
5. Na 72 uur van cultuur, oogsten de spheroïden door de poriën aan de onderkant van het hangende drop systeem door het plaatsen van het apparaat in een schotel met medium en het zachtjes om vrij van de spheroïden van de ophanging te zwenken drop apparaat.

5. 3D-Patch creëren met behulp van de roman netto schimmel

1. De base, vierkante bodemplaat onder netto en 10 gelaagde kant netten worden geassembleerd om de nieuwe mal maken met behulp van een paar steriel pincet. Eerst stapelen en uitlijnen van de basis, de vierkante bodemplaat en onderste net met behulp van de hoek posten. Vervolgens stapelen en laag van de netten van de 10 kant afwisselend instructies voor het maken van een net van fijne roestvrij stalen uitsteeksels.
2. Spoel de basis met PBS of medium te verlagen de oppervlaktespanning, breng de geassembleerde schimmel op de vulling base vulling.
3. Natte de netto schimmel holte met PBS of medium in dezelfde methode. Langzaam vullen van de spheroïden in de veronderstelde holte van de gewenste grootte (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, of 6 x 6 x 1 mm).
   Opmerking: Zorg ervoor dat de 120% van de verwachte hoeveelheid spheroïden in de holte wordt gevoed, zodat de cel aggregaten in strakke verbinding worden en statisch blijven.
4. Monteer de top netto en bovenste vierkante plaat op de hoek posten en veilig de stoppers en bedrijf buizen om te voorkomen dat een wegspoeling van de spheroïden.
5. Het systeem gevuld netto schimmel overbrengen in een 6-well plaat met 6 mL RPMI/B-27 cel media of in een steriele container met genoeg medium ter dekking van de gehele geassembleerde schimmel.
6. Incubeer de 6-well plaat met de gevulde mal-systeem op een swingende shaker voor 7-10 dagen bij 3.000-4.000 x g.
   Opmerking: De duur van de incubatie wordt bepaald door de grootte van de cardiale patches. Met grotere patches moet de incubatietijd voor cardiale patch rijping worden verhoogd.

6. verwijdering van de Patch van de roman netto schimmel

1. Het systeem van de schimmel uit de media verwijderen en plaats deze op de mat gesteriliseerde behandeling in een steriele 10-cm schotel.
2. Verwijder de buis bedrijf, stoppers, de bovenste vierkante plaat en het bovenste net. Schuif voorzichtig uit de gelaagde kant netten één voor één met een paar steriel pincet. Na decannulation, wordt een intact cardiale patch verkregen bovenop de bodem net.
3. Pikken net onder met de patch steriel pincet gebruiken en breng de bodem net in een 35-mm schotel met 5 mL RPMI/B27 media. Voorzichtig los van de patch van de bodem net door langzaam zwenken van het net in de schotel, of met een steriele cel schraper. Na detachement van de bodem net, kan het cardiale weefsel met RPMI/B27 media worden gekweekt.
4. Blijven broeden van de vrij zwevende 3D-cardiale patch in de 35-mm schotel. Functionele synchrone afstraffing kan zo spoedig 24 h na het verwijderen van de mal worden waargenomen.
5. Na het verwijderen van de patch van de netto schimmel, observeren dat zijn vorm behouden blijft met de integriteit en de intensiteit van de verhogingen van de synchrone gewonnen met de tijd.
   Opmerking: De 3D-net schimmel gebaseerde cardiale patches tentoongesteld elektrische integratie van component cardiospheres na decannulation. We hebben vastgesteld dat een frequentie van de afstraffing variërend van 60 tot 80 slagen per minuut dat al meer dan 60 dagen duurt.

Resultaten

In onze experimenten gebruikt wij een celsuspensie van 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs in RPMI/B-27 cel media bij een concentratie van 2,475,000 cellen per mL. Na het maken van de celsuspensie, afgezien we 4 mL van de celsuspensie aan elk putje van ultra-lage beslagleggingsbevel opknoping drop systeem, zoals beschreven in stap 4.3 van het protocol. Het gebruik van de opknoping drop systeem resulteerde in de spontane vorming van honderden verslaan spheroïden na 3 dagen van cult...

Discussie

Het belang van deze methode ligt in de reproduceerbaarheid en de effectiviteit van het daaruit voortvloeiende meerdere lagen cardiale weefsel. Op het gebied van cardiale weefselengineering is één van de huidige doelstellingen het identificeren van een methode voor de bouw van slaand, meerdere lagen en functionele 3D-cardiale patches. Wij rapporteren een efficiënte en reproduceerbare methode van het creëren van meerdere lagen cardiale weefsels door directe handmatige zaaien van spheroïden samengesteld van cardiomyocytes, ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Human Cardiac fibroblasts (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 Bestaat uit basaal medium	Sciencell	2331	HCF-kweekmedium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit	Lonza	CC5035	HUVEC-kweekmedium
E8-medium	Invitrogen	A1517001	HiPSC-kweekmedium
Geltrex	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher	12604013	Trypsine en celdissociatiereagens
RPMI-medium	Invitrogen	11875093	RPMI-medium met B-27-supplement is hiPSC-CM-kweekmedium
B-27 supplement (50x)	Thermo Fisher	17504044	RPMI-medium met B-27-supplement is hiPSC-CM-kweekmedium
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Novel net mal	TissueByNet Co.,Ltd	NM25-1
Hangende druppelplaat	Kuraray Co.,Ltd	MPc350
6-wellplaten	Sigma-Aldrich	CLS-3516