Synthese van 68Ga ijzeroxide Core-doped nanodeeltjes voor Dual Positron emissie tomografie / (T-1) magnetische resonantie Imaging

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol te verkrijgen⁶⁸Ga ijzeroxide core-doped nanodeeltjes via snel magnetron-gedreven synthese. De methodologie maakt PET / (T-₁) MRI nanodeeltjes met radiolabeling efficiëntie hoger dan 90% en radiochemische zuiverheid van 99% in een 20-min-synthese.

Samenvatting

Hier beschrijven we een synthese van de magnetron om op te halen van ijzeroxide nanodeeltjes core-doped met ⁶⁸Ga. magnetron technologie maakt het mogelijk snel en reproduceerbare synthetische procedures. In dit geval vanaf FeCl₃ en citraat Trinatriumcitraat zout, ijzeroxide nanodeeltjes bekleed met citroenzuur worden verkregen in 10 min. in de magnetron. Deze nanodeeltjes presenteren de grootte van een kleine kern van 4.2 ± 1.1 nm en een hydrodynamische grootte van 7,5 ± 2.1 nm. Bovendien hebben zij een hoge longitudinale relaxivity (r₁) waarde van 11.9 mM^-1·s^-1 en een bescheiden transversale relaxivity-waarde (r-₂) van 22.9 mM^-1·s^-1, wat in een lage r_{2 resulteert} /r-₁ -ratio van 1.9. Deze waarden kunnen positief contrast generatie in magnetische resonantie beeldvorming (MRI) in plaats van negatieve contrast, gebruikte met ijzeroxide nanodeeltjes. Bovendien, als een elutie ⁶⁸GaCl₃ van een ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga generator is toegevoegd aan de grondstoffen, een nano-radiotracer doped met ⁶⁸Ga wordt verkregen. Het product wordt verkregen met een hoge radiolabeling rendement (> 90%), ongeacht de oorspronkelijke activiteit gebruikt. Bovendien een interne zuivering stap maakt de nano-radiomaterial klaar om te worden gebruikt in vivo.

Inleiding

De combinatie van beeldvormingstechnieken voor medische doeleinden heeft geleid tot de zoektocht naar de verschillende methoden voor het synthetiseren van multimodale sondes^1,2,3. Vanwege de gevoeligheid van positron emissie tomografie (PET)-scanner en de ruimtelijke resolutie van MRI, PET/MRI combinaties lijken te zijn een van de meest aantrekkelijke mogelijkheden, anatomische en functionele voorlichting op dezelfde tijd⁴. Bij MRI, T₂-gewogen sequenties kunnen worden gebruikt, donkerder maken van de weefsels waarin ze accumuleren. T₁-gewogen sequenties kunnen ook gebruikt worden, produceren het ophelderen van de specifieke accumulatie locatie⁵. Onder hen is positief contrast vaak de meest geschikte optie, zoals negatieve contrast het veel moeilijker om te differentiëren signaal van endogene hypointense gebieden maakt, met inbegrip van die vaak van organen zoals de longen⁶. Traditioneel, zijn Gd gebaseerde moleculaire sondes tewerkgesteld te verkrijgen van positieve contrast. Gd gebaseerde contrastmiddelen presenteren echter een belangrijk nadeel zijn, namelijk hun toxiciteit, wat cruciaal is bij patiënten met renale problemen^7,8,9. Dit heeft gemotiveerd onderzoek in de synthese van biocompatibel materiaal voor hun gebruik als T₁ -contrastmiddelen. Een interessante benadering is het gebruik van ijzeroxide nanodeeltjes (IONPs), met een grootte van de uiterst kleine kern, die positief contrast¹⁰. Als gevolg van deze uiterst kleine kern (~ 2 nm), allermeest naar de Fe^{3 +} ionen van de ondergrond, met 5 ongepaarde elektronen elke zijn. Dit verhoogt de longitudinale ontspanning (r₁) tijdwaarden en rendementen veel lagere transversal/longitudinale (r₂/r₁) ratio's ten opzichte van traditionele IONPs, productie van de gewenste positieve contrast¹¹.

Als u wilt combineren IONPs met een positron-zender voor huisdier, zijn er twee belangrijke zaken rekening te houden: isotoop verkiezing en nanoparticle radiolabeling. Wat de eerste kwestie betreft is ⁶⁸Ga een verleidelijke keuze. Het heeft een relatief korte halfwaardetijd (67.8 min). De halfwaardetijd is geschikt voor peptide labeling omdat het overeenkomt met gemeenschappelijke peptide ook tijden. Bovendien wordt ⁶⁸Ga geproduceerd in een generator, waardoor de synthese in de bench modules en het vermijden van de noodzaak van een cyclotron in de buurt van^12,13,14. Om radiolabel de nanoparticle, is oppervlakte-labeling isotoop opneming de heersende strategie. Dit kan worden gedaan met behulp van een ligand die ⁶⁸Ga chelateert of profiteren van de affiniteit van de radiometal naar het oppervlak van de nanoparticle. De meeste voorbeelden in de literatuur over IONPs gebruiken een complexvormer. Er zijn voorbeelden van het gebruik van de heterocyclische liganden zoals 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur (DOTA)¹⁵1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic zuur (NOTA)^16,17en 1,4,7- triazacyclononane, 1-Glutaaracidurie zuur-4,7-azijnzuur (NODAGA)¹⁸, en het gebruik van 2,3-dicarboxypropane-1,1-diphosphonic zuur (DPD), een tetradentaat ligand ¹⁹. Madru et al. ²⁰ ontwikkeld een complexvormer-vrij strategie in 2014 aan label IONPs met behulp van een complexvormer-vrije methode die wordt gebruikt door een andere groep posteriorly²¹.

Echter belangrijke nadelen van deze aanpak zijn van een hoog risico van in vivo transmetalering, lage radiolabeling levert, en lange protocollen ongeschikt voor korte duur isotopen^22,23,24. Om deze reden, Wong et al. ²⁵ ontwikkeld in het eerste voorbeeld van core-doped nanodeeltjes, beheren te nemen ⁶⁴Cu in de kern van de IONPs in een 5-min-synthese met behulp van microgolftechnologie.

Hier beschrijven we een snelle en efficiënte procedure voor het integreren van de radionuclide in de kern van de nanoparticle, het ontwijken van veel van de nadelen gepresenteerd door traditionele methoden. Voor dit doel stellen wij het gebruik van een magnetron-gedreven synthese (MWS), die de reactietijden aanzienlijk vermindert, verhoogt opbrengsten en verbetert de reproduceerbaarheid, kritisch belangrijke parameters in de IONP synthese. De verfijnde prestaties van MWS is te wijten aan de diëlektrische verwarming: snelle monster verwarming als moleculaire dipolen proberen aan te passen aan de wisselende veldsterkte, polaire oplosmiddelen en reagentia efficiënter voor dit type synthese. Bovendien, het gebruik van citroenzuur als een oppervlakteactieve stof, samen met de microgolftechnologie, resulteert in uiterst kleine nanodeeltjes, produceren een dubbele T₁-gewogen MRI/PET²⁶ signaal, hierin aangeduid als ⁶⁸Ga Core-doped ijzeroxide nanodeeltjes (⁶⁸Ga-C-IONP).

Het protocol combineert het gebruik van microgolftechnologie, ⁶⁸GaCl₃ als positron emitter, ijzer chloride, Natriumcitraat en hydrazine hydraat, wat resulteert in dubbele T₁-gewogen MRI/PET nanoparticulate materiaal in nauwelijks 20 min. Bovendien levert het consistente resultaten over een bereik van ⁶⁸Ga activiteiten (37 MBq, 111 MBq 370 MBq en 1110 MBq) met geen significante effecten op de belangrijkste fysisch-chemische eigenschappen van de nanodeeltjes. De reproduceerbaarheid van de methode met behulp van hoge ⁶⁸Ga activiteiten breidt het gebied van mogelijke toepassingen, met inbegrip van grote diermodellen of menselijke studies. Daarnaast is er een interne zuivering in de methode opgenomen. In het proces, ieder overtollige van gratis gallium, ijzer chloride, Natriumcitraat en hydrazine hydraat worden verwijderd door filtratie van de gel. Totaal gratis isotoop eliminatie en de zuiverheid van het monster zorgen van geen toxiciteit en verbeteren van de beeldvorming resolutie. In het verleden hebben we al het nut van deze aanpak in gerichte moleculaire beeldvorming^27,28aangetoond.

Protocol

1. reagens voorbereiding

1. 0,05 M HCl
   1. Bereiden van 0,05 M HCl door toevoeging van 208 µL van 37% HCl aan 50 mL gedestilleerd water.
2. Krachtige vloeibare chromatografie eluens
   1. Bereid krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) eluens door ontbinding 6.9 g natrium Natriumdiwaterstoffosfaat fosfaat monohydraat, 7.1 g van het dinatriumzout waterstof fosfaat, 8,7 g natriumchloride en 0,7 g van natriumazide in 1 L water. Meng goed en controleer de pH. Het eluens passeren een 0.1-µm cutoff steriel filter en ontgas vóór gebruik. Aanvaarding bereik: pH 6.2-7.0 (zo niet, pas met NaOH [M 1] of HCl [M 5]).

2. synthese van ijzeroxide citraat-gecoate nanodeeltjes

1. Los 75 mg FeCl₃·6H₂O en 80 mg van citroenzuur Trinatriumcitraat zout (dihydraat) p.a. in 9 mL water.
   Opmerking: Deze hoeveelheden bieden 12 mL van definitieve gezuiverde nanodeeltjes ([Fe] ~1.4 mg·mL^-1). Hoeveelheden kunnen worden verkleind tot een eindvolume van 2.5 mL verkrijgen.
2. Doe het mengsel in de erlenmeyer van magnetron-aangepast.
3. Het laden van een dynamische protocol in de magnetron. Stel de temperatuur tot 120 ° C, de tijd op 10 min, de druk om 250 psi, en de bevoegdheid tot 240 W.
4. 1 mL van hydrazine hydraat aan de reactie toevoegen.
   Opmerking: Hydrazine hydraat begint de vermindering van de ijzer. Dus, een verandering in het uiterlijk van de oplossing, van lichtgeel tot bruin, wordt geconstateerd.
5. Beginnen met het protocol van de magnetron.
6. Ondertussen, spoel een gel filtratie demineralisatie kolom met 20 mL gedestilleerd water.
7. Zodra het protocol heeft beëindigd, laat de kolf afkoelen bij kamertemperatuur.
8. Pipetteer 2,5 mL van het uiteindelijke mengsel op de kolom en gooi de doorstroming.
   Opmerking: De magnetron stopt het protocol bij 60 ° C; de nanodeeltjes kunnen worden toegevoegd direct aan de gel filtratie kolom bij 60 ° C.
9. Voeg 3 mL gedestilleerd water toe aan de kolom en verzamel de nanodeeltjes in een glazen ampul.
   Opmerking: Nanodeeltjes kunnen worden opgeslagen op kamertemperatuur voor 1 week. Na deze tijd, nanoparticle aggregatie wordt weergegeven, hun hydrodynamische vergroten.

3. synthese van ⁶⁸Ga ijzeroxide Core-doped nanodeeltjes (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. FeCl₃·6H₂O 75 mg en 80 mg van citroenzuur Trinatriumcitraat zout (dihydraat) p.a. in de magnetron-aangepast kolf gebracht.
2. Elueer de ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga generator met behulp van de aanbevolen voor het volume en de concentratie van HCl, volgens de leverancier (in ons geval, 4 mL 0,05 M HCl). Na de injectie van dat volume in de eigen afgeschermde generator is (4 mL) ⁶⁸GaCl₃ verkregen, klaar voor gebruik zonder verdere bewerking.
   Opmerking: Volg de overeenkomstige radioactiviteit veiligheidsmaatregelen voor stappen 3.2-3.12. ⁶⁸ Ga is een positron en gamma emitter-isotoop. Het gebruik van de passende veiligheidsmaatregelen om te voorkomen dat blootstelling aan straling door de exploitant is van cruciaal belang. Onderzoekers moeten een ALARA (zo laag als redelijkerwijs mogelijk)-protocol met behulp van de typische afscherming en radionuclide aangestuurde procedures volgen. Bovendien is het gebruik van een ring, kentekenen van het lichaam, en een besmetting detector is verplicht.
3. Voeg 4 mL van ⁶⁸GaCl₃ aan de maatkolf magnetron-aangepast. Dit volume kan worden kleiner, afhankelijk van de activiteit van de generator en de gewenste activiteit van definitieve nanodeeltjes.
4. Pipetteer 5 mL gedestilleerd water in de kolf en meng goed.
5. Het laden van een dynamische protocol in de magnetron. Stel de temperatuur tot 120 ° C, de tijd op 10 min, de druk om 250 psi, en de bevoegdheid tot 240 W.
6. 1 mL van hydrazine hydraat aan de reactie toevoegen.
   Opmerking: Hydrazine hydraat begint de vermindering van de ijzer. Dus, een verandering in het uiterlijk van de oplossing, van lichtgeel tot bruin, wordt geconstateerd.
7. Beginnen met het protocol van de magnetron.
8. Ondertussen, spoel een gel filtratie demineralisatie kolom met 20 mL gedestilleerd water.
9. Zodra het protocol heeft beëindigd, laat de kolf afkoelen bij kamertemperatuur.
10. Pipetteer 2,5 mL van het uiteindelijke mengsel op de kolom en gooi de doorstroming.
    Opmerking: De magnetron stopt het protocol bij 60 ° C; nanoparticles kunnen direct worden toegevoegd aan de kolom filtratie gel bij 60 ° C.
11. Voeg 3 mL gedestilleerd water toe aan de kolom en verzamel de nanodeeltjes in een glazen ampul.
12. Berekenen radiolabeling efficiëntie met een NaI detector, goed-type. Deze parameter meestal meet de activiteit van de ⁶⁸Ga opgenomen in de reactie. Na processen voor synthetische en zuivering, wordt de activiteit van het gezuiverde monster gemeten. Vanwege de korte halfwaardetijd van ⁶⁸Ga heeft de eerste activiteit op tijd (t) worden gecorrigeerd. Normalisatie met tijd volgt de standaard vergelijking:
    N_T = N₀ · e^-λt
    Hier,
    N_T: telt op moment (t)
    N₀: telt op moment (t) = 0
    Λ: verval-constante
    t: verstreken tijd
    
    Opmerking: Radiolabeling van efficiëntie moet worden tussen de 90% - 95%.

4. analyse van ⁶⁸Ga ijzeroxide Core-doped nanodeeltjes (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Dynamische lichtverstrooiing
   1. Gebruik dynamische lichtverstrooiing (DLS) voor het meten van de hydrodynamische grootte van ⁶⁸Ga-C-IONP. Pipetteer 60 µL van het monster in een cuvet en drie grootte metingen per monster uit te voeren. Om ervoor te zorgen de reproduceerbaarheid, moet dit worden herhaald met meerdere nanoparticle batches.
2. Colloïdale stabiliteit
   1. Beoordelen van de colloïdale stabiliteit van ⁶⁸Ga-C-IONP door het meten van de hydrodynamische grootte van de steekproef na incubatie in verschillende buffers (PBS, zoutoplossing en muis serum) voor verschillende tijdstippen, variërend van 0 tot 24 h. Incubeer 500 µL van het monster in elke buffer op 37 ° C. Op de geselecteerde tijden, 60-µL aliquots nemen en Pipetteer hen in DLS cuvettes om hun hydrodynamische grootte te meten.
3. Elektronenmicroscopie
   1. De grootte van de kern van ⁶⁸Ga-C-IONP analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en ringvormige donker-veld beeldvorming (stam-HAADF) (ref TEM protocol: NIST - NCL gezamenlijk Assay Protocol, PCC-X, het meten van de omvang van nanodeeltjes met behulp van Transmission Electron Microscopie).
4. Gel filtratie radio-chromatografische
   1. Fractionate van de elutie in 500-µL aliquots tijdens de zuivering van de gel-filtratie en het meten van de radioactiviteit aanwezig in elk met behulp van een activimeter; waardoor een chromatogram gel-filtratie.
5. Radiochemische stabiliteit van ⁶⁸Ga-C-IONP
   1. Incubeer ⁶⁸Ga-C-IONP in het serum van de muis gedurende 30 minuten bij 37 ° C (3 x herhaald). Na die tijd, de nanodeeltjes zuiveren door ultrafiltratie en meten van de radioactiviteit aanwezig in de nanodeeltjes en het filtraat. Geen activiteit moet worden gedetecteerd in de verschillende filtraten.
6. Relaxometry
   1. Meten van de longitudinale (T₁) en dwars (T₂) ontspanning keren in een relaxometer op 1,5 T- en 37 ° C. Vier verschillende concentraties van ⁶⁸Ga-C-IONP (2 mM, 1 mM, 0,5 mM en 0,25 mM) moeten worden gemeten. Plot ontspanning tarieven (r,₁= 1/T₁, r₂= 1/T-₂) tegen de concentratie van ijzer. De helling van de curve verkregen maakt r₁ en r₂ waarden.
7. PET- en MR phantom beelden
   1. Verwerven in situ heer (T₁-gewogen sequentie) en PET phantom afbeeldingen voor een reeks verdunningen van ⁶⁸Ga-C-IONP (0 mM, 1 mM, 6.5 mM en 9.0 mM) te observeren het toenemende signaal in correlatie met de PET activiteit en MRI.

Resultaten

⁶⁸ Ga-C-IONP werden gesynthetiseerd door het combineren van FeCl₃, ⁶⁸GaCl₃, citroenzuur, water, en hydrazine hydrateren. Dit mengsel werd geïntroduceerd in de magnetron gedurende 10 minuten op 120 ° C en 240 W onder gecontroleerde druk. Zodra het monster was afgekoeld tot kamertemperatuur, werden nanoparticles gezuiverd door gel filtratie te elimineren spoorverontreiniging soorten (FeCl₃, citraat, hydrazine hydraat) en vrij van ^6...

Discussie

Ijzeroxide nanodeeltjes zijn een gevestigde contrast agent voor T₂-gewogen MRI. Echter, als gevolg van de nadelen van dit soort contrast voor de diagnose van bepaalde pathologieën, T₁-gewogen of licht contrast is vele malen voorkeur. De hier gepresenteerde nanodeeltjes niet alleen deze beperkingen te overwinnen door het aanbieden van positief contrast in MRI maar bieden ook een signaal in een functionele beeldvormende techniek, zoals PET, via ⁶⁸Ga opneming in hun kern. Magnetron-...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Iron (III) chloride hexahydrate	POCH	2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%	Acros organics	227130010
Hydrazine hydrate	Aldrich	225819
Hydrochloric acid 37%	Fisher Scientific	10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Aldrich	S9638
Disodium phosphate dibasic	Aldrich	S7907
Sodium chloride	Aldrich	746398
Sodium Azide	Aldrich	S2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	POCH	799200119
68Ga Chloride	ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany	68Ge/68Ga generator system
Microwave	Anton Paar	Monowave 300
Centrifuge	Hettich	Universal 320
Size Exclusion columns	GE Healthcare	PD-10