Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Summary

Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.

Abstract

Vetweefsel speelt een centrale rol in de homeostase van de energie en thermoregulatie. Het is samengesteld uit verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, bloedvaten en zenuwen projecties. Hoewel de moleculaire controle van cel type specificatie en de wisselwerking van deze cellen hebben steeds zijn afgebakend, kan een vollediger inzicht in deze cellen adipeus-ingezeten worden bereikt door het visualiseren van hun distributie en architectuur gedurende het hele weefsel. Bestaande immunohistochemistry en immunofluorescentie benaderingen voor het analyseren van obesitas histologie is afhankelijk van dunne paraffine-ingebedde secties. Echter, dunne secties vangen slechts een klein gedeelte van weefsel; Dientengevolge, kunnen de conclusies worden beïnvloed door welk deel van weefsel wordt geanalyseerd. Daarom hebben we een adipeus weefsel clearing techniek, Adipo-Clear, om toe te staan uitgebreide driedimensionale visualisatie van moleculaire en cellulaire patronen hele vetweefsel. Adipo-Clear werd aangepast van iDISCO / iDISCO +, met specifieke wijzigingen aangebracht in de lipide opgeslagen in het weefsel met behoud van de morfologie van het oorspronkelijke weefsel volledig te verwijderen. In combinatie met licht vel fluorescentie microscopie tonen we hier het gebruik van de methode Adipo-Clear te verkrijgen van de volumetrische resolutieafbeeldingen van een hele adipeus weefsel.

Introduction

Tot voor kort werd adipeus weefsel opgevat als een amorfe verzameling van vetcellen. In de afgelopen decennia, is ons begrip meer verfijnd, gegroeid met vet nu erkend als een complex orgaan met verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, de therapieën en zenuw projecties. Interacties tussen deze cellen adipeus-ingezeten hebben uitgesproken effecten op vetweefsel en organisch fysiologie en pathofysiologie¹. Hoewel opkomende studies hebben ontrafeld belangrijke moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan bepaalde interacties, vereist een vollediger begrip betrouwbare structurele profilering van het hele weefsel in drie dimensies (3D).

Onze huidige kennis van vetweefsel morfologie is grotendeels gebaseerd op histologische analyse van dunne secties (5 μm) met relatief hoge-vergroting beeldvorming (meer dan 10 X)^2,3. Deze benadering heeft echter enkele belangrijke beperkingen. Eerste, ingewikkelde filamenteuze structuren zoals sympathische zenuwen en de therapieën, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in de obesitas functie^4,,^5,,^6,7, zijn moeilijk te evalueren via de dunne secties. Ten tweede, vanwege zijn schijnbaar amorfe vorm en het gebrek aan representatieve structurele eenheden te concentreren op, het is moeilijk te waarderen adipeus weefsel structuren alleen gebaseerd op sectie kleuring. Ten derde, vetweefsel heeft een zeer hoog vetgehalte, maken van de uitdagingen bij het verkrijgen van consistente seriële secties die geschikt voor 3D anatomische reconstructie, een conventionele methode gebruikt zijn bij het bestuderen van de hele hersenen morfologie⁸. Gezien deze factoren, is er een grote behoefte aan een geheel-mount aanpak die 3D visualisatie van een hele obesitas depot terwijl nog het bereiken van cellulaire resolutie kan bieden.

3D volumetrische beeldvorming van een gehele orgaan is uitdagend vanwege de verduistert effecten van licht spreiding. Een belangrijke bron van licht spreiding in biologische weefsels komt van lipide-waterige interfaces. Hoewel de inspanningen om te elimineren scatter doordat lipiden lopende voor meer dan een eeuw geweest, zijn er een groot aantal recente innovaties⁹. Een dergelijk nieuw ontwikkelde weefsel-clearing methode is immunolabeling ingeschakelde 3D beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Vetweefsel kampt echter met een bijzondere uitdaging, gezien zijn hoge niveau van lipiden, en daarom extra wijzigingen in de iDISCO / iDISCO + protocol moeten volledig uittreksel van de lipiden terwijl de bescherming van het weefsel instort. Het gewijzigde protocol die we hebben ontwikkeld, nu genaamd Adipo-Clear, maakt gebruik van methanol/dichloormethaan gebaseerde delipidation van vetweefsel aan het bereiken van optimale transparantie geschikt voor hoge resolutie volumetrische imaging¹². Want de delipidation stap grotendeels lest endogeen uitgedrukt fluorescente proteïnen zoals GFP en RFP, moet visualisatie van dergelijke eiwitten worden bereikt door immunolabeling. Globaal, dit eenvoudig en robuust protocol kan worden toegepast om te bestuderen van weefsel-niveau organisatie van adipeus-ingezeten cellen, lineage traceren van adipocyte voorlopercellen, en obesitas morfogenese tijdens de ontwikkeling.

Protocol

Verzorging van de dieren en experimenten werden uitgevoerd volgens de procedures die zijn goedgekeurd door het dier zorginstellingen en gebruik Comité aan de Rockefeller-universiteit.

1. de weefsels voorbereiding

1. Voer standaard intracardiac perfusie met ~ 20 mL voor 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C tot het bloed wordt volledig verwijderd uit het weefsel.
2. Activeer het perfusaat ~ 20 mL kleefpoeders oplossing (4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS) bij 4 ° C tot de nek en staart hebben aanzienlijk verstijfd.
   Let op: PFA is giftig. Vermijd contact met huid, ogen en slijmvliezen. Oplossingen moeten worden gemaakt in een zuurkast.
3. Ontleden de dikke pads van belang zorgvuldig met de gehele vet pad verwijderen zonder deze te beschadigen. Gebruik bot-ended pincet te voorkomen knijpen of knijpen van het weefsel. Vermijd besmetting van de ontleed weefsel met een bont.
4. Na het bevestigen van het weefsel in 4% PFA in 1 x PBS overnacht bij 4 ° C. Voor elke vet pad, na correctie met ~ 10 mL van oplossing van de fixatie in een conische tube van 15 mL.
5. Wassen het weefsel 3 keer (van elk 1 h) met 1 x PBS bij kamertemperatuur (RT).
6. Opslaan van het weefsel voor korte termijn (tot 2 weken) in 1 x PBS bij 4 ° C en beschermd tegen licht. Voor langdurige opslag (bijvoorbeeld1-2 jaar), schakelen de buffer naar 1 x PBS met 0,05% natriumazide (als conserveringsmiddel).
   Let op: Natriumazide is zeer giftig is wanneer mondeling ingenomen of geabsorbeerd door de huid. Geconcentreerd natriumazide oplossingen (op 5% of meer) moeten worden behandeld in een zuurkast.

2. Delipidation en Permeabilization

Timing: 1-2 dagen

1. Bereiden van 20%, 40%, 60% en 80% methanol gradiënt met B1n buffer (tabel 1) (v/v), bvvoor 20% methanol/B1n buffer, meng 20 mL van methanol en 80 mL B1n buffer. Opslaan van alle buffers bij 4 ° C. Glycine kristallen zal neerslaan van 60% en 80% methanol/B1n buffers als gevolg van de verzadiging. Voorkomen dat het verwijderen van de kristallen; Gebruik de vloeibare oplossing voor de volgende wast.
   Let op: Methanol is vluchtige, irriterende, licht ontvlambaar. Vermijd huid- of oogcontact.
2. Verwijder voorzichtig het haar uit de steekproef onder een Microscoop dissectie. Elke haar, lint of puin gekoppeld aan het monster zal veroorzaken schaduwen tijdens imaging. Breng de schoongemaakte monster in een nieuwe buis.
3. Voer alle volgende stappen uit op ijs of bij 4 ° C tenzij anders aangegeven. Voor kleine steekproeven (b.v., posterior subcutaan/perigonadal dikke pads van jonge slanke muizen), 2 mL microcentrifuge buizen met 1.6 mL van de oplossing te gebruiken. Voor de grote monsters of met hoog vetgehalte (bijvoorbeeld, vet pads van zwaarlijvige muizen), 5 mL buisjes met 4 mL van de oplossing te gebruiken.
   1. Plaatsen van de buizen met de monsters horizontaal op een roteerschudapparaat vastgesteldop ~ 100 rpm. Zorg ervoor dat de monsters zich vrij kunnen bewegen in de buis.
4. Het uitdrogen van het monster in een gesorteerde reeks van 20%, 40%, 60%, 80% en 100% methanol/B1n buffer voor de aangegeven tijd (tabel 2). Het minimaliseren van de "Carry-over"-oplossing.
5. Delipidate het monster met 100% dichloormethaan (DCM) (3 keer), elk met de incubatietijd aangegeven in tabel 2. Het monster moet zinken naar de bodem van de buis aan het einde van de tweede en derde DCM wast. Zo niet, de incubatietijd om ervoor te zorgen volledige delipidation uit te breiden (bvverlengen van 30 min tot 1-2 h).
   Let op: DCM moet worden behandeld in een zuurkast. Gebruik glazen recipiënten voor opslag en microcentrifuge buizen die zijn gemaakt van polypropyleen voor incubations. De microcentrifuge-buizen moeten niet worden gebruikt voor langetermijnopslag van DCM. Petrischalen en serologische pipetten die van polystyreen gemaakt zijn stroken niet met DCM. DCM is zeer volatiel. Breng het monster in verse oplossing snel om uitdroging te voorkomen.
6. Wassen tweemaal met 100% methanol voor de aangegeven tijd (tabel 2).
7. Optioneel: Als het monster niet goed perfused is, kan de kleur van hemoglobine van de resterende rode bloedcellen sterk autofluorescence veroorzaken. Bleekmiddel met 5% H₂O₂ in methanol (1 deel 30% H₂O₂ tot 5 volumes van methanol) 's nachts bij 4 ° C.
8. Het monster in een omgekeerde methanol/B1n buffer reeks hydrateren: 80%, 60%, 40%, 20% methanol/B1n en 100% B1n buffer (2 keer) voor de aangegeven tijd (tabel 2).
9. Wassen van het monster met PTxwH buffer (tabel 1) voor 2 h op RT.
10. Het delipidated monster in PTxwH buffer bij 4° C (tot 1 jaar) opslaan of ga onmiddellijk naar de immunokleuring stap.

3. hele Mount immunokleuring

Timing: 8-10 dagen

Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd op RT tenzij anders aangegeven, met schudden en bescherming tegen licht. Voor kleine steekproeven, 2 mL microcentrifuge buizen met 1.6 mL van de oplossing te gebruiken. Voor grote monsters, 5 mL buisjes met 4 mL van de oplossing te gebruiken. Het is aanbevolen om eerst de antilichamen op kleine stukjes weefsel of de methanol-behandelde weefselsecties valideren.

1. Verdun het primaire antilichaam in PTxwH buffer bij de aanbevolen concentratie. Centrifugeer de verdunde antilichaam oplossing bij ~ 20.000 x g gedurende 10 minuten introductie antilichaam precipitaten of aggregaties te voorkomen.
2. Incubeer het monster van de delipidated met het primaire antilichaam-oplossing voor de aangegeven tijd (tabel 2).
3. Wassen van het monster met PTxwH buffer in een reeks van incubatie stappen: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 uur, 2 h, 4 h en overnachting.
4. Verdun het secundaire antilichaam in PTxwH buffer bij de aanbevolen concentratie. Centrifugeer de verdunde antilichaam oplossing bij ~ 20.000 x g gedurende 10 minuten introductie antilichaam precipitaten of aggregaties te voorkomen.
   Opmerking: Om te voorkomen dat hoge achtergrond veroorzaakt door weefsel autofluorescence, secundaire antilichamen zijn geconjugeerd met fluorophores die uitstoten van licht in het rood en far-red gebieden worden aanbevolen. Afhankelijk van het aantal laserlijnen beschikbaar op een Microscoop, kan maximaal 3-4 markeringen gelijktijdig in één monster worden beeld.
5. Incubeer het monster met de secundair antilichaam-oplossing voor de aangegeven tijd (tabel 2).
6. Wassen monster met PTxwH buffer in een reeks van incubatie stappen: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 uur, 2 h, 4 h en overnachting.
7. Optioneel: Voor weefseltypes (HLA) die kwetsbaar zijn, fix het gekleurd weefsel met 4% PFA in 1 x PBS overnacht bij 4 ° C tot het bijdragen aan het behoud van de morfologie van het weefsel.
   Opmerking: Deze stap kan verhogen beeldvorming achtergrond. Het is niet nodig voor het uitvoeren van deze stap voor adipeus weefsel.
8. Het monster met 1 x PBS wassen in een reeks van incubatie stappen: 5 min, 10 min, en 30 min.
9. Voorzichtig uit het monster onder een Microscoop dissectie lint te verwijderen.

4. de weefsels Clearing

Timing: 1-2 dagen

1. Optioneel: Insluiten het monster in de agarose om monster montage voor licht vel microscopie.
   Opmerking: Deze stap wordt sterk aanbevolen voor adipeus weefsel te stabiliseren zijn vorm tijdens imaging.
   1. Bereid de insluiten oplossing met 1% agarose in 1 x PBS (w/v). Koel de insluiten oplossing voor ~ 40 ° C om te voorkomen dat het monster aan overmatige hitte blootstellen.
   2. Leg de schoongemaakte monster in een mal (b.v., petrischaal of gewicht van de boot) en regelen het naar de gewenste positie. Vermijd alle vloeibare overdracht. Giet voorzichtig het insluiten oplossing over het monster. Vermijd alle luchtbellen.
   3. Laat de agarose stollen volledig bij RT. Cut uit een blok met het monster.
      Opmerking: Alle van de volgende stappen, met inbegrip van overnachting incubations moet worden uitgevoerd op RT, met schudden en bescherming tegen licht. Voor kleine steekproeven, 2 mL microcentrifuge buizen met 1.6 mL van de oplossing te gebruiken. Voor grote monsters, 5 mL buisjes met 4 mL van de oplossing te gebruiken.
2. Het uitdrogen van het monster in methanol verloop met H₂O: 25%, 50%, 75% en 100% (3 keer) voor de aangegeven tijd (tabel 2).
   Opmerking: Monster kan worden overgelaten 's nachts bij de 100% methanol stap.
3. Incubeer het monster in 100% DCM voor 1 h met schudden (3 keer). Monster moet zinken naar de bodem van de buis aan het einde van elke DCM wassen. Als dat niet het geval is, breiden de incubatietijd om volledige verwijdering van methanol. Monster kan 's nachts bij de 100% DCM stap worden overgelaten.
4. Incubeer het monster in dibenzyl ether (DBE) 's nachts met milde schudden om brekingsindex matching.
   Opmerking: Monster zal uiteindelijk worden transparant in zichtbaar licht.
   Let op: DBE is gevaarlijk. Vermijd elk contact met de huid. Behandelen in een zuurkast met dubbellaagse handschoenen. Gooi de handschoenen, zodra het wordt verontreinigd met DBE. Gebruik glazen recipiënten voor opslag en microcentrifuge buizen (polypropyleen) voor incubations. De microcentrifuge-buizen moeten niet worden gebruikt voor langetermijnopslag van DBE. Petrischalen en serologische pipetten die van polystyreen gemaakt zijn stroken niet met DBE. Reinig elke morsen met 100% ethanol.
5. Incubeer het monster met verse DBE met milde schudden 2 h. winkel het monster bij RT in het donker of ga direct naar imaging.
   Opmerking: Monsters worden aanbevolen aan het beeld worden binnen een maand. Hoewel bepaalde fluorophores stabieler dan anderen zijn, wordt langdurige opslag van de monsters in dit stadium niet aanbevolen.

5. microscopie

1. Beeldbewerking met een licht vel Microscoop die compatibel is met de DBE.
   Opmerking: Alleen doelstellingen die zijn goedgekeurd voor organische oplossingsmiddelen gebaseerde beeldvorming en overeenkomen met de brekingsindex van DBE kunnen worden gebruikt als de doelstellingen in DBE-ondergedompeld beeldbewerking dompelen.
   1. Monteer het agarose-embedded monster op een houder die voorkomen verkeer tijdens imaging dat kan. Dompel het monster in een DBE gevulde zaal.
   2. Het verzamelen van een z-stack die betrekking hebben op het gehele monster (bijvoorbeeld, 1-2 X vergroting) te verkrijgen van geheel-weefsel distributie/structuur van de markering van belang.
   3. Overschakelen naar een doel met hogere vergroting (bijv., 4-12 X vergroting) om in te zoomen op de regio's van belang om het imago van gedetailleerde structuren.
      Opmerking: Collageen is een belangrijke bijdrage aan de extracellulaire matrix van vetweefsel, die alle vetcellen¹³omringt. Collageen is een typische emissiespectrum variërend van ongeveer 400 nm tot 550 nm¹⁴. Beeldvorming van het monster met de 488 laser line (groen) en het verzamelen van het uitgestraalde licht op een golflengtebereik dat binnen het emissiespectrum van collageen (b.v., 525-550 nm ligt) zorgt voor het weefsel autofluorescence signaal, dat bleek eerder te bakenen vet cel contour en algehele weefsel het platform¹².
2. Beeldbewerking met een omgekeerde confocal of een twee-foton microscoop.
   1. Leg het monster agarose-ingebed in een dia van de kamer met een glazen bodem zonder te raken alle plastic onderdelen (of andere DBE-compatibele imaging kamer die kan zegel). Zorg ervoor dat DBE doet niet uitlekken.
   2. Kies de doelstellingen met langere afstanden van de werken aan het bereiken van dieper penetratie.
      Opmerking: Imaging moet gebeuren met een omgekeerde confocal of twee-foton microscoop door de glazen bodem van de kamer dia. Vermijd direct contact tussen het monster en de doelstellingen die niet zijn voorgesteld voor DBE gebaseerde imaging dompelen.

Results

Adipo-Clear bereid hele vet kussentjes kunnen worden beeld in 3D te analyseren hoe weefsel morfologie en cellulaire interacties worden beïnvloed in de Staten mager en obesitas. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast om te analyseren van algemene obesitas structuur door het verzamelen van het weefsel autofluorescence signaal in het groene kanaal. Wij hebben eerder aangetoond dat het autofluorescence signaal in obesitas overlays gunstig met perilipin vlekken, een veelgebruikte marker...

Discussion

Adipo-Clear is een eenvoudige en robuuste methode voor het ontruimen van vetweefsel, die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in een regelmatige lab setup. In vergelijking met andere methoden op basis van oplosmiddel clearing zoals iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear is met name geoptimaliseerd voor het ontruimen van vetweefsel en ander weefsel met een hoog vetgehalte. De delipidation stap volledig verwijderd adipeus, lipiden...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x fosfaat gebufferde zoutoplossing	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparine	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloormethaan	Sigma Aldrich	270991
Waterstofperoxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzylether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Natriumaziede	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Konijn polyklonaal anti-tyrosine hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 verdunning
Geit polyklonaal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Eindconcentratie van 2 µg/mL
Ratten monoklonaal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Eindconcentratie van 2 µg/mL
Ezel anti-konijn IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Eindconcentratie van 5-10 µg/mL
Ezel anti-geit IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Eindconcentratie van 5-10 µg/mL
Ezel anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Eindconcentratie van 5-10 µg/mL
Beeldvormingskamer	ibidi	80287
Lichtbladmicroscoop	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Beeldvormingssoftware	LaVision BioTec	Imspector software
Software voor microscopievisualisatie	Bitplane	Imaris