Hier presenteren we een protocol van elastische kleuring om elastische vezels te identificeren in pT3N0M0 maagkanker weefsels op formalin-vaste, paraffine-ingesloten secties. Vervolgens beschrijven we een methode om te bepalen of tumorcellen buiten de elastische lamina vallen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Elastische kleuring op paraffine-ingesloten Dia's van pT3N0M0 maagkanker weefsel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De elastische lamina, die zich meestal in de submesotheliale laag bevindt, grenzend aan de peritoneum mesotheliale cellen, is amfifiele op hematoxyline en eosine (H & E) kleuring, maar kan worden gevisualiseerd door middel van elastische kleuring. Een van de belangrijke voordelen van elastische kleuring is dat het gemakkelijk is om te bepalen of tumorcellen buiten de elastische lamina zijn binnengevallen. Dit helpt bij het onderzoeken van de omvang van de peritoneale oppervlakte invasie, waardoor de pT3-en pT4 stadia in gastro-intestinale kanker worden onderscheiden. In deze studie presenteren we een protocol voor het identificeren van elastische vezels in de formalin-Fixed, paraffine-ingesloten pT3N0M0 maagkanker weefsel secties. We bereiden 5-μm paraffine profielen op die op dia's zijn bevestigd en vervolgens worden alle dia's gedeparaffineerd en opnieuw gehydrateerd tijdens de kleurings procedure. Vervolgens worden alle secties geoxideerd door kaliumpermanganaat, gebleekt door oxaalzuur, gekleurd door elastische kleuring, en tegengekleurd door van Gieson's. Tot slot onderzoeken we het effect van vlekken; elastische lamina is gekleurd blauw-zwart en collageenvezels zijn rood gekleurd, terwijl de kankercellen gekleurd zijn in verschillende tinten geel. We beschrijven ook in detail de methoden die worden gebruikt voor het bepalen van de positionele relatie tussen kankercellen en elastische lamina. Deze methode is eenvoudig, laag-kosten, en wijd toepasbaar in de identificatie van peritoneale oppervlakte invasie in gastro-intestinale kanker vanwege zijn uitstekende selectiviteit voor elastische vezels en authentieke resultaten.
Inleiding
Volgens de tumor, node, en metastasen (TNM) kanker staging-systeem, de prognose van maagkanker op pathologisch stadium pT4 is significant slechter dan dat bij pT3 (8e UICC/AJCC)1. Bij maagkanker is de classificatie van de primaire tumor (pT) meestal afhankelijk van de diepte van de tumorinvasie2. Pathologische fase pT3 maagkanker wordt gedefinieerd als kanker binnendringt door de Muscularis propria in subserosale weefsels, overwegende dat pT4 maagkanker wordt gedefinieerd als kanker penetreren aan het oppervlak van de viscerale peritoneum. De aanwezigheid van de peritoneale oppervlakte invasiviteit is de sleutel tot het onderscheiden van de twee stadia2. Echter, omdat de peritoneale mesotheel cellaag is erg dun, het kan worden beschadigd tijdens de operatie, postoperatieve behandeling, en fixatie3. Bovendien kunnen tumor-gerelateerde inflammatoire veranderingen en fibrose de normale anatomie van het peritoneum beschadigen, waardoor het zeer moeilijk is om de peritoneale oppervlakte invasie nauwkeurig te beoordelen met alleen H & E kleuring4. Huidige aanvullende diagnosemethoden zoals cytologie en immunohistochemie zijn van beperkte diagnostische waarde5,6 omdat ze vals-positief zijn of een lage kosteneffectiviteit hebben.
Het serosale membraan omvat het peritoneum, pleura en pericardium, en bestaat uit het mesothelium, een kelder membraan en een sub-mesotheliale laag7. Een veelvoorkomend histologisch kenmerk van het serosale membraan is de aanwezigheid van een elastische lamina in de submesotheliale laag, grenzend aan de mesotheliale cellen8,9. Elastische lamina heeft een sterk anti-schadelijk vermogen en kan dienen als een alternatieve prognostische marker als de mesotheliale cellen worden vernietigd door ernstige tumor-gerelateerde ontsteking of fibrose3. Elastische lamina bestaat voornamelijk uit elastine en microfibril10, die kunnen worden gevisualiseerd door elastische kleuring. De belangrijkste reden achter het gebruik van de elastische kleuring is dat de elastine een waterstof binding vormt met de fenolische groep resorcinol in de elastineoplossing, waardoor elastische vezels blauw-zwart worden gekleurd. Na van gieson (VG) contrasterende kleuring, kunnen collageenvezels rood worden gekleurd en spiervezels en rode bloedcellen kunnen geel worden gekleurd8,11,12,13.
De achtste editie van de TNM fasering van longkanker definieert viscerale pleurale invasie (T2) als een tumorinvasie voorbij de elastische lamina of een invasie aan het oppervlak van de viscerale borstvlies2. Studies over colorectale kanker hebben aangetoond dat de elastische lamina-invasie in pT3 colorectale kanker de oorzaak kan zijn van slechte prognoses. De 5-jarige ziektevrije en totale overlevings snelheid van colorectale kanker is ook bewezen als pT4a13,14,15. Op basis van onze eerdere studies over elastische kleuring is gebleken dat de invasie van elastische lamina een significante negatieve invloed heeft op de prognose van pT3 maagkanker en op dezelfde manier moet worden behandeld als pT4a maagkanker12. Vandaar dat deze eenvoudige en kosteneffectieve methode kan helpen bij het elimineren van onzekerheid in de resultaten verkregen door H & E kleuring, en andere gemeenschappelijke beperkingen in verband met andere hulp diagnosemethoden, waaronder cytologie en immunohistochemie, onder Anderen. Deze methode kan efficiënt worden gebruikt voor het diagnosticeren van peritoneale oppervlakte invasies van gastro-intestinale kanker, vooral in sommige dubbelzinnige gevallen. Het is handig omdat H & E vlek en andere vlekken meestal het moeilijk maken om dergelijke invasies te identificeren. Deze methode zorgt ook voor een betrouwbaarheid van de resultaten, omdat het zeer selectief, met name voor elastische vezels. Hier voeren we elastische kleuring uit om te bepalen of tumorcellen de elastische lamina hebben binnengevallen in pT3N0M0 maagkanker12.
Deze methode wordt gebruikt voor het identificeren van elastische vezels in weefsels op formaline-vaste, paraffine-ingesloten secties, en kan ook worden gebruikt voor bevroren secties. Hier kiezen we voor paraffine-embedded secties voor het beste onderhoud van cellulaire en weefsel morfologie. Alle stappen in dit protocol vinden plaats op kamertemperatuur. Een commerciële kleurings Kit met een kaliumpermanganaatoplossing, een oxaalzuur oplossing, een elastine-oplossing en een van Gieson-oplossing wordt gebruikt in de gepresenteerde studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Tussen 1994 en 2005 werden Patiëntenmonsters geselecteerd door twee ervaren gastro-intestinale pathologen in het gelieerde kanker ziekenhuis van Xiangya school of Medicine, Central South University, van patiënten die een Gastrectomie van maag Neoplasmata hebben ondergaan, met een postoperatieve pathologische diagnose van maagkanker op het pT3N0M0 stadium (volgens de zevende TNM-fasering). Deze studie werd goedgekeurd door de ethische beoordelingscommissie.
1. snijden
- Plaats het paraffine blok in een vaste houder van de slede microtome, die naar achteren en naar voren over het blad kan bewegen. Stel de optimale hoek tussen het blok en het microtoom mes in.
Opmerking: de optimale hoek is niet alleen afhankelijk van de geometrie van het mes, maar ook van de snijsnelheid en-techniek. - Trim het paraffine blok indien nodig en snijd het in 5 μm dikke dwarsdoorsneden.
- Plaats de paraffine 5-μm-delen in een waterbad van ongeveer 40-45 °C en monteer het vervolgens vanaf het water op de glazen glijbaan, één stuk per glijbaan.
- Druk de gemonteerde sectie voorzichtig tegen een papieren handdoek in om eventueel restwater en mogelijke luchtbellen te verwijderen.
- Laat secties 30 minuten in de lucht drogen en bak ze vervolgens in een oven bij 45-50 °C gedurende 2 uur.
2. deparaffinisatie en rehydratatie van alle glaasjes
- Dompel de glaasjes in xyleen in een Coplin potje gedurende 10 min.
- Neem de glaasjes uit de eerste xyleen jar en dompel ze gedurende 10 min in xyleen in een andere pot.
- Dompel de lantaarnplaten nu 5 min in 100% ethanol in een Coplin potje.
- Dompel de dia's onder in 100% ethanol in een andere Coplin jar, ook voor 5 min.
- Dompel de glaasjes in 95% ethanol in een Coplin potje gedurende 2 min.
- Dompel de glaasjes in 70% ethanol in een Coplin potje gedurende 2 min.
Opmerking: Zorg ervoor dat de dia's volledig zijn ondergedompeld in de oplossingen tijdens het uitvoeren van de bovenstaande stappen. - Spoel de dia's kort af met gedistilleerd water in een nieuwe pot.
3. vlekken
- Voordat u doorgaat met vlekken, veegt u eventuele overtollige oplossingen rond het weefsel op de glijbaan af met een tissuepapier.
- Plaats de glaasjes inkamer temperatuur en kamer vochtigheid om uitdroging van het weefsel op de glijbaan gedurende het gehele kleuringsproces te voorkomen.
- Oxideren de dia's met een paar druppels kaliumpermanganaat gedurende 5 min. Zorg ervoor dat het volume van kaliumpermanganaat voldoende is om de weefsel sectie op elke dia te bedekken.
- Spoel de geoxideerde glijbanen af met gedistilleerd water in een Coplin potje met 2-3 veranderingen. Let op de blauwe kleur van het weefsel.
- Nu, Bleach deze dia's door het toevoegen van een paar druppels oxaalzuur voor 5 min. Zorg ervoor dat het volume van oxaalzuur voldoende is om de weefsel sectie op elke dia volledig te bedekken.
- Spoel de dia's af door ze onder te dompelen in de Coplin jar gevuld met gedistilleerd water. Voer de spoel 2x-3x uit.
- Was deze dia's nu kort in 95% alcohol en dompel de dia's vervolgens onder in een elastine-oplossing (5 g/L) voor 8-24 uur.
Opmerking: de Elastin-oplossing is vluchtig en de kleurings tijd is relatief lang, dus het is het beste om de dia's onder te dompelen met elastische kleuring in een verzegelde container, zoals een transparante glazen fles met een afsluit kapje. De capaciteit van de container en het volume van de elastine-oplossing is afhankelijk van het aantal ondergedompeld glijbanen, zolang het de volledige onderdompeling van alle dia's mogelijk maakt. - Dompel deze dia's direct onder in 95% ethanol voor 1-2 min om elke weefsel sectie goed te differentiëren.
Opmerking: differentiatie verwijst naar de verandering in de lading van de weefsel sectie, die de overtollige kleuring geabsorbeerd door het weefsel verwijdert en de kleuren duidelijker maakt. Na de kleuring van de elastine-oplossing mogen monsters niet met gedestilleerd water worden gewassen om differentiatie problemen te voorkomen. Controleer microscopisch, indien nodig, voor blauw-zwarte elastische vezels kleuring en grijze achtergrond. Het is beter om enigszins te onderdifferentiëren het weefsel, omdat de daaropvolgende van Gieson van contra vlek kan ook enigszins uitpakken de elastische vlek. - Spoel deze glaasjes volledig af met gedistilleerd water na differentiatie.
- De glaasjes in de oplossing van een van Gieson 1 min tegen vlekken.
Opmerking: het volume van de van Gieson-oplossing moet voldoende zijn om de weefsel sectie op elke dia volledig te kunnen onderdompelen. - Snel druppel 95% ethanol op deze plakjes voor een paar seconden om elke weefsel sectie goed te differentiëren.
Let op: Spoel de glaasjes niet met water na de tegen kleuring van het van Gieson, want dat kan de kleur van de tegen kleuring van het van Gieson verzwakken of zelfs eldelen.
4. dehydratie en montage
- Dompel de dia's in 95% alcohol gedurende 5 minuten om ze snel te laten onthydra teren.
- Doorgaan met het uitdrogen van deze segmenten door 2 wijzigingen van 100% alcohol, elke keer onderdompelen van de dia's voor 5 min.
- Dompel de dia's onder in 2 veranderingen van xyleen, telkens gedurende 3 minuten.
- Voeg één druppel harsachtige bevestigings medium aan de glijbaan toe en plaats de Afdeklijst bovenaan.
5. microscopische waarneming van de glaasjes
- Zoek de serosale richting en observeer de resultaten van elastische kleuring: elastische vezels (lamina) zijn gekleurd blauw-zwart, collageenvezels zijn rood gekleurd, en spiervezels zijn geel gekleurd.
- Zoek naar de kankercellen in de hele dia: kankercellen zijn gekleurd geel12.
- Bepaal de positionele relatie tussen de kankercellen en de elastische lamina.
Opmerking: er zullen twee situaties zijn. Zolang er één tumor cel is die voorbij de elastische lamina in de hele glijbaan is binnengevallen, kan deze zaak worden beschouwd als een elastische lamina-invasie. Aan de andere kant, alleen als er geen tumor cel is die voorbij de elastische lamina in de hele glijbaan is binnengevallen, kan deze zaak worden beschouwd als elastische lamina non-invasie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een succesvolle elastische kleuring onthult duidelijk elastische lamina en kankercellen in pT3 maagkanker. Figuur 1 -laag-vermogen, microscopisch gecontroleerd na elastine oplossing kleuring, voorafgaand aan van gieson's contra vlek volgens het protocol vermeld-toont de elastische lamina dicht bij de serosale mesotheliale cellen en is blauw-zwart gekleurd in de vorm van filamenten, en er is nog een zekere afstand tussen de tumorcellen en de elastische lamina....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze methode die hier wordt voorgesteld, biedt een nauwkeurige benadering voor het identificeren van de subserosale elastische lamina. De methode kan worden gebruikt om te evalueren of tumorcellen de elastische lamina hebben binnengevallen in pT3N0M0 maagkanker12. Elastische lamina is roodachtig in H & E-gekleurd secties, die niet gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van collageenvezels, en andere bestaande hulp diagnosemethoden, zoals cytologie en immunohistochemie, hebben ook een beperkte dia...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de steun gedeeltelijk van de National Natural Science Foundation (NO. 81401902 en NO. 81501992) en de Hunan Natural Science Foundation (NO. 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). Het manuscript is geschreven door Guang lei. Het hele experiment wordt uitgevoerd door Guang lei en Haiyan Yang. De auteurs bedanken de hulp van pathologen en van Fellows die de gegevens van patiënten opvolgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Geschikt voor het kleuren van elastische vezels, collageenvezels en myovezels |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Geschikt voor montage |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xyleen | LMAI Bio | LX820585 |
Referenties
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179(2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
