Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Antigene liposomen voor generatie van ziekte-specifieke antilichamen

11.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58285

⸱

25 oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Beschreven is de voorbereiding van de antigene Liposomale nanodeeltjes en hun gebruik in stimulerende B-cel activatie in vitro en in vivo. Consistente en robuuste antilichaam reacties geleid tot de ontwikkeling van een nieuw model van de pindaallergie. Het protocol voor het genereren van antigene liposomen kan worden uitgebreid tot verschillende antigenen en immunisatie modellen.

Samenvatting

Antilichaam reacties bieden kritische protectieve immuniteit aan een breed scala aan pathogenen. Er blijft een groot belang bij het genereren van robuuste antilichamen voor vaccinatie evenals begrijpen hoe pathogene antilichaam reacties allergieën en auto-immuunziekte ontwikkelen. Robuuste antigeen-specifieke antilichaam reacties te genereren is niet altijd triviaal. In muismodellen vereist het vaak meerdere rondes van inentingen met adjuvans die tot een grote hoeveelheid variabiliteit in de hoeveelheid opgewekte antilichamen leidt. Een voorbeeld is in muismodellen van pindaallergieën waar meer robuust en reproduceerbare modellen die muis nummers en het gebruik van adjuvante minimaliseren gunstig zou zijn. Hier gepresenteerd is een zeer reproduceerbaar muismodel van pindaallergie anafylaxie. Dit nieuwe model is gebaseerd op twee belangrijke factoren: (1) antigeen-specifieke splenocytes worden adoptively overgebracht van een pinda-gesensibiliseerde muis in een naïef ontvangende muis, normaliseren van het aantal antigeen-specifieke geheugen B - en T-cellen over een groot aantal muizen; en (2) ontvangende muizen zijn vervolgens versterkt met een sterke multivalent immunogeen in de vorm van liposomaal nanodeeltjes worden getoond op het grote pinda allergeen (Ara h 2). Het grote voordeel van dit model is de reproduceerbaarheid, die uiteindelijk het aantal dieren in elke studie verlaagt, terwijl het minimaliseren van het aantal dieren ontvangen meerdere injecties van adjuvans gebruikt. De modulaire vergadering van deze immunogene liposomen biedt relatief facile aanpassingsvermogen aan andere allergische of auto-immune modellen waarbij Pathogeen antilichamen.

Inleiding

Voedselallergie is van invloed op 8% van de kinderen in de Verenigde Staten, en in de prevalentie is toegenomen in de afgelopen tien jaar1. Allergie voor pinda is van invloed op 1% van de kinderen en is niet typisch ontgroeid2. Hoewel verschillende veelbelovende klinische proeven zijn aan de gang voor de behandeling van voedselallergie, met inbegrip van mondelinge immunotherapie (OIT), sublinguale immunotherapie (SLIT) en epicutaneous immunotherapie (EPIT), zijn er momenteel geen FDA-goedgekeurde behandelingsstrategieën voor desensibilisatie pinda-allergische personen3,4,5,6,7,8. Allergische personen moeten daarom strikt allergenen Voorkom anafylaxie. Veel vragen blijven met betrekking tot routes van sensibilisatie en onderliggende mechanismen van voedsel allergie ontwikkeling.

Muismodellen zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van de mechanismen van allergie, alsmede het ontwikkelen van nieuwe tolerogenic en desensibilisatie therapieën9,10,11,12. Dit geldt met name omdat het grote pinda allergeen (Ara h 2; Ah2) bij de mens is ook het dominante allergeen in verschillende beschreven muis modellen13,14. Terwijl Muismodellen van de pindaallergie zijn van onschatbare waarde bij het bestuderen van de mechanismen van sensibilisatie en tolerantie, is een nadeel dat ze kunnen variabele worden en het gebruik van hulpstoffen vereisen. Meer potente immunogenen zou één manier om te minimaliseren van de intrinsieke variabiliteit van dergelijke modellen. Omdat B-cellen zijn sterk geactiveerd door multivalent antigenen, zijn antigene liposomen weergeven van het allergeen een goede optie omwille van hun vermogen om potentieel B-cellen activeren door de B-cel receptor (BHG), terwijl ook de eigenschap van efficiënt het compartiment van de T-cel via worden overgenomen door de niet-specifiek antigeen-presentatie priming cellen.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor eiwit antigenen aan Liposomale nanodeeltjes met behulp van een strategie voor facile en modulaire conjugating. Met behulp van een surrogaat antigeen, anti-IgM Fab fragment, we laten zien hoe krachtig deze antigene liposomen kunnen in stimulerende B-cel-activatie. Antigene liposomen weergeven Ah2 antigeen werden gebruikt voor het ontwikkelen van een nieuwe muismodel van toegekende gevoeligheid. In dit model worden splenocytes van geverifieerde pinda allergische muizen, met pinda-specifieke geheugen B - en T-cellen, overgebracht naar de naïeve congenisch muizen. Geheugen antilichaam reacties worden veroorzaakt door injectie van liposomen geconjugeerd met Ah2 in de ontvangende muizen, zodat antilichamen tegen Ah2 ertoe worden aangespoord. Gevolgd door slechts één boost met oplosbare Ah2, leiden Ah2-specifieke antilichamen tot een sterke anafylactische reactie wanneer deze muizen zijn vervolgens uitgedaagd met Ah2. Zoals muizen ondergaan de allergische reactie op een zeer uniforme wijze reageren hebt en niet een adjuvans, deze benadering is een wenselijk pindaallergie model en de uitkomsten suggereren dat het nut in andere Muismodellen gedreven door antigenen die gericht wellicht allergenen en eventueel autoantigens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De algemene methode van eiwit koppelen aan lipide en integratie in liposomen is grotendeels gebaseerd op eerdere werk15. Alle dierlijke hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Alle muizen gebruikt in het model van de pindaallergie zijn BALB/cJ vrouwtjes gekocht bij op 3 weken leeftijd. De Universiteit van Alberta dierenverzorgers en gebruiken Comité (ACUC) heeft goedgekeurd experimenten met gebruik van muis milt voor ex vivo analyse van C57Bl/6 muizen van ten minste 6 weken oud.

1. de vervoeging van eiwit-antigeen tot een gepegyleerde lipide

  1. Voeg 3 g kruislings gekoppelde dextran gel kralen met een fractionering bereik van 1.500 tot 30.000 Dalton (Da) in een maatkolf van 250 mL vacuüm. Voeg 60 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voortdurend roeren met een magnetische roer bar. De erlenmeyer en hechten aan een vacuüm te leiden-vergassing op een bord roer voor een minimum van 1 h.
  2. Toevoegen in een 1.0 x 30 cm glas chromatografie kolom met de stop van de omzet gesloten, PBS naar de kolom om te wassen. Open de omzet stop en afvoer van de kolom. De gier van de getankte kralen na wassen, toevoegen aan de kolom. Voortdurend toe te voegen de drijfmest totdat de kolom is verpakt op een kraal hoogte van ongeveer 24 cm.
  3. Zodra de kolom een 'hoofd' van ongeveer 4-5 cm van PBS boven de ingepakte kralen heeft, hebben de volgende stappen klaar.
    1. Maak een hevel zwaartekracht stroom door het meten van een stukje slang lang genoeg te bereiken een plank 1 – 2 voeten boven de top van de kolom en maak een lus die druppels in de buurt van de onderkant van de kolom en keert terug naar de top van de kolom. Een stopper van de omzet aan één uiteinde van de buis, één kant van de buis open verlaten toevoegen. Plaats het einde open buis in een 500 mL fles van PBS en plaats op de plank boven de kolom.
    2. Neem het einde met de omzet stop en hechten een 10 mL spuit. Open de omzet stop klep op de regel van de buis en PBS trekken door de buis. Zodra de PBS driekwart van de weg door de buis bereikt heeft, snel de spuit verwijderen en toevoegen van de omzet-stop naar de top van de kolom — vloeistof moet worden uitgevoerd op de kolom.
      Nota: Het bedrag van de 'hoofd' van PBS links bovenaan de kolom moet tussen 1 en 3 cm. De minimale hoeveelheid te wassen van de kolom is 3 delen van de kolom.
  4. Bepaalt de hoeveelheid eiwit (mollen) moet worden gekoppeld aan lipide op basis van het molecuulgewicht (MW).
    Opmerking: Het Fab fragment van geit-antimuis IgM (zelf een IgG) wordt gebruikt als een universele surrogaat antigeen voor polyklonale stimulatie van B-cellen. Dienovereenkomstig, de Fab fragment van geit IgG heeft een MW van ongeveer 48 kiloDalton (kDa) en is commercieel beschikbaar in een totale hoeveelheid 1,3 mg. Zo is de hoeveelheid eiwit worden gekoppeld 27.1 µmol.
  5. Bepaal de coëfficiënt van de extinctie van de proteïne van belang. Indien onbekend, meet de absorptie van eiwitten bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer en verdeel de waarde280 A door het aantal mol berekend in stap 1.4.
    Opmerking: Het uitsterven co-efficiënt van Fab van geit IgG op 280 nm is 64,600 M-1.
  6. Om ervoor te zorgen dat trace bedragen van amine-bevattende buffer worden verwijderd, het desalt van de proteïne van de kolom die is gemaakt in stappen 1.1-1.3 en het verzamelen van eiwitfracties in 1,5 mL microcentrifuge buizen (~ 500 µL per fractie).
    1. Sluit de omzet stop klep aangesloten op de top van de kolom en de bovenzijde van de kolom te verwijderen. Zoniet al open, open de omzet stop klep aan de onderkant van de kolom en wachten tot de 'hoofd' van PBS de bovenkant van de kralen raakt.
    2. Voeg langzaam in de proteïne van belang naar de top van de parels met behulp van een glazen pipet van Pasteur, voorzichtig om te minimaliseren van de verstoring naar de top van de kralen.
    3. Zodra de 'hoofd' van de eiwit-oplossing de top van de parels bereikt, voeg 1 mL PBS zachtjes via een pipet van Pasteur. Herhaal dit drie keer. PBS voor het maken van een hoofd van 4-5 cm en herhaal stap 1.3 te wassen de kolom toevoegen.
      Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen als vaststaat dat er geen amine-bevattende buffer aanwezig is.
  7. Bepalen van de breuken die eiwitten door het meten van de A280 waarden bevat en bundelen de breuken die ongeveer 90% herstel van het eiwit geven.
    Opmerking: Dit meestal verdunt de eiwit 1.5-2-vouw. Bepaal de eiwitconcentratie na pooling. Concentreren het eiwit bij deze stap indien nodig, met behulp van een concentrator centrifugeren.
  8. 2.5 molaire equivalent van de crosslinker van de heterobifunctional aan het eiwit toevoegen.
    1. Eerst Weeg ongeveer 5 mg succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionaat (SPDP, MW = 314 g/mol) in een microcentrifuge buis. Om te bepalen het volume te ontbinden van de SPDP, neem de molaire eiwitconcentratie en vermenigvuldig het door 250 x voor het genereren van een 100 x-oplossing die een 2.5 molaire overmaat in de reactie zal geven.
      Opmerking: bijvoorbeeld, als de eiwitconcentratie 50 µM is, een oplossing van SPDP bij 12,5 mM nodig. 5 mg SPDP, komt dit overeen met 1,27 milliliters dimethylsulfoxide (DMSO).
  9. SPDP aan de proteïne van belang bij een verdunning 1:100 toevoegen. Plaats de reactie op een oscillerende shaker bij kamertemperatuur (RT) gedurende ongeveer 1 uur.
  10. Verwijderen van de overtollige SPDP en beschermen van de endogene bisulfide-bond(s), in het eiwit in de verdere verlaging stap, equilibreer en wassen van de kolom die is gemaakt stappen 1.1-1.3 in 100 mM Natriumacetaat (NaOAc) bij pH 5.5 of maakt u een identieke kolom uitsluitend voor gebruik in deze buffer.
  11. Desalt na een incubatieperiode van 1 h met SPDP, het eiwit op de kolom geëquilibreerd in 100 mM NaOAc. Uitvoeren van deze stap op identieke wijze als stap 1.6 behalve gebruik van 100 mM NaOAc (pH 5.5) als de elutievloeistof. Verzamelen van de breuken, bepalen de A280en bundelen van de bovenste breuken. Was de kolom in PBS.
  12. Bereiden van een oplossing van 2.5 M van DTT (MW = 154 g/mol) in dubbel gedestilleerd water (ddH2van O). 25 mM DTT toevoegen aan de gepoolde fracties van eiwitten voor 5-10 min.
  13. Meten van de A-280 van het eiwit en verdeel dit door het uitsterven coëfficiënt. Ook bepalen de A343. Bereken de koppeling verhouding op basis van de molarity van eiwitten (een280) en linker (een343).
    Opmerking: De A340 auto-kalibratie indien uitschakelen met behulp van een spectrofotometer nanodrop. De meting van de343 A vertegenwoordigt de extinctie van de pyridine-2-thion groep (uitsterven coëfficiënt = 7550 M-1) dat is verwijderd uit de cross-linker van de SPDP door de DTT. Een molaire verhouding voor linker: eiwitverhouding van 1,2 – 1,5 wordt over het algemeen bereikt bij het uitvoeren van de reactie met een 2.5 molaire overmaat van SDPD over een breed scala van eiwitten.
  14. De gepoolde fracties overreden door de kolom gewassen in PBS zoals hierboven beschreven. Verzamelen van de fracties, bepalen van de A-280en zwembad top breuken. Bepaal de concentratie van proteïne door A280 na bundeling van de fracties.
  15. DSPE-PEG bereiden (2000)-Maleimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-Maleimide. Dit zal worden toegevoegd aan het eiwit op een molaire 10:1-verhouding. Bereiden een 100 x voorraad van DSPE-PEG (2000)-Maleimide tot de gewenste concentratie.
    1. Bijvoorbeeld, als de eiwitconcentratie 10 µM na stap 1.14 is, bereiden een voorraad van DSPE-PEG (2000)-Maleimide op 10 mM. Weeg zorgvuldig DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) en voeg de juiste hoeveelheid DMSO. Meerdere rondes van zachte vortexing en sonicating kunnen het volledig opgelost krijgen.
  16. Bepalen van het totale volume van de breuken uit stap 1.14 en breng de oplossing kwantitatief zorgvuldig in een klein (10-25 mL) ronde onderkant kolf (RBF). Voeg de juiste hoeveelheid 100 x DSPE-PEG (2000)-Maleimide op de proteïne te bereiken een 1 x, 10-fold molaire overtollige, definitieve concentratie. Zachtjes swirl de oplossing om ervoor te zorgen dat de DMSO volledig is verspreid.
  17. Reactie 's nachts onder stikstof worden uitgevoerd in een verzegelde RBF. Gebruik een rubber tussenschot en plaats in een zuurkast.
    1. Verwijder de sfeer door het septum prikken met een naald van 20 G gekoppeld aan een spuit met 3 mL aan het eind van de slang gekoppeld aan een vacuüm, en vacuüm voor 3 – 5 s inschakelen.
    2. De sfeer wordt vervangen door stikstof. Vul een ballon gekoppeld aan een 3 mL spuit snij doormidden met stikstof en hechten een naald van 20 G. Aanprikken van het septum te vullen de sfeer binnen de kolf met ronde bodem met stikstof. De verwijdering van de sfeer en de vervanging met stikstof nogmaals herhalen en laat de ballon van de stikstof die 's nachts aangesloten.
  18. Een aparte kruislings gekoppelde dextran gel kraal kolom met fractionering allerlei 4.000 – 150.000 Da in een 1.0 x 50 cm glas chromatografie kolom (volgens stappen 1.1-1.3) voor te bereiden.
  19. De volgende dag, verwijder het eiwit uit de ronde onderkant kolf bereid in stap 1.17 en run (volg de methode die wordt gebruikt in stap 1.6) over de kruiselings gekoppelde dextran gel kraal kolom (uit stap 1.18).
    Opmerking: Het totale bedrag te laden op de kolom dient niet meer dan 2 mL. Als een grotere reactie werd gebruikt, in tweeën splitsen en uitvoeren op afzonderlijke kolommen of op een grotere diameter kolom uitgevoerd.
    1. Verzamelen van de fracties en bepalen de A280, zwembad top breuken, bepaal de concentratie van eiwitten. De aanwezigheid van het lipide zal niet van invloed op de metingen.
  20. Bewaren de definitieve gepoolde fracties van lipide-linked eiwit bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.

2. liposoom voorbereiding

  1. Weeg de lipiden: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol; Cholesterol (3b-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; en DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol. maken een 5 mg/mL oplossing van 2 mg/mL oplossing van DSPE-PEG(2000) in chloroform, 4 mg/mL oplossing van Cholesterol en DSPC.
  2. Zorg ervoor dat de molaire verhouding van lipiden in de liposomen: 57% DSPC, 38% Cholesterol, en 5% DSPE-PEG(2000), zoals wordt weergegeven in tabel 1.
    Opmerking: Het is belangrijk om te controleren van de hoeveelheid antigeen op de liposomen, die in het algemeen van 0.01-0,1 varieert %. In tabel 1, wordt 0.1% van geit-antimuis IgM Fab fragment gekoppeld aan gepegyleerde lipide gebruikt. Het is van cruciaal belang rekening te houden voor de 10-fold Kies overtollige van DSPE-PEG (2000)-Maleimide die is toegevoegd aan het eiwit in stap 1.15, om ervoor te zorgen dat de totale hoeveelheid gepegyleerde lipide 5% niet overschrijdt.
  3. Overwegen de definitieve lipide bedragen (µmol) bij het maken van lipiden voor extrusie. Zie tabel 1 voor een voorbeeld van de berekening van de molaire lipide concentraties voor de oprichting van liposomen op een 1,25 µM totale vetgehalte.
  4. Zodra het juiste bedrag van elke lipide te worden bij elkaar opgeteld is berekend, combineren in een reageerbuis van 12 mL borosilicaat glas.
  5. Afblazen zorgvuldig de chloroform.
    1. Gebruik de slang en een 3 mL-spuit met naald, in stap 1.17.1, willen zorgvuldig afblazen chloroform in de buis met stikstof. Zachtjes blazen een stroom van stikstof over de oplossing terwijl het draaien van de buis met de andere hand. Wees voorzichtig tot een minimum beperken spatten of het veroorzaken van de vloeistof manier moet worden uitgevoerd op de kant van de buis als het kan moeilijker om dit in de oplossing in de volgende stap.
  6. Voeg 100 µL van DMSO aan elke buis en 's nachts lyophilize van deze oplossing. Betrekking hebben op de top van de buis met een niet-statische laboratorium doekje, veilig met een rubberen band, en bevriezen van-80 ° C.

3. liposoom extrusie

  1. Voeg 1 mL PBS die eiwit lipide-gekoppeld aan de 12 mL-buis met de lipiden bevatten. Bewerk de oplossing voor ongeveer 30 ultrasone trillingen ten s tot 1 min in een waterbad ultrasoonapparaat. Voor 5 min of meer rust tussen elke ronde en 3-4 keer herhaalt.
  2. Een extruder bereiden volgens de aanwijzingen van de fabrikant.
    1. Het filter ondersteunt toevoegen aan de interne membraan steun, plaats een paar druppels (elke 10 µL) van PBS op paraffine film. Met pincet, pak een rand van de filterondersteuning en dompel het in het drop-10 µL.
    2. Plaats de filter binnen de O-ring. Doe dit voor beide zijden. Met pincet, pak een 0.8 µm filter op de rand en duik in het drop-10 µL en jas van de buitenkant van de O-ring met PBS. Plaats de 0.8 µm filter zachtjes op de O-ring zodat het filter niet over hang de interne membraan ondersteunt.
  3. Plaats de extruder verwarming blok op een warm bord om te Verwarm de extruder. Overschakelen van de verwarmingsplaat op laag en laat de extruder verwarmen blok te bereiken van de gewenste temperatuur. Om te voorkomen dat potentiële problemen met eiwit aggregatie, niet verwarmen het blok afgelopen 37 ° C.
  4. Laad het sonicated monster in een van de extruding spuiten in de extruder geplaatst. Plaats de extruder spuit in het andere einde van de extruder. Zorg ervoor dat de lege spuit zuiger is ingesteld op nul. De lege spuit zal vullen zoals de lipide is geëxtrudeerd via het polycarbonaat 0.8 µm membraan. Probeer te vermijden bubbels heen en weer door het membraan passeren.
  5. Plaats de volledig geassembleerd extruder in het blok van de verwarming. Duw de plunjer van de gevulde spuit met lipiden voorzichtig de lege spuit. Afhankelijk van het vetgehalte, zal dit moeilijk om erdoor te worden. Herhaal 20 x.
  6. De volledig geassembleerd extruder van de verwarming-blok verwijderen. Langzaam de gevulde spuit uit de extruder verwijderen, moet u voor het verzamelen van alle lipiden die lekken kunnen uit bij het verwijderen. Plaats liposomen in een schoon flesje. Herhaal de stappen met behulp van 3.4 – 3.6 polycarbonaat 0,2 µm en 0.1 µm membranen.
  7. Maak een 0.7 x 50 cm2 kruislings gekoppelde agarose kraal kolom met scheiding 0,7-10 aantal Mega Dalton (MDa) geëquilibreerd in PBS. De liposomen toevoegen en uitvoeren zoals in stap 1.6. Breuken met liposomen zal zijn gedaald transmissie van licht in de 250-400 nm-bereik.
  8. Sla de liposomen bij 4 ° C en niet invriezen.

4. calcium Flux om te controleren van de B-cel activatie door antigene liposomen

  1. Euthanaseren muizen door kooldioxide (CO2) of Isofluraan overdosis, volgens institutionele operationele standaardprocedures. Bevestig euthanasie van muizen door cervicale dislocatie.
  2. Het steriliseren van chirurgische instrumenten en muizen karkas met 70% ethanol. Gebruik 10 cm lang, 0.8 mm tip, gebogen iris pincet om te scheiden van de huid die betrekking hebben op de borstholte van de ribbenkast. Gebruik 10 cm lange, rechte ontrafeling schaar om een distale incisie met een bilaterale incisie.
  3. Gebogen iris pincet en ontleden schaar gebruiken om de milt uittreksel uit de buikholte. Vetweefsel rond de milt te verwijderen en vervolgens plaatst u deze in een 15 mL polystyreen conische buis gevuld met RPMI1640 gemiddeld met 1% foetaal kalfsserum (FCS), en penicilline-streptomycine.
  4. Overdracht milt en media over een 40 µm cel zeef gemonteerd op een kegelvormig tube van 50 mL. Met behulp van het einde van de rubber van een zuiger van de spuit 3 mL, zachtjes verpletteren de milt. Wassen van de 40 µm cel zeef met de media. Herhaal dit proces totdat alleen vetweefsel wordt overgelaten in de 40 µm cel zeef. Spoel de zeef met 3-5 mL van de media te verhogen van herstel van de cel.
  5. Centrifugeer cel homogenaat bij 300 x g gedurende 5 min op RT. Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en voeg 10 mL 1 x RBC lysis-buffermengsel tot de pellet. Pipetteer omhoog en omlaag, laat gedurende 2-3 minuten bij RT en dan Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de rode bloedcel verarmd splenocytes in 10 mL van de media. Cel totaal getallen met behulp van een hemocytometer of andere cel tellen apparaat bepalen. Pellet de cellen door middel van centrifugeren, zoals hierboven beschreven.
    Opmerking: De ideale eindconcentratie nodig voor het laden van de Indo-1 van splenocytes is 10-20 x 106 cellen/mL, maar een lagere concentratie van cellen kan worden gebruikt.
  7. Splenocytes bij 15 x 106 cellen/mL in calcium flux laden van de buffer (RPMI1640 medium dat 1% FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 1 mM magnesiumchloride (MgCl2), 1 mM ethyleenglycol-bis (resuspendeer Β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Dinatriumethyleendiaminetetra zuur (EGTA), en 5% penicilline-streptomycine). Toevoegen in 1,5 µM Indo-1 uit een DMSO stamoplossing van 1 mM, omkeren de buis meerdere malen te mengen. Beschermen tegen licht en Incubeer de cellen op het waterbad 37 ° C gedurende 30 minuten.
  8. Na de 30 min incubatie, toevoegen in 5 x de hoeveelheid calcium flux laden van de buffer. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 min op RT.
  9. Vlek voor het gating op B cellen, cellen met 1:200-antimuis CD5-PE en anti-muis 1:200 B220-PE/Cy7 in 0,5 mL van het laden van de buffer bij 4 ° C gedurende 20 min, beschermd tegen licht.
  10. Splenocytes wassen in calcium flux laden buffer en centrifuge op 300 x g gedurende 7 minuten op RT. resuspendeer cellen bij 10-20 x 106 cellen/mL in calcium flux met buffer (Henks uitgebalanceerd zoutoplossing (HBSS) met 1% FCS, 1 mM MgCl2 en 1 mM calciumchloride (CaCl2)). Opslaan op het ijs, beschermd tegen licht tot klaar om te draaien op stroom cytometer.
  11. Setup stroom cytometry met onbevlekt en één vlek controles voor compensatie.
    1. Voer de gekleurde cellen de poorten op de juiste manier inrichten (Zie figuur 2A). Setup van Indo-1 (violet) versus de plot van de Indo-1 (blauw), aanpassen van de spanningen in de kanalen van de Indo-1 om de cellen kleuring aan een helling van 45 – 60 ° te maximaliseren van het signaal: ruisverhouding van de Indo-1 violet: blauwe verandering in verhouding na stimulatie van de B-cel.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de spanningen niet te hoog is zijn, zodanig dat een aanzienlijk percentage van de cellen (> 5%) zijn tegen de bovenkant van de plot.
    2. Maken van een diagonale poort die het bovenste linker gedeelte (Violet+blauw-) van het perceel kapselt, zodanig zijn dat zonder stimulatie < 10% van de cellen zijn in de poort, die idealiter tot stijgen moet > 75% na stimulatie.
  12. Voeg 0,5 mL van cellen een afgetopte 5 ml ronde onderkant polystyreen buis (fluorescentie-activated cell sorting (FACS) buis) en warm de cellen tot 37 ° C gedurende 3-5 minuten in een waterbad. Plaats de buis FACS in de 37 ° C water-jacketed kamer die is aangesloten op een opnieuw circulerende waterbad.
    1. Uitvoeren van de buis de water-jacket op de cytometer van de stroom en acquisitie, starten zonder het opslaan van de gegevens, op ongeveer 5.000-10.000 evenementen/s. Zodra de cellen hebben gestabiliseerd (15-30-s), initiëren data acquisitie en verzamelen gegevens voor ten minste 10 s om de achtergrond.
    2. Op de 10 s merk, snel verwijderen van de buis van de stroom cytometer, voeg de stimulatie (5-50 mM antigene liposomen in 2 tot 20 mL), pulse vortex en FACS buis op het stroom cytometer terug. Handhaven data-acquisitie en opslag door middel van deze tijd en verzamelen van gegevens voor 3-5 min.
  13. Gegevens analyseren in passende analysesoftware onder de kinetiek functies.

5. bereiding van pinda Extract

  1. Uittreksel pindaproteïnen door het mengen van pinda meel in een verhouding van 1:5 (wt:vol) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 M natriumchloride (NaCl). Meng de oplossing op magnetische roer plaat voor 2 h op RT behoud bij pH 8,5.
  2. Centrifuge oplossing bij 3000 x g gedurende 45 min bij 4 ° C. Decanteren en filter-steriliseren supernatant opeenvolgend door een 0.4 µm filter gevolgd door een 0,2 µm filter. Bepaal eiwitconcentratie bicinchoninic zuur (BCA) assay gebruikend bovien serumalbumine (BSA) als norm.
  3. Verminderen en denatureren van een steekproef van pindaproteïnen met 50 mM dithiothreitol (DTT) in een buffer met lithium dodecyl sulfaat bij een pH van 8.4, waarmee een maximale activiteit van de reductor en warmte bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
  4. 10 µg gedenatureerde pinda eiwit op een Bis-Tris 4-12% precasted polyacrylamidegel ontworpen om optimale scheiding kleurovergang gel met molecuulgewicht vooraf gekleurd standaard uitgevoerd.
  5. Vlekken van de gel met disulfonated triphenylmethane en destain met ddH2O. Identify bekend grote pinda-allergenen Ara h 1, 2 en 3 in uittreksel preparaten. Ara h 1 verschijnt op 63 kDa, Ara h 2 moet worden weergegeven als twee isoforms op 17 en 19 kDa en Ara h 3 verschijnt op 37 kDa (zure subeenheid).

6. overgevoeligheid voor muizen aan pinda

  1. Resuspendeer 1 mg Cholera-toxine in 1 mL ultrazuiver water. 200 µL verdund pinda extract bevat 2 mg pinda eiwit en 10 µg cholera-toxine in PBS voorbereiden.
  2. 200 µL van de pinda extract met Cholera-toxine (2 mg pinda eiwit en 10 µg Cholera-toxine) via mondelinge maagsonde aan elke 4 – 5 week oud BalB/cJ vrouwelijke muis beheren. Herhaal keer per week gedurende drie weken (d.w.z., dag 0, 7, en 14).
  3. Toedienen van 300 µL verdund pinda extract (bevat pinda eiwit 5 mg en 10 µg Cholera-toxine) via mondelinge maagsonde aan elke muis in de vierde week (dat wil zeggen, dag 21).

7. uitdaging muizen met pinda Extract

  1. Bereid pinda extract tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL in PBS op dag 28. Maatregel basislijn lichaam temperaturen met behulp van een rectale thermometer (ongeveer 37,5-38.5 ° C). 200 µL (200 µg) beheren van pinda uittreksel via intraperitoneaal (i.p.) injectie.
  2. Lichaamstemperatuur meten met rectale thermometer, wordt elke 15 min voor 1 h na de injectie. Een duik in de lichaamstemperatuur geeft aan allergie voor pinda.
    Opmerking: Hypothermie is een kenmerk van anafylaxie in muizen. Deze uitdaging zal aantonen dat muizen allergisch voor pinda zijn. 90% van de Balb/cJ muizen die ondergaan van het protocol van overgevoeligheid ontwikkelen meestal allergische reacties tijdens uitdaging gekenmerkt door ten minste een daling van de temperatuur 2 – 3 ° C.

8. isolatie van Splenocytes van allergische muizen en adoptief overdracht

  1. Isoleren van de splenocytes van naïef en pinda allergische muizen.
    1. Op dag 30, euthanaseren zowel naïef en bevestigde pinda allergische muizen door het toedienen van 3 L/min voor CO2 in een gaskamer. Bevestig euthanasie van muizen door bilaterale Thoracotomie. Het steriliseren van chirurgische instrumenten en muis karkas met 70% ethanol. Gebruik pincet te scheiden van de huid die betrekking hebben op de borstholte van de ribbenkast. Gebruik rechte ontleden schaar om een bilaterale incisie de linker en rechter ribben breken.
    2. Pincet en ontleden schaar gebruiken om de milt uittreksel uit de buikholte. Verwijderen vetweefsel rond milt alvorens in polystyreen 15 mL conische buis, gevuld met 10 mL RPMI 1640 medium te plaatsen.
    3. Giet in een steriele laminaire flow kap, milt en media in een 35 mm polystyreen petrischaal. Naïef en allergische splenocytes houden in aparte petrischalen en media tijdens cel isolatie. Gebruik gesteriliseerde pincet en ontleden schaar milt in drieën gesneden en terugkeren naar de petrischaal.
    4. Met behulp van de ruwe, matte rand van twee glazen Microscoop dia's, zachtjes Meng (in RPMI) de milt stukken tot Wit weefsel tussen dia's blijft. Dia's tussen groepen wijzigen.
    5. Cel homogenaat van petrischaal overbrengen door een 70 µm cel zeef gemonteerd op een kegelvormig tube van 50 mL. De overgebleven fragmenten van de milt passeren door de zeef met een zuiger van een injectiespuit 1 mL. Spoel de zeef met 5 mL van de RPMI te maximaliseren van de terugwinning van de cel. Filtraat overbrengen in een polystyreen 15 mL conische buis en centrifuge (450 x g, 10 min, RT).
    6. Gecombineerd supernatant en resuspendeer cel pellet in 2 mL rode bloedcellen lysis-buffermengsel (0,83% ammoniumchloride in 10 mM Tris buffer, pH 7,2) toe te voegen. Meng en Incubeer bij RT gedurende 2 – 3 min. Voeg toe 10 mL PBS - 2% FBS en centrifuge op 300 x g gedurende 7 minuten op RT.
    7. Wassen van de cellen opnieuw met 12 mL PBS - 2% FBS volledig verwijderen van alle resterende ammoniumchloride, en centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 minuten bij RT. resuspendeer cel pellet in 2 mL zuiver RPMI 1640 medium. Cellen tellen met behulp van een hemocytometer of een automatische hematologie analyzer.
  2. Gebruik een 27 G, 5/8-inch naald op een insuline spuit van 1 mL, intraveneus injecteren 15 x 106 allergische of naïeve splenocytes geëxtraheerd zoals hierboven beschreven (in 200 µL) via de staart vein in muizen naïef (unsensitized).

9. injectie van muizen met Ara h 2 antigene liposomen

  1. Bereiden Ah2 liposomen met 0,1% Ah2 op 2.5 mM lipide. Voor de berekening van eiwitconcentratie, is de coëfficiënt uitsterven van Ah2 15.000 M-1. Verdunde liposomen tot 300 µM in steriele PBS.
  2. Een dag na adoptie overdracht (dag 31) van allergische of naïeve splenocytes, intraveneus injecteren 200 µL van PBS of de Ah2 antigene liposomen (300 µM) bevatten een totaal van 1.38 Ah2 via de ader van de staart van de BALB/cJ muizen die de splenocytes in stap hebt ontvangen µg 8.2.

10. boost en uitdaging van muizen met Ara h 2

  1. Twee weken na de injectie met Ah2 liposomen, op dag 45, gebruiken een 4 mm dierlijke lancet te verzamelen van 50-200 µL bloed vanaf de submandibulaire samenvloeiing van de muis. Verzamelen van bloed in een serum scheidingsteken buis zonder heparine; aparte het serum door centrifugatie bij 6.000 x g gedurende 15 min. gebruiken de verzamelde serum later naar maatregel antigeen-specifieke antilichamen.
  2. Op dag 46, twee weken na het injecteren van muizen met liposomen (stap 9.2), stimuleren van muizen door een i.p. injectie van 200 µL van PBS of 200 µg oplosbare Ah2 (gezuiverd zoals eerder beschreven16).
  3. Op dag 60, 50-200 µL bloed vanaf de submandibulaire samenvloeiing van de muis verzamelen en verwerken van bloed, zoals eerder is beschreven.
  4. Op dag 61, uitdaging elke groep van muizen met een injectie i.p. 200 µL van 300 µg oplosbare Ah2. Lichaam temperaturen meten met rectaal sonde elke 15 min zoals in afdeling 7.

11. kwantificering van Ara h 2-specifieke IgE en IgG1 door ELISA

  1. Een 96-Wells enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) jas-compatibel plaat met 100 µL HSA-DNP (2,4-dinitrophenyl hapten geconjugeerd aan menselijk serumalbumine, 20 µg/mL) voor standaard curve of Ah2 (5 µg/mL) serummonsters verzameld in stappen 10.1 en 10.3, verdund coating buffer (50 mM carbonaat-bicarbonaat buffer, pH 9,6) bij 4 ° C's nachts of 37 ° C gedurende > 1 h.
  2. Wassen drie keer met 200 µL PBS-T (PBS met 0,05% Tween-20) en blokkeren van putjes met 200 µL PBS-T bevattende 2% BSA bij 37 ° C gedurende > 2 h.
  3. Toevoegen voor Ah2-specifieke IgE ELISA, 50 µL IgE-anti-DNP normen (2 – 0.002 µg/mL, bereid met seriële verdunningen 1:2) of muis serummonsters (1:20 verdunning) en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Voor Ah2-specifieke IgG1 ELISA, voeg 100 µL gezuiverd IgG1-anti-DNP-normen (2 – 0.002 µg/mL, bereid met seriële verdunningen 1:2) of muis serummonsters (1:500 verdunning) en na een nacht bebroeden bij 4 ° C of 1 uur bij 37 ° C.
  4. Wassen drie keer met 200 µL PBS-T. Voor Ah2-specifieke IgE ELISA, voeg 100 µL schapen anti-muis IgE (0,5 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 100 µL voor Ah2-specifieke IgG1 ELISA, HRP geit anti-muis IgG1 (verdund 1:40,000 in PBS-T - 2% BSA). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  5. Wassen drie keer met 200 µL PBS-T. Ah2-specifieke IgE ELISA, voeg 100 µL biotinyleerd-Donkey anti-schapen IgG (0,5 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Voor Ah2-specifieke IgG1 ELISA, wip voor trede 11,7.
  6. Wassen drie keer met 200 µL PBS-T. Voor Ah2-specifieke IgE ELISA, voeg 100 µL betalen neutraal avidin-mierikswortelperoxidase (bijvoorbeeldNeutrAvidin-HRP, 0,3 µg/mL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  7. Voeg 100 µL 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidine (TMB) substraat, incubeer 10-15 minuten of totdat monsters donkerblauw, voegt u 100 µL TMB eindeoplossing. Lees de plaat bij 450 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vervoeging van de proteïne van belang met DSPE-PEG(2000) kan worden aangetoond door het uitvoeren van een vermindering een toename in tonen moleculair gewicht in vergelijking met de unconjugated proteïne. Figuur 1A toont een representatieve gel van anti-muis IgM F(ab) fragment geconjugeerde PEG-DSPE, waarin een bandshift kDa 2-3 voor de gedenatureerde proteïne. Merk op dat ongeveer 50% van het eiwit lijkt te worden gewijzigd, die verwachting gezien het feit d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier geschetste methoden zijn een algemeen protocol voor de vervoeging van een proteïne aan een lipide waarmee de weergave van het eiwit op Liposomale nanodeeltjes. Voor zeer grote multi subeenheid eiwitten, dit protocol mogelijk beperkte nut. De ideale methode zou zijn de invoering van een specifieke code waarmee een biorthogonal chemische koppelen strategie om te worden gebruikt. Als uiting van het eiwit recombinantly, kan dit met behulp van beschikbare site-specifieke strategieën17, en een b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van het ministerie van defensie (W81XWH-16-1-0302 en W81XWH-16-1-0303).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Model 2110 Fraction CollectorBioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma grade 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
ExtruderAvanti6100001 mL spuit met houder/verwarmingsblok
Filters 0.1 µmAvanti610005
Filters 0.8 µmAvanti610009
10 mm Filter SupportsAvanti6100014
Glass Round Bottom FlaskSigmaZ100633
Turnover stoppersThermo Fisher ScientificP-301398
TubingThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Sephadex G50 BeadsGE Life Sciences17004201
Sephadex G100 BeadsGE Life Sciences17006001
Heat Inactivated Fetal Calf SerumThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x RBC lysis BufferThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112zonder calcium en magnesium
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anti-mouse IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
Peanut flourGolden Peanut Co.52127112% vet licht gebrand, 50% eiwit
Animal feeding needlesCadence Science792022g x 1.5", 1.25 mm - recht
Microprobe thermometerPhysitempBAT-12
Rectal probe for micePhysitempRet-3
Cholera toxin, from Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100BAzide vrij
BCA Protein Assay KitPierce23225
Carbonate-bicarbonate bufferSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL5120-0077
96 well Immulon 4HBX plateThermo Scientific3855
Purified soluble Ara h 2N/AN/Agezuiverd zoals in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE anti-DNPAccurate ChemicalBYA60251
Sheep anti-Mouse IgEThe Binding SitePC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgGAccurate ChemicalJNS065003
NeutrAvidin Protein, HRPThermoFisher Scientific31001
Mouse IgG1 anti-DNPAccurate ChemicalMADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL Insulin SyringesBD329412U-100 Insulin, 0.40 mm (27 G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope SlidesFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1.0 mm
ACK Lysing Buffergibco by Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
Cell StrainerCorning35235070 μm Nylon, White, Sterile, Individueel verpakt
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standardInvitrogenLC5925500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL
```

Referenties

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Liposomale nanodeeltjesAra h 2-allergeenpindaallergie-modeladoptieve transferisolatie van splenocytenflowcytometriecalciumflux-assayELISA-detectieliposoomextrusie
Antigene liposomen voor generatie van ziekte-specifieke antilichamen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.