Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis

10.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58299

⸱

8 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor model menselijke tuberculose in een volwassen zebrafish met behulp van de natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum. Geëxtraheerde DNA en RNA van de inwendige organen van besmette zebrafish kan worden gebruikt om te onthullen dat het totaal mycobacteriële ladingen in de vis en de immuunrespons van de gastheer met qPCR.

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis is momenteel de dodelijkste menselijke pathogenen veroorzaakt 1,7 miljoen doden en 10,4 miljoen infecties per jaar. Blootstelling aan deze bacterie veroorzaakt een spectrum van brede ziekte bij mensen variërend van een gesteriliseerde infectie tot een actief vordert dodelijke ziekte. De meest voorkomende vorm is de latente tuberculose, die asymptomatisch, maar heeft het potentieel om te activeren in een fulminant ziekte. Volwassen zebravis en haar natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum onlangs zijn gebleken een toepasselijke model te bestuderen van het spectrum van brede ziekte van tuberculose. Belangrijker, kunnen spontane latency, evenals reactivering en adaptieve immuunresponsen in het kader van mycobacteriële infecties bestudeerd worden in dit model. In dit artikel beschrijven we methoden voor de experimentele besmetting van volwassen zebravis, de collectie van interne organen voor de winning van nucleïnezuren voor de meting van mycobacteriële ladingen en host immuunrespons door kwantitatieve PCR. De in-huis ontwikkelde, M. marinum -specifieke qPCR assay gevoeliger is dan de traditionele plating-methoden zoals het detecteert ook DNA uit niet-delende, slapende of onlangs gestorven mycobacteriën. Zoals zowel DNA en RNA worden geëxtraheerd uit dezelfde persoon, is het mogelijk om te bestuderen van de relaties tussen de zieke toestand, en de gastheer en ziekteverwekker gen-expressie. De volwassen zebrafish model voor tuberculose dus profileert zich als een zeer toepasselijke, bij niet-zoogdieren in vivo systeem te bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties.

Inleiding

Zebrafish (Danio rerio) is een veel gebruikte diermodel in biomedisch onderzoek en het is een geaccepteerde model voor gemeenschappelijke gewervelde biologie. De zebravis is aangepast aan vele gebieden van onderzoek modellering van menselijke ziekten en stoornissen variërend van kanker1 en cardiale ziekte2 aan besmetting en immunologische studies van verschillende bacteriële 3 en virale infecties4 , 5. bovendien de ontwikkeling ex utero van zebravis embryo's heeft gemaakt de zebravis een populair model in Ontwikkelingsbiologie6 en toxicologie7,-8.

Op vele terreinen van onderzoek, met inbegrip van infectie biologie, worden het optisch transparant zebrafish larven meestal gebruikt. De eerste immune cellen wordt binnen 24 uur bericht bevruchting (hpf), primitieve macrofagen zijn gedetecteerde9. Neutrofielen zijn de volgende immune cellen te verschijnen ongeveer 33 hpf10. Zebravis larven zijn dus haalbaar voor de studie van de vroege stadia van de infectie en de rol van aangeboren immuniteit in de afwezigheid van adaptieve immuuncellen11. De volwassen zebrafish met haar volledig functionele adaptieve immuunsysteem biedt echter een extra laag van complexiteit voor infectie experimenten. T-cellen kunnen worden gedetecteerd rond 3 dagen na bevruchting12, en B cellen zijn in staat om functionele antilichamen te produceren door 4 weken bericht bevruchting13. De volwassen zebrafish heeft alle de belangrijkste tegenposten van de zoogdieren aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De belangrijkste verschillen tussen de immune systems van vis en mensen worden aangetroffen in antilichaam isotypes zo goed zoals in de anatomie van lymfoïde weefsels. De zebravis heeft slechts drie antilichaam klassen14, terwijl mensen vijf15 hebben. In de afwezigheid van beenmerg en lymfeklieren, de primaire lymfoïde organen in de vis zijn de thymus16 , de nieren en de milt, de nieren en de darmen dienen als secundaire lymfoïde organen17. Ondanks deze verschillen met zijn volledige immuun arsenaal van aangeboren en adaptieve cellen, is de volwassen zebrafish een zeer toepasselijke, easy-to-use, bij niet-zoogdieren model voor gastheer-Ziekteverwekker Interactie studies.

De laatste tijd is de zebravis opgezet als een haalbaar model te bestuderen van tuberculose18,19,20,21,22. Tuberculose is een airborne ziekte veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis. Volgens de World Health Organization, tuberculose veroorzaakt1,7 miljoen sterfgevallen in 2016 en is de belangrijkste oorzaak van de dood door een enkele pathogen wereldwijd23. Muizen24,25, konijnen,26 en27 van de niet-menselijke primaten zijn dat de bekendste diermodellen met tuberculose onderzoek maar elk gezicht hun beperkingen. Het model van de niet-menselijke primaten van M. tuberculosis infectie lijkt de ziekte bij de mens meest nauw, maar met behulp van dit model is beperkt als gevolg van ernstige ethische overwegingen. Andere dierlijke modellen worden belemmerd door de gastheerspecificiteit van M. tuberculosis , dat is van invloed op de ziekte pathologie. Waarschijnlijk het grootste probleem in het modelleren van tuberculose is het brede spectrum van infectie en ziekte resultaten in de menselijke ziekten: tuberculose is een zeer heterogene ziekte variërend van steriliseren van immuniteit tegen infectie van het latente, actief en opnieuw geactiveerde28 , die moeilijk te reproduceren en experimenteel model kan zijn.

Mycobacterium marinum is een nauwe verwant van M. tuberculosis met ~ 3.000 orthologous eiwitten met 85% aminozuur identiteit29. M. marinum infecteert natuurlijk zebrafish granulomas, de kenmerken van tuberculose, in de interne organen19,30te produceren. In tegenstelling tot andere dierlijke modellen gebruikt bij tuberculose-onderzoek, zebravis produceert veel nakomelingen, het vereist slechts een beperkte ruimte en nog belangrijker is, het is neurophysiologically het minst ontwikkelde gewervelde tuberculose model beschikbaar. Bovendien, veroorzaakt de M. marinum infectie latente infectie, actieve ziekte of zelfs sterilisatie van mycobacteriële infecties in volwassen zebrafish nauw het nabootsen van het spectrum van ziekte resultaten van menselijke tuberculose19, 31 , 32. hier, we worden methoden beschreven voor het model van de experimentele tuberculose van volwassen zebrafish door M. marinum injecteren in de buikholte en kwantitatieve PCR te gebruiken voor het meten van de mycobacteriële ladingen en de immuunrespons van de zebravis weefselmonsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle zebrafish experimenten zijn goedgekeurd door de Board Experiment dier in Finland (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Methoden worden uitgevoerd volgens de wet (497/2013) en het regeringsbesluit (564/2013) betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke of educatieve doelen in Finland.

1. het kweken van Mycobacterium marinum

Opmerking: Aangezien Mycobacterium marinum een ziekteverwekker kan oppervlakkige infecties veroorzaken bij de mens is, ontdek de lokale richtsnoeren voor persoonlijke veiligheid en afvalverwijdering van het biohazard voordat het begint te werken met deze bacterie.

  1. M. marinum op een 7 H 10 cultuur plaat aangevuld met 10% OADC (oliezuur, albumine, dextrose, katalase) verrijking en 0,5% v/v glycerol bij 29 ° C gedurende ten minste 5 dagen. M. marinum culturen handhaven door het nemen van verse bacteriën uit de diepvries om de twee weken en overzetten op een nieuwe bord om de andere week.
    Opmerking: M. marinum is een natuurlijke vis pathogenen infecteren van aquatische soorten en het is belangrijk om het nemen van voorzorgsmaatregelen niet te besmetten zebrafish voorraden met de bacteriën. Geïnfecteerde zebravis en items die zijn besmet met bacteriën moeten gescheiden worden gehouden van de fok faciliteiten.
  2. Gebruik een steriele 1-µL inoculatie lus aseptisch een entoog van M. marinum bacteriële massa overbrengen in een maatkolf van de cel-cultuur met 10 mL 7 H 9 gemiddeld met 10% ADC (albumine, dextrose, katalase) verrijking, 0,2% v/v polysorbaat 80 en 0.2% v/v van glycerol. Cultuur voor 3-4 dagen tot ongeveer een OD600 (extinctie) van 0,7 bij 29 ° C in het donker zonder schudden. Laat het GLB los, of gebruik een filter dop, te voorzien in de voldoende uitwisseling van gassen.
    Opmerking: Polysorbaat 80 wordt toegevoegd aan het medium om te voorkomen dat de samenvoeging van bacteriën. Bovendien leidt blootstelling aan licht tot fenotypische veranderingen in bacteriële kolonies (bijvoorbeeld, de kleur verandert van wit naar geel). Om dit te vermijden, houden de culturen in het donker.
  3. De OD-waarde600meten met een spectrofotometer. Verdun de vloeibare cultuur tot een OD600 van 0,07 – 0,09 en blijven kweken voor 2 dagen bij 29 ° C in het donker zonder schudden. Laat de dop los.
    Opmerking: Tijdens deze twee dagen, zal de bacteriële schorsing een OD600van ongeveer 0,5 correspondeert met een vroege log-fase bereiken.

2. voorbereiding van bacteriële oplossing voor het infecteren van volwassen zebravis

  1. Spoel de bacteriële suspensie in een grote steriele cuvette of een tube van 15 mL en plaats deze in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten zodat de grootste bosjes te regelen.
  2. Breng de top 5 – 7 mL van de schorsing in een schone buis of een cuvet en meten van de OD600. Gebruik deze bovenste fase van de schorsing voor de infecties.
  3. 1 mL van M. marinum cultuur in een verse buis en centrifuge voor 3 min op 10.000 x gverzamelen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL steriele 1 x PBS.
  4. Vul aan tot de gewenste bacteriële concentratie bereiken met behulp van steriele 1 x PBS met 0,3 mg/mL fenol rood als een tracer. De verdunde schorsing in drie aliquots verdelen.
    Opmerking: Gebruik een vooraf bepaalde OD600 vs. kve (kolonie-vormende eenheden) / µL curve te schatten de verdunning die nodig is om het gewenste aantal bacteriën in de 5 µL injectie volume34. De correlatie tussen OD600 en concentratie van de bacteriële suspensie moet worden gevalideerd voordat de werkelijke infectie experimenten. Reserveren twee weken voor het verzamelen van deze gegevens validatie.
  5. Behulp van een spuit van 1 mL, langzaam Trek de schorsing door een 27 G naald 3 x. Voer voor elk aliquot, deze stap vlak voor gebruik.
    Opmerking: Gebruik niet dezelfde bacteriële oplossing voor meer dan 2 uur.

3. experimental M. marinum infectie met intraperitoneale injectie

  1. Pipetteer een druppel 5 µL van de verdunde bacteriële oplossing op een stuk van parafilm film en trek de druppel in een 30 G insuline naald.
  2. Gebruik 5 – 8 maand-oude wild-type vis en rag1−/−hu1999 mutant voor het experiment. Anesthetize volwassen zebrafish in de tank water met 0,02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0). Plaats de vis ventrale zijde omhoog in een spleet op een vochtige geschuimde kunststof.
    Opmerking: Rag-/- mutant vis kunnen geen somatische recombinatie ondergaan en functionele T en B-cellen produceren.
  3. Injecteer de naald tussen de pelvic fins op een hoek van ongeveer 45°. Houd de naald opening naar boven om te constateren dat de gehele opening in de buikholte. Langzaam Injecteer de bacteriële schorsing en verwijder voorzichtig de naald.
    Opmerking: In het geval dat de rode tracer lekt uit de vis na injectie, de vis van het experiment uitsluiten.
  4. Breng de vissen in een herstel tank met verse tank water onmiddellijk na de injectie.
  5. Neemt monsters van de bacteriële suspensie op 7H 10 platen van elke 15 min van de bacterietelling aliquoot in gebruik en Incubeer de bacteriën bij 29 ° C gedurende 5 dagen en bevestig de infectie dosis door optelling van de kolonies op de platen.
  6. Controleer regelmatig of het welzijn van de vissen en euthanaseren geen vis met symptomen van de infectie met meer dan 0,02% concentratie van 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0).
    Opmerking: Ongeveer 7% van de volwassen zebrafish besmet met 34 ± 15 CFU en 30% van de zebravis besmet met 2029 ± 709 CFU zullen hebben symptomen door 8 weken19. De symptomen kunnen omvatten abnormale zwemmen, gebrek aan respons op touch, hijgend, oedeem of waarneembare verspillen.
  7. De zebravis volgens de gemeenschappelijke normen35te handhaven.

4. verzameling van inwendige organen

  1. De zebravis met een overdosis van 3-aminobenzoic acid ethyl ester (meer dan 0,02% concentratie, pH 7.0) in het water tank euthanaseren.
  2. Plaats een pin posterieure naar de branchiostegal stralen en een andere via de staart naar de vis op het platform overstag.
  3. Open de hele buikholte met een scalpel en de inwendige organen verzamelen met behulp van een kleine lepel en sharp-ended pincet. Begin vanuit het hart en werk langs de rug naar de staart om alle inwendige organen in één blok los te maken.
    Opmerking: Zorg ervoor dat alle nierweefsel verzamelen door schrapen langs de wervelkolom met de lepel.
  4. Tot slot, gebruik pincet loskoppelen van de darm naast de cloaca en de overdracht van de organen in een tube homogenisering 1,5 mL met zes 2,8 mm keramische kralen. Onmiddellijk plaats op droog-ijs te bevriezen van het monster. Het monster kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot gehomogeniseerd.
  5. Spoel de instrumenten met 70% ethanol tussen individuen.

5. de homogenisering en RNA extractie van een orgel-blok.

Opmerking: De methode is gewijzigd van de Stanford University protocollen36.

  1. Toevoegen van guanidine kaliumthiocyanaat-fenol oplossing gebruikt voor nucleïnezuur extractie (Tabel of Materials) op de bovenkant van het monster tot een totaal volume van 1.500 µL. ervoor zorgen dat het monster heeft betrekking op een maximum van 10% van het totale volume.
    Let op: Het verwachte volume van het geoogste weefsel is 100 µL. Guanidine kaliumthiocyanaat-fenol oplossing bevat giftig en irriterende stoffen en vereist beschermende kleding, handschoenen van nitril en werken in een zuurkast. Niet combineren met bleekmiddel omdat dit leiden de vorming van giftige gassen tot zal. Lees het veiligheidsinformatieblad (MSDS) vóór gebruik.
  2. Meng monsters met behulp van een kraal-kloppend homogenizer 3 keer voor 40 s bij 3200 rpm. Cool op ijs voor 30 s tussen de cycli. Bewerk ultrasone trillingen ten de gehomogeniseerde monsters in een waterbad voor 9 min.
  3. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en 1.000 µL van het gewiste homogenaat verhuizen naar een verse microcentrifuge buis.
  4. Voeg 200 µL van chloroform, onmiddellijk meng met vortexing voor 15 s en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    Let op: Chloroform is een giftig en irriterend samengestelde inademing, opname door de mond of contact met de huid of ogen. Gebruik van de nodige veiligheidsvoorzieningen voor persoonlijke bescherming en werken in een zuurkast. Lees het veiligheidsinformatieblad (MSDS) vóór gebruik.
  5. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C te scheiden van de waterige en organische fase.
  6. Breng zorgvuldig, 500 µL van de bovenste fase aan een verse buis om te voorkomen dat besmetting van het RNA. Verwijderen en negeren de rest van de waterige fase (~ 100 µL) en bewaar de interfase en organische fase bij 4 ° C voor DNA-extractie.
    Nota: De bovenste fase omvat de RNA.
  7. Voeg 500 µL van 2-propanol en onmiddellijk meng door vortexing voor 15 s. Incubate gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te precipiteren van RNA.
  8. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet RNA. Verwijder het supernatant door pipetteren.
  9. Voeg vervolgens 1 mL van 75% ethanol en vortex voor 10 s.
    Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de monsters bewaard 's nachts bij 4 ° C.
  10. Centrifugeer bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door pipetteren.
  11. Herhaal de stappen wassen 5,9 – 5.10. Verwijder het supernatant zorgvuldig door pipetteren en laat de pellet drogen in een zuurkast.
  12. Los van de RNA-pellet in 500 µL van nuclease-gratis water en houd de monsters op ijs. De concentraties te meten met een spectrofotometer microvolume of gelijkwaardige apparatuur. Winkel de RNA bij-80 ° C.

6. zuivering van mede uitgepakte zebravis en mycobacteriële DNA

  1. Bereiden van een buffer van de terug-winning (BEB) door het oplossen van 118.2 g guanidine kaliumthiocyanaatoplossing (eindconcentratie 4 M), 3.68 g Natriumcitraat (eindconcentratie 50 mM) en 30.29 g voor Tris vrije base (eindconcentratie 1 M) in 120 mL nuclease-gratis water (dit kan ««nodig 's nachts roeren). Voeg nuclease-gratis water toe tot een totale eindvolume van 250 mL en filter om de oplossing te steriliseren.
    Opmerking: Deze buffer kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor maximaal 6 maanden. Combineer BEB niet met bleekmiddel, aangezien ze reageren voor de productie van giftige gassen zoals waterstof chloride en waterstof cyanide.
  2. Gebruik de interfase en organische fase voor het monster extraheren mycobacteriële DNA. 500 μL van BEB toevoegen aan elke buis. Mix uitgebreid voor 10 min door inversie bij kamertemperatuur.
  3. Centrifugeer de buizen bij 12.000 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en breng zorgvuldig 500 µL van de bovenste waterige fase waarin het DNA aan een nieuwe buis.
  4. Voeg 400 l 2-propanol. Meng door omkeren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Een pellet met het DNA moet zichtbaar zijn op dit punt. Verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren.
  6. Voeg 800 l 70% ethanol. De pellet wassen door inversie. Doen niet vortex de monsters op dit punt, zoals genomic DNA gemakkelijk breekt.
  7. Centrifugeren van de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof door pipetteren. Herhaal de ethanol wassen (stap 6.6 en 6.7).
  8. Verwijder de ethanol door zorgvuldig pipetteren. Laat die de monsters luchtdroog voor 5-10 min. ontbinden de pellet in 200 μL van de nuclease-gratis water.
  9. DNA concentraties te meten met een spectrofotometer microvolume of gelijkwaardige apparatuur. DNA kan worden opgeslagen bij 4 ° C of bij-20 ° C voor langdurige opslag.

7. kwantitatieve PCR voor het meten van mycobacteriële ladingen

  1. Voorbereiden qPCR reactie mixen met neen-ROX (carboxy-X-rhodamine) tegen de M. marinum interne getranscribeerde spacer (ITS) tussen 16S-23S ITS volgens de instructies van de fabrikant met MMITS1 inleidingen (tabel 1). Pipetteer de reactie mix en proef de verdunningen als duplicaten op een 96-wells-plaat geschikt voor qPCR. Een standaard verdunningsreeks van de DNA van een bekende hoeveelheid bacteriën in elke serie opnemen.
    Opmerking: De verwachte belasting van de M. marinum per vis kan variëren van 0 CFU tot 1.000.000 CFU op 4 wpi. De bepaling van de qPCR kan ook worden uitgevoerd met andere qPCR-kits, maar de onthardende temperatuur voor de inleidingen moet opnieuw geoptimaliseerd worden.
  2. Afdichting van de plaat met een optisch transparante film samen en centrifugeer de plaat bij 2.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.
  3. Voer het programma van de qPCR weergegeven in de tabel 2.
  4. Met behulp van de standaard curve, berekenen het aantal bacteriën in de hele vis monster.

8. DNase behandeling van de monsters van RNA

  1. Om te verwijderen elke mogelijke resterende sporen van genomic DNA van het RNA, verrichten DNase ik behandeling. Ontdooi de RNA-monsters op ijs.
    Opmerking: Zorg dat alleen RNase-gratis apparatuur en oplossingen gebruiken en veeg het werkoppervlak en pipetten met een reagens van de decontaminatie elimineren van RNases (Tabel of Materials) voordat u begint te werken. Draag een laboratoriumjas met lange mouwen en handschoenen ter bescherming van uw monsters.
  2. Bereiden van 10 μL DNase ik reactie mixes op ijs volgens de instructies van de fabrikant. Meng 1 μL van DNase 1 μL van 10 x DNase buffer en 8 μL van RNA proeven, inclusief een maximum van 1 μg van RNA.
  3. Voorzichtig mengen de reacties (geen vortexing) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  4. Voeg 1 µL van 50 mM EDTA aan elk 10 µL monster voorafgaand aan warmte-inactivering. Als EDTA wordt niet toegevoegd, zal het RNA chemische aantasting bij verhitting ondergaan.
  5. Incubeer gedurende 10 minuten bij 65 ° C tot warmte-inactivering DNase I. blijven rechtstreeks aan cDNA synthese of op te slaan van het RNA DNase behandeld bij-80 ° C.

9. cDNA synthese

  1. Houd alle reagentia en monsters op het ijs en de reactie mixen volgens de instructies van de fabrikant te bereiden. Voor een 5 μl reactie mix, omvatten 1 μL van Reverse transcriptie Master Mix, 3 μL van de nuclease-gratis water en 1 μL van DNase behandeld RNA.
  2. Meng voorzichtig de omgekeerde transcriptie reacties en kort draaien de buis, indien nodig.
  3. Leg monsters in een PCR-machine en gebruik van het programma weergegeven in tabel 3.
  4. Verdun de cDNA in nuclease-gratis water voor qPCR tot een maximale concentratie van 2,5 ng/μl, indien nodig. cDNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C.

10. meten Zebrafish genexpressie door kwantitatieve PCR

  1. Voorbereiding van een master mix van qPCR op ijs volgens de instructies van de fabrikant en beschermen tegen licht. Gebruik de inleidingen geïntroduceerd in tabel 1.
    Opmerking: Als u wilt berekenen van de vouw van inductie voor elk gen, meten de expressie ook uit een monster van de gepaarde basislijn 6 gezonde zebrafish is onttrokken.
  2. Bereiden van replicaat-organismen van elk monster en Pipetteer het mixen van de reactie op een bord qPCR. Afdichting van de plaat met een optisch transparante film samen en centrifugeer de plaat bij 2.000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C alvorens de run te beginnen.
  3. Uitvoeren van het qPCR programma weergegeven in de tabel 4 met de onthardende temperatuur afhankelijk van de paar primer gebruikt (tabel 1).
  4. Het analyseren van de gen-expressie verhouding ten opzichte van een gen van de house-keeping (loopern437) met de methode van de ΔCt met behulp van de vergelijking:
    figure-protocol-1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De natuurlijke vis pathogen Mycobacterium marinum infecteert de inwendige organen van de zebravis en produceert een systemische infectie met histologisch zichtbare granulomen19. Volwassen zebrafish zijn besmet met M. marinum door een intraperitoneale injectie. Het DNA en RNA worden uitgepakt, en de mycobacteriële belasting wordt gemeten door kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) met behulp van DNA als de sjabloon. De omtrek van de methode...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een qPCR gebaseerde toepassing voor het meten van mycobacteriële ladingen uit DNA geëxtraheerd uit experimenteel geïnfecteerde volwassen zebrafish weefsels. Deze toepassing is gebaseerd op inleidingen ontworpen rond de 16S-23S rRNA interne getranscribeerde spacer reeks40. De totale mycobacteriële vracht in een vis monster wordt geschat met behulp van een standaard curve bereid uit DNA geëxtraheerd uit een bekend aantal gekweekte mycobacteriën en uitgaande van dat die ene bacter...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd door de Finse culturele stichting (H.L.), Tampere tuberculose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Stichting van de Finse vereniging van anti-tuberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., ondersteund M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane and ihmissusi Erkko Foundation (M.P.) en Academy of Finland (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo en Jenna Ilomäki zijn erkend voor hun technische bijstand. De auteurs erkennen het Tampere Zebrafish laboratorium voor hun dienst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mycobacterium marinumAmerican Type Culture CollectionATCC 927
Middlebrock 7H10 agarBD, Thermo Fisher Scientific11799042
Middlebrock OADC verrijkingBD, Thermo Fisher Scientific11718173
Middlebrock 7H9 mediumBD, Thermo Fisher Scientific11753473
Middlebrock ADC verrijkingBD, Thermo Fisher Scientific11718173
Tween 80Sigma-AldrichP1754
GlycerolSigma-AldrichG5516-500ML
GENESYS20 SpectrophotometerThermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS)Sigma-AldrichP4417-50TAB
Phenol redSigma-AldrichP3532
27 G naaldHenke Sass Wolf4710004020
1 mL spuitHenke Sass Wolf4010.200V0
Omnican 100 30 G insulinenaaldBraun9151133
3-aminobenzoëzure ethylester (pH 7,0)Sigma-AldrichA5040
1,5 mL homogenisatiebuisQiagen13119-1000
2,8 mm keramische kralenQiagen13114-325
Ethanol, ETAX AaAltia
2-propanolSigma-Aldrich278475
ChloroformVWR22711.290
GuanidinethiocyanaatSigma-AldrichG9277FW 118,2 g/mol
NatriumcitraatSigma-Aldrich1613859FW 294,1 g/mol
Tris (vrije base)Sigma-AldrichTRIS-ROFW 121,14 g/mol
TRI reagentMolecular Research CenterTR118Guanidinethiocyanaat-fenoloplossing
PowerLyzer24 homogenisatorQiagen
Sonicator m08Finnsonic
Nanodrop 2000Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master MixBiolineBIO-98005
qPCR 96-well plateBioRadHSP9601
Optisch transparante filmBioRadMSB1001
C1000 Thermal cycler met CFX96 real-time systeemBioRad
RNase AWAYThermo Fisher Scientific10666421decontaminatiemiddel dat RNases elimineert
DNase IThermo Fisher ScientificEN0525
Reverse Transcription Master MixFluidigm100-6298
SsoFast Eva Green master mixBioRad172-5211

Referenties

  1. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 34, 80(2015).
  2. Bournele, D., Beis, D. Zebrafish models of cardiovascular disease. Heart failure reviews. 21 (6), 803-813 (2016).
  3. Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in cell biology. 28 (2), 143-156 (2018).
  4. Varela, M., Figueras, A., Novoa, B. Modelling viral infections using zebrafish: Innate immune response and antiviral research. Antiviral Research. 139, 59-68 (2017).
  5. Goody, M. F., Sullivan, C., Kim, C. H. Studying the immune response to human viral infections using zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 84-95 (2014).
  6. Thisse, C., Zon, L. I. Organogenesis--heart and blood formation from the zebrafish point of view. Science. 295 (5554), 457-462 (2002).
  7. Eimon, P. M., Rubinstein, A. L. The use of in vivo zebrafish assays in drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (4), 393-401 (2009).
  8. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  9. Wittamer, V., Bertrand, J. Y., Gutschow, P. W., Traver, D. Characterization of the mononuclear phagocyte system in zebrafish. Blood. 117 (26), 7126-7135 (2011).
  10. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of leukocyte biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  11. Yoshida, N., Frickel, E., Mostowy, S. Macrophage-Microbe interactions: Lessons from the Zebrafish Model. Frontiers in Immunology. 8, 1703(2017).
  12. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  13. Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental and comparative immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
  14. Hu, Y., Xiang, L., Shao, J. Identification and characterization of a novel immunoglobulin Z isotype in zebrafish: Implications for a distinct B cell receptor in lower vertebrates. Molecular immunology. 47 (4), 738-746 (2010).
  15. Danilova, N., Bussmann, J., Jekosch, K., Steiner, L. A. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nature immunology. 6 (3), 295-302 (2005).
  16. Zapata, A., Diez, B., Cejalvo, T., Frias, C. G., Cortes, A. Ontogeny of the immune system of fish. Fish & shellfish. 20 (2), 126-136 (2006).
  17. Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  19. Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum Causes a Latent Infection that Can Be Reactivated by Gamma Irradiation in Adult Zebrafish. PLoS Pathog. 8 (9), 1-14 (2012).
  20. Tobin, D. M., et al. Host Genotype-Specific Therapies Can Optimize the Inflammatory Response to Mycobacterial Infections. Cell. 148 (3), 434-446 (2012).
  21. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current opinion in microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  22. Berg, R. D., Ramakrishnan, L. Insights into tuberculosis from the zebrafish model. Trends in molecular medicine. 18 (12), 689-690 (2012).
  23. World Health Organization. WHO Global tuberculosis report 2017. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
  24. Ordonez, A. A., et al. Mouse model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Disease Models & Mechanisms. 9 (7), 779-788 (2016).
  25. Kramnik, I., Beamer, G. Mouse models of human TB pathology: roles in the analysis of necrosis and the development of host-directed therapies. Seminars in Immunopathology. 38 (2), 221-237 (2016).
  26. Manabe, Y. C., et al. The aerosol rabbit model of TB latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome. Tuberculosis. 88 (3), 187-196 (2008).
  27. Pena, J. C., Ho, W. Monkey Models of Tuberculosis: Lessons Learned. Infection and immunity. 83 (3), 852-862 (2015).
  28. Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 691-702 (2017).
  29. Stinear, T. P., et al. Insights from the complete genome sequence of Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis. Genome research. 18 (5), 729-741 (2008).
  30. Swaim, L. E., Connolly, L. E., Volkman, H. E., Humbert, O., Born, D. E., Ramakrishnan, L. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity. Infection and immunity. 74 (11), 6108-6117 (2006).
  31. Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes new Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196(2016).
  32. Luukinen, H., et al. Priming of Innate Antimycobacterial Immunity by Heat-killed Listeria monocytogenes Induces Sterilizing Response in Adult Zebrafish Tuberculosis Model. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  33. Sar, A. M., Abdallah, A. M., Sparrius, M., Reinders, E., Vandenbroucke-Grauls, C., Bitter, W. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infection and immunity. 72 (11), 6306-6312 (2004).
  34. Madigan, M., Martinko, J. Brock Biology of Microorganisms. , (2016).
  35. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish:a practical approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  36. Anonymous Stanford University Protocols. , Available from: http://med.stanford.edu/labs/vanderijn-west/Protocols.html (2018).
  37. Vanhauwaert, S., et al. Expressed Repeat Elements Improve RT-qPCR Normalization across a Wide Range of Zebrafish Gene Expression Studies. Plos One. 9 (10), e109091(2014).
  38. Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-Type Response Associates with Restricted Bacterial Growth in Latent Mycobacterial Infection of Zebrafish. Plos Pathogens. 10 (6), e1004190(2014).
  39. Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
  40. Roth, A., Fischer, M., Hamid, M. E., Michalke, S., Ludwig, W., Mauch, H. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. Journal of clinical microbiology. 36 (1), 139-147 (1998).
  41. Rajararna, M. V. S., Ni, B., Dodd, C. E., Schlesinger, L. S. Macrophage immunoregulatory pathways in tuberculosis. Seminars in immunology. 26 (6), 471-485 (2014).
  42. Vynnycky, E., Fine, P. The natural history of tuberculosis: the implications of age-dependent risks of disease and the role of reinfection. Epidemiology and infection. 119 (2), 183-201 (1997).
  43. Cobat, A., et al. Two loci control tuberculin skin test reactivity in an area hyperendemic for tuberculosis. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2583-2591 (2009).
  44. Delogu, G., Goletti, D. The Spectrum of Tuberculosis Infection: New Perspectives in the Era of Biologics. Journal of Rheumatology. 41, 11-16 (2014).
  45. Abel, L., et al. Genetics of human susceptibility to active and latent tuberculosis: present knowledge and future perspectives. Lancet Infectious Diseases. 18 (3), E75(2018).
  46. Guryev, V., et al. Genetic variation in the zebrafish. Genome research. 16 (4), 491-497 (2006).
  47. Brown, K. H., et al. Extensive genetic diversity and substructuring among zebrafish strains revealed through copy number variant analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 529-534 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Tuberculosemodelintraperitoneale injectiekwantitatieve PCRextractie van nucleïnezurenimmuunrespons van de gastheermeting van de bacteriële loadadaptieve immuniteitlatente infectie
Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.