Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van epididymaire eiwitsynthese en afscheiding

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/58308

⸱

25 augustus 2018

 ,  ,  ,  , 
1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

In dit artikel

Samenvatting

Wij rapporteren hier, de lokalisatie van de immunofluorescentietest voor dynamin ter illustratie van de protocollen voor de detectie van eiwitten in paraffine-ingebedde muis epididymaire secties en die van een vereeuwigd epididymaire cellijn (mECap18). Ook beschrijven we de protocollen voor de isolatie van proteïnen van de secretoire van zowel epididymaire vloeistof en geconditioneerde cel media.

Samenvatting

De zoogdieren bijbal genereert een van de meest complexe intraluminale vloeistoffen van een endocriene klier ter ondersteuning van de post-testiculaire rijping en opslag voor spermacellen. Dergelijke complexiteit ontstaat als gevolg van de gecombineerde secretoire en absorberend activiteit van de epitheliale cellen van de voering. Hier beschrijven we de technieken voor de analyse van epididymaire eiwitsynthese en secretie door zich te concentreren op het eiwit modelgezin van dynamin (DNM) mechanoenzymes; grote GTPases die de potentie hebben om reguleren bi-directionele membraan mensenhandel gebeurtenissen. Voor de studie van eiwit expressie in epididymaire weefsel beschrijven wij robuuste methodologie voor het labelen van de immunofluorescentie doel eiwitten in paraffine-ingebedde secties en de daaropvolgende opsporing van de ruimtelijke spreiding van deze eiwitten via immunofluorescentie microscopie. Ook beschrijven we geoptimaliseerde methodologie voor de isolatie en de karakterisering van exosome zoals blaasjes, bekend als epididymosomes, die worden uitgescheiden in de epididymaire lumen deelnemen aan intercellulaire communicatie met de rijping van de zaadcellen. Als een complementaire aanpak beschrijven we ook de immunofluorescentie detectie van doel eiwitten in een cellijn SV40-vereeuwigd muis caput epididymaire epitheliale (mECap18). Bovendien bespreken we het nut van de mECap18 cellijn als een model geschikt in vitro met voor het verkennen van de regulering van epididymaire secretoire activiteit. Voor dit doel beschrijven we de kweken eisen voor het onderhoud van de cellijn van mECap18 en het gebruik van selectieve farmacologische remming regimes die kunnen beïnvloeden hun secretoire eiwit-profiel. De laatste zijn beoordeeld gemakkelijk via het oogsten van geconditioneerde kweekmedium, concentratie van proteïnen toe secreted via trichloorazijnzuur/aceton neerslag en hun latere analyse via de SDS-pagina en immunoblotting. Wij betogen dat deze gecombineerde methoden geschikt voor de analyse van alternatieve epididymaire eiwit doelstellingen als een prelude zijn op de bepaling van hun functionele rol in de rijping van de zaadcellen en/of opslag.

Inleiding

De spermacellen van alle soorten zoogdieren verwerven de mogelijkheden om weer vooruit progressieve mobiliteit te geven en om een eicel te bevruchten tijdens hun langdurige afdaling via de bijbal, een zeer gespecialiseerde gebied van de mannelijke extra testiculaire kanaalsysteem, die kan 7-14 dagen om te navigeren (afhankelijk van de soort)1. Als gevolg van de extreme condensatie van de chromatine vaderlijke en het vergieten van de meerderheid van het cytoplasma die hoort bij de cytodifferentiation van spermacellen in de teelballen, wordt hun latere functionele rijping gedreven uitsluitend door hun interactie met de epididymaire communicatie. Dit milieu is, op zijn beurt, gemaakt door de secretoire en absorberend activiteit van de voering epididymaire soma en geeft een uitzonderlijke niveau van segment-segment variatie1. Dus, de meest actieve segmenten op het gebied van de eiwitsynthese en secretie zijn gelegen in het proximale deel van de bijbal (namelijk, de caput en corpus)2. Deze activiteit komt overeen met de functionele Profiel van spermatozoïden, met het eerste begin van de cellen weer te geven van de kenmerken van functionele bevoegdheid (dwz., progressieve mobiliteit en het vermogen om te binden aan zuur-ontbindend zona glycoproteïnen) volgende hun passage door het caput bijbal3. Deze functionele kenmerken blijven ontwikkelen vóór het bereiken van optimale niveaus als de zaadcellen de distale epididymaire segment (cauda) bereiken, waarin ze zijn opgeslagen in een rustige staat in gereedheid voor de ejaculatie. De vorming en het onderhoud van dit sperma opslag reservoir is ook nauw verbonden met de voering epitheel, die in de cauda wordt gedomineerd door sterke absorberend activiteit4,5. Hoewel anatomische verschillen gerapporteerde6,7,8 geweest, lijkt dergelijke regionale verdeling van de arbeid te zijn een kenmerk van de bijbal die wordt gedeeld door de meerderheid van de soorten zoogdieren studeerde tot nu toe, met inbegrip van onze eigen9,10. Inderdaad, vanuit klinisch oogpunt, het is bekend dat epididymaire dysfunctie levert een belangrijke bijdrage aan de etiologie van mannelijke factor onvruchtbaarheid11, dus wijzen op het belang van inzicht in de regulering van deze gespecialiseerde weefsel.

Het is daarom betreurenswaardig dat ons begrip van epididymaire fysiologie, en de mechanismen die de opeenvolgende fasen van rijping van de zaadcellen en opslag binnen dit weefsel, reguleren blijven worden volledig opgelost. De bijdragende factoren behoren beperkende voorschotten in epididymaire onderzoek tot de algehele complexiteit van dit weefsel en kennis van de mechanismen die het uitoefenen van regelgevende controle over haar luminal communicatie. Anatomisch, weten we dat buiten het onderscheid van caput, corpus en cauda segmenten, de bijbal kan verder worden onderverdeeld in verschillende zones (figuur 1A), elk gescheiden door septa12 en gekenmerkt door aparte profielen van gene/eiwit expressie13,14,15,16,17,18. Inderdaad, op basis van gedetailleerde transcriptionele profilering van gesegmenteerde genexpressie in de bijbal, maar liefst 6 en 9 verschillende epididymaire zones zijn gemeld in de muis en rat modellen, respectievelijk19,20. Dergelijke complexiteit vermoedelijk weerspiegelt de samenstelling van de epididymaire soma, een pseudostratified epitheel bestaat uit talrijke verschillende soorten cellen; elke verschillen met betrekking tot hun overvloed, distributie en secretoire/absorberend activiteiten langs de lengte van het darmkanaal. Belangrijkste cellen zijn dus veruit de meest voorkomende epididymaire cel type vormen meer dan 80% van alle epitheliale cellen. Dienovereenkomstig, belangrijkste cellen zijn verantwoordelijk voor het grootste deel van epididymaire eiwit biosynthese en secretie5. Daarentegen zijn de cel wissen bevolking, die gerangschikt als de tweede meest voorkomende celtype binnen de epididymaire soma, voornamelijk betrokken bij selectieve absorptie van luminal componenten en de verzuring van deze communicatie-5. Een andere laag van complexiteit toe te voegen, uitoefenen androgenen en andere lumicrine factoren van testiculaire oorsprong differentiële controle over elk van deze epididymaire celtypes afhankelijk van hun plaats langs de tractus.

Ondanks de beperkingen opgelegd door dergelijke complexiteit, blijven belangrijke inbreuk worden gemaakt in het oplossen van de mechanistische basis van epididymaire functie. Een sleutel tot deze studies is de toepassing van geavanceerde massaspectrometrie strategieën om grootschalige voorraden van de epididymaire Proteoom, samen met gedetailleerde analyses van individuele eiwitten gekozen uit deze eerste onderzoeken geweest. Een illustratie van deze benadering is onze recente karakterisering van de DNM-familie van mechanoenzymes in de muis model21. Onze eerste interesse in DNM werd aangewakkerd door haar dubbele werking in de koppeling van exo- en endocytotic processen. Voortbouwend op deze opmerkingen, konden we aantonen dat de drie canonieke isoforms van DNM (DNM1 - DNM3) zijn sterk in de bijbal muis uitgedrukt en op de juiste manier gepositioneerd om te voldoen aan regelgeving rollen in eiwit secretie en absorptie21 . Bovendien konden we duidelijk onderscheid elke DNM-isovorm op basis van hun cellulaire en sub cellulaire lokalisatie, dus suggereren dat zij elkaar aanvullen, in tegenstelling tot de redundante, activiteit binnen de epididymaire epitheel-21bezitten.

Hier beschrijven we de experimentele methodologie werkzaam voor de studie van DNM expressie in de bijbal muis met de hoop dat deze informatie zal ruimere toepassing in de karakterisering van alternatieve epididymaire eiwitten vinden en aldus bijdragen aan onze inzicht in de functie van dit belangrijke element van het mannelijk voortplantingssysteem. Specifiek, beschrijven we de ontwikkeling van robuuste methodologie voor het labelen van de immunofluorescentie doel eiwitten in paraffine-ingebedde epididymaire secties en de daaropvolgende opsporing van de ruimtelijke spreiding van deze eiwitten via immunofluorescentie microscopie. Documenteren we verder onze onlangs geoptimaliseerde protocollen22 voor de isolatie en de karakterisering van epididymosomes; kleine exosome-achtige blaasjes die vormen belangrijke elementen van het epididymaire secretoire profiel en lijken te houden een prominente rol bij de bevordering van sperma rijping23. Als een complementaire aanpak beschrijven we ook de immunofluorescentie detectie van doel eiwitten in een cellijn vereeuwigd muis caput epididymaire epitheliale (mECap18) en het gebruik van deze hulpbron als een model om te verkennen van de regulering van de epididymaire secretoire activiteit in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures waarbij dierlijk weefsel-collectie zijn door de Universiteit van Newcastle Animal Care en ethisch comité goedgekeurd.

1. immunofluorescentie kleuring van de paraffine-ingebedde epididymaire secties (figuren 1 en 2)

  1. Onmiddellijk na de euthanasie van volwassen muizen via CO2 inademing (Zwitserse muizen, meer dan 8 weken oud), zorgvuldig ontleden de bijbal (met behulp van chirurgische schaar en pincet) gratis overliggende bindweefsel en vet en onderdompelen in Bouin van fixeer oplossing (> tienmaal volume/weefsel gewicht) voor de fixatie van de overnachting.
  2. Dagelijks wassen van de weefsel met 70% ethanol met 2 × wijzigingen voor 2 dagen en vervolgens uitdrogen door middel van getrapte ethanol (70%, 95% en 100%) in voorbereiding voor infiltratie en insluiten in een blok van paraffine.
  3. Afdeling de paraffineblokken bij een dikte van 4-6 µm en monteren op de dia's ter voorbereiding van de immunofluorescentie kleuring.
  4. Dewax de epididymaire paraffine secties door een voldoende hoeveelheid xyleen toe te voegen aan de dia jar volledig onderdompelen het weefselsectie (3 × 5 min telkens) in een zuurkast.
  5. De weefselsecties hydrateren door de onderdompeling in gesorteerde ethanol oplossingen verdund in gezuiverde H2O (100% ethanol 5 min, 100% ethanol 5 min, 90% ethanol 1 min, 80% ethanol 1 min, 70% ethanol 50% ethanol en 1 min 1 min).
  6. Wassen van de secties in een pot van dia één keer voor 5 min met voldoende fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) volledig onderdompelen het hele weefselsectie (volg deze aanwijzingen voor alle voor alle vervolgwasbeurten kunt).
  7. Decanteren in de oplossing van de gegevensherwinning van passende antigeen (dwz., 10 mmol/L Natriumcitraat, 50 mmol/L Tris pH 10.5 of alternatieve antigeen ophalen oplossing(en), afhankelijk van het antigeen worden gedetecteerd) in een dia rack en magnetron tot koken. Onderdompelen van de dia's in deze oplossing en de weefselsecties onverminderd warmte-geïnduceerde antigeen ophalen voorwaarden geoptimaliseerd voor individuele antilichamen (Zie tabel 1).
    Let op: Zorg ervoor dat de dia's zijn volledig ondergedompeld in de oplossing van de gegevensherwinning van antigeen tijdens het ophalen antigeen.
  8. Verwijder de container van de dia uit de magnetron en koel aan kamertemperatuur.
  9. Spoel de dia's met PBS en gebruik van een viltstift Vloeistofafstotende dia te traceren rond de weefselsectie.
  10. Plaats van de dia's in een bevochtigde container (gemaakt door een bevochtigde weefsel aan de voet van de container) en blokkerende oplossing toepassen (3% BSA/PBS, eerder gefiltreerd door een 0,45 µm filter) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  11. Spoel de dia's één keer met PBS.
  12. Incubeer de secties met passende primair antilichaam verdund tot een experimenteel geoptimaliseerde concentratie in gefilterde 1% BSA/PBS bij 4 ° C's nachts (1:60 voor anti-DNM1, DNM2 en DNM3 antilichamen; 1:100 voor anti-ATP6V1B1 antistof, Zie tabel van materialen voor antilichaam details).
    Nota: Te onderscheiden van niet-specifieke antilichaam-bindende, specifieke is het noodzakelijk te nemen strenge negatief (dwz., secundair antilichaam enige, primaire antilichaam preabsorbed tegen het immuniseren van peptide) en positieve controles24.
  13. Rewarm de dia's door te plaatsen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  14. Wassen van de dia's 3 × met PBS op een schudden platform (60 rpm) voor elke 10 min.
  15. Incubeer de secties met passende secundair antilichaam verdund in 1% BSA/PBS (gefiltreerd door een 0,45 µm filter) bij 37 ° C gedurende 1 h (1:400 verwatering voor alle secundaire antilichamen, Zie Tabel van materialen voor antilichaam details).
    Let op: Houd de container van de dia in het donker uit deze stap verder. Voor de dubbele etikettering, kies een compatibel combinatie van secundaire antilichamen (dwz., secundaire antilichamen moeten naar voren zijn gebracht in verschillende soorten).
  16. Wassen van de dia's 3 × met PBS op een schudden platform (60 rpm) voor elke 10 min.
  17. Counterstain van de secties met propidium jodide (PI, 7.48 μmol/L) of 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur op het etiket van de celkern.
  18. Wassen van de dia's tweemaal met PBS op een schudden platform (60 rpm) voor elke 5 min.
  19. Monteren van de secties met 10% Mowiol 4-88 bereid in een oplossing van 30% glycerol in 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) en 2,5% 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-octaan.
  20. Zegel van het dekglaasje aan met nagel lak en de dia's bij 4 ° C voor toekomstige observatie opslaan.
    Let op: Het is raadzaam voor het uitvoeren van de beeldvorming van de dia's zo spoedig praktisch na de voorbereiding om te voorkomen dat overmatig verlies van fluorescentie.

2 isolatie van Epididymosomes van de muis Caput bijbal (figuur 3)

  1. Onmiddellijk na de euthanasie van volwassen muizen via CO2 inademing (Zwitserse muizen meer dan 8 weken oud), perfuse hun therapieën met PBS (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) om te minimaliseren van de verontreiniging van het bloed van epididymaire weefsel.
    Let op: bloedplasma bevat diverse populaties van exosomes, die van vergelijkbare grootte tot epididymosomes25. De werkzaamheid van bloed klaring van epididymaire weefsel kan worden betreden via de inspectie van het eerste segment, een zeer gevacuoliseerd epididymaire segment ligt proximaal aan het caput-segment (dwz., zone 1 in figuur 1A)
  2. Zorgvuldig ontleden de bijbal kosteloos bovenliggende vet en bindweefsel, en spoelen met gemodificeerde Biggers, Whitten en Whittingham medium (BWW; pH 7.4, osmolaliteit van 300 mmol/kg water26,27) om eventuele voor oppervlak bloed besmetting.
  3. Wissen van het epididymaire weefsel te verwijderen overtollige media, ontleden de bijbal caput (dwz., zones 2-5 in figuur 1A) en transfer naar een verse petrischaal (35 × 10 mm) met BWW medium. Zorg ervoor dat het bedrag van medium voldoende voor de definitieve nuttige toepassing is.
    Opmerking: Voor 6 caput epididymides, is het aanbevolen om het gebruik van 1.1 mL van het medium dat voor een herstel van ~ 900 µL, die vervolgens gelijkmatig verdeeld wordt en toegepast bovenop 2 vooraf bereid verlopen (zie stap 2.9).
  4. Maak een aantal kleine insnijdingen in de caput-weefsel met een scheermesje. Gehakt van het weefsel niet en dus geen verontreiniging van het monster met buitensporige cytosolische inhoud. Incubeer de plaat met het weefsel met milde agitatie bij 37 ° C gedurende 30 minuten om vrij de luminal inhoud te geven.
  5. De resulterende opschorting door 70 µm membranen te verwijderen van de cellulaire puin te filteren.
  6. Vang het filtraat en dit onverminderd de opeenvolgende centrifugeren stappen bij 4 ° C met toenemende snelheid om het elimineren van cellulaire puin (dwz., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min elke; 17.000 × g gedurende 20 minuten, en ten slotte 17.000 × g voor een extra 10 min of tot geen pellet na het centrifugeren ontstaat).
    Let op: Het is belangrijk om te beoordelen van de kleur van de pellet na de eerste 500 × g centrifugeren stap om ervoor te zorgen dat minimale bloed besmetting aanwezig is. Gooi monsters waarin deze pellet roze kleuring wordt weergegeven.
  7. Discontinue iodixanol verlopen (bestaande uit 40%, 20%, 10%, 5% lagen) bereid door verdunning van een dichtheid kleurovergang medium (bestaande uit 60% (m/v) waterige iodixanol) met een oplossing van 0,25 mol/L sacharose en 10 mmol/L Tris (pH 7.5).
  8. Bereid het verloop in een ultracentrifuge buis (11 × 35 mm), met elke fractie van 450 µL (Figuur 3). Inspecteer visueel of het verloop na de toepassing van elke fractie om ervoor te zorgen dat de interfaces met succes worden gevormd tussen elke laag vóór het laden van het epididymaire monster van vloeistof. Elke kleurovergang vers bereiden op de dag van gebruik, echter, het epididymaire luminal vloeistof monster kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 2 uur vóór het laden.
  9. Voeg voorzichtig 450 µL van epididymaire luminal vloeibare suspensie (overeenkomend met het verzamelde materiaal van de caput van 3 epididymides) bovenop van een enkele verloop.
  10. Ultracentrifuge de hellingen bij 160.000 × g bij 4 ° C voor 18u.
    Let op: Aangezien deze centrifugeren wordt uitgevoerd bij zeer hoge snelheid, alle ultracentrifuge buizen moeten worden gekoppeld en evenwichtige juist. Controleer de buizen om ervoor te zorgen dat ze vrij zijn van zichtbare schade die hun integriteit in gevaar kan brengen.
  11. Zachtjes verwijderen 12 gelijke breuken (elk bestaande uit 185 µL) vanaf de bovenste laag en vordert naar de onderkant van het verloop. Zwembad de gelijkwaardige breuken verhaald van elk verloop indien van toepassing (maximaal twee verlopen).
    Opmerking: Muis epididymosomes zijn het meest hoogverrijkt in breuken 9-11,22, Zie Figuur 4 en discussie.
  12. Na het herstel en de bundeling van breuken 9 – 11: Verdun in 2 mL PBS en ultracentrifuge de monsters bij 100.000 × g bij 4 ° C voor 3 h (13 × 56 mm buis) aan de epididymosomes pellet.
    Let op: Aangezien de epididymosome pellet moeilijk worden kan te zien, er voor zorgen dat de oriëntatie van de buizen is opgemerkt als ze zijn geplaatst in de rotor en markeren van de buis om aan te geven van de vermoedelijke positie van de epididymosome pellet. Ervoor zorgen dat elke buis een voldoende volume bevat (dwz., meer dan 50% van de totale capaciteit) te sluiten voor het gevaar van instorting van de buis.
  13. Zorgvuldig gecombineerd en verwijder het supernatant zonder verstoring van de epididymosome pellet.
  14. Beoordelen van de zuiverheid van de epididymosome (Figuur 4).
  15. Resuspendeer de pellet epididymosome tot gewenste medium volgens de stroomafwaartse toepassing(en). Bijvoorbeeld, wordt BWW medium meestal gebruikt voor de experimenten met co incubatie met spermacellen of als alternatief een passende lysis-buffermengsel ter voorbereiding van de resolutie van de epididymaire Proteoom via SDS-pagina.

3. immunofluorescentie Staining van mECap18 cellen

  1. Voorbereiding van de steriele coverslips (om te worden uitgevoerd in een cel cultuur kap)
    1. Geniet van de coverslips (12 × 12 mm) in 70% ethanol voor 10 min en ontsmetten door drogen onder hoge temperatuur boven een ethanol-lamp.
    2. Cool het dekglaasje aan voor 10 s vóór de overbrenging naar een 12 goed plaat.
    3. Toepassing van steriele poly-L-lysine oplossing regelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te dekken van het dekglaasje aan.
    4. Negeren van de poly-L-lysine-oplossing en spoel het dekglaasje aan met steriele H2O of passend medium.
  2. Voorbereiding mECap18 cellen
    1. Passage de aliquots van 2 × 105 mECap18 cellen in elk putje van de 12 goed plaat met de coverslips.
    2. Cultuur van de cellen met mECap18 cel middellange (DMEM aangevuld met 1% L-glutamine, 1% natrium pyruvaat 1% penicilline/streptomycine en 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN) met 10% foetaal kalfsserum (FBS) in een incubator 37 ° C onder een sfeer 5% CO2 's nachts.
    3. Zodra de cellen zich houden aan het dekglaasje aan, het negeren van het medium en spoel de cellen tweemaal met PBS.
    4. Voeg een voldoende hoeveelheid 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS te onderdompelen van de gehele dekglaasje aan en het vaststellen van de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    5. Negeren van de PFA-oplossing en spoel de coverslips twee keer in PBS.
  3. Immunofluorescentie kleuring
    1. MECap18 cellen door onderdompeling in 0,1% permeabilize Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten.
    2. Spoel de coverslips met PBS.
    3. Blokkeren van mECap18 cellen met 3% BSA en ga verder met immunolabeling van cellen met behulp van gelijkwaardige protocollen voor epididymaire weefselsecties omschreven.

4. isolatie van proteïnen van geconditioneerde cel kweekmedium

  1. Collectie van geconditioneerde cel kweekmedium
    1. Passage aliquots van 4 × 105 mECap18 cellen in elk putje van 6 goed plaat met mECap18 cel medium aangevuld met 10% FBS gedurende 24 uur.
    2. MECap18 cellen driemaal wassen met mECap18 cel medium (bereid zonder FBS) Schakel residuele FBS en alle geassocieerde eiwit contaminanten.
    3. Voeg 1,5 mL van mECap18 cel medium (bereid zonder FBS) toe aan elk putje en incubeer met mECap18 cellen voor 12u in een incubator 37° C minder dan 5% CO2.
      Opmerking: mECap18 cellen bij deze stap kunnen voor verschillende doelgroepen antigenen volgens de proefopzet worden beoordeeld.
    4. Na een incubatieperiode van 12u, door de cel medium en centrifuge bij 2.000 × g gedurende 10 minuten te verwijderen alle cellulaire puin te verzamelen.
      Opmerking: De duur van incubatie kan worden gewijzigd overeenkomstig de experimentele ontwerp/eindpunt beoordeling en als tegenprestatie van de cel tolerantie voor toegepaste treatment(s). Het is aanbevolen om het aanpassen van de timing van incubatie op basis van specifieke experimentele regimes om ervoor te zorgen dat optimale resultaten worden bereikt.
    5. Beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen van mECap18 via de toepassing van een standaard trypan blauwe uitsluiting assay28. Gooi alle materiaal waarin levensvatbaarheid van de cellen is gedaald onder de 90% te elimineren van vertekening geïntroduceerd door eiwitten uit dode of stervende cellen uitgebracht.
    6. Eiwitten van cel medium als volgt te isoleren of te bewaren medium bij-80 ° C.
  2. Isolatie van de eiwit (te worden uitgevoerd in een zuurkast)
    1. 20% volume van gekoeld 100% trichloorazijnzuur aan 80% volume geconditioneerde cel medium te precipiteren de eiwitten vrijgesteld van de gekweekte mECap18 cellen toevoegen. Incubeer bij 4 ° C's nachts met het mengen van de constante.
    2. Na de incubatie, pellet neergeslagen eiwitten door middel van centrifugeren (17, 000 × g, 4 ° C gedurende 10 minuten).
      Opmerking: Als gevolg van de beperkte hoeveelheid eiwit moeten worden uitgescheiden in het medium, het is mogelijk dat de pellet zal niet worden gemakkelijk gevisualiseerd na het centrifugeren. Daarom is het noodzakelijk om te goed oriënteren de buis vóór het centrifugeren en wees voorzichtig niet te verstoren de aanstaande pellet locatie tijdens het verwijderen van de bovendrijvende substantie.
    3. Verwijder het supernatant en wassen van de pellet tweemaal met gekoeld aceton voorafgaand aan het opnieuw centrifugeren (17, 000 × g, 4 ° C gedurende 10 minuten).
    4. Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant voordat de droging van eventuele resterende aceton in een zuurkast.
    5. Resuspendeer de pellet eiwit in een juiste extractie buffer in voorbereiding voor eindpunt analyse te detecteren volledige secretoire eiwit profielen en/of individuele doel eiwitten (bv., SDS-pagina, immunoblotting).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 en Figuur 2 Showresultaten vertegenwoordiger van immunofluorescentie lokalisatie van DNM in de muis caput bijbal. Elk van de drie DNM isoforms onderzocht display duidelijke lokalisatie profielen. Dus wordt DNM1 gekenmerkt door relatief bescheiden diffuus labeling van de epididymaire cellen in de hele van het eerste segment en caput bijbal (figuur 2A). Daarentegen, de DNM2 is...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studies opgenomen het gebruik van Bouin van vaste epididymaire weefsel dat paraffine insluiten en vectorafbeeldingsbestanden standaardprotocollen had ondergaan. Bouin van kleefpoeders oplossing bestaat uit een mengsel van formaldehyde, picrinezuur en azijnzuur, met elke component die een specifieke en complementaire functie hebben. Dus, formaldehyde reageert met primaire amines vormen van eiwit cross-links pikrinezuur langzaam dringt het weefsel zouten vormen en vandaar stolling van fundamentele eiwitten en omgekeer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs wil erkennen de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad van Australië Project Grant APP1103176 ter ondersteuning van dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dynamin 1 antibodyAbcamab108458Host species: Konijn, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Dynamin 2 antibodySanta Cruzsc-6400Host species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Dynamin 3 antibodyProteintech14737-1-APHost species: Konijn, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
ATP6V1B1 antibodySanta Cruzsc-21206Host species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
CD9 antibodyBD Pharmingen553758Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoklonaal
Flotillin-1 antibodySigmaF1180Host species: Konijn, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
ALOX15 antibodyAbcamab80221Host species: Konijn, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
TUBB antibodySanta Cruzsc-5274Host species: Muis, Isotype: IgG, Class: monoklonaal
PSMD7 antibodyAbcamab11436Host species: Konijn, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Konijn Alexa Fluor 488ThermoA11008Host species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Geit Alexa Fluor 488ThermoA11055Host species: Ezel, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Geit Alexa Fluor 594ThermoA11058Host species: Ezel, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Konijn HRPMilliporeDC03LHost species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
Anti Muis HRPSanta Cruzsc-2005Host species: Geit, Isotype: IgG, Class: polycloonaal
4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)SigmaD9564
propidiumjodide (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Bovine serum albumine (BSA)SigmaA7906
fetaal bovien serum (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
penicillin/streptomycinThermo15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-on-C-IIINSigmaA8380
natriumpyruvaatThermo11360-070
Trypsine-ethyleen-diaminetetraazijnzuur (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldehyd (PFA)EMS15710
XyleenVWR Chemicals1330-20-7
EthanolVWR Chemicals64-17-5
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)SigmaP4417
NatriumcitraatSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycerolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaanSigmaD2522
Poly-L-lysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
TrypanblauwSigmaT6146
TrichloroazijnzuurSigmaT9159
AcetonAjax FinechemA6-2.5 L GL
SucroseSigmaS0389
Poly (vinylalcohol)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep DichtheidsgradiëntmediumSigmaD1556
FluorescentiemicroscoopZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugesEppendorf5424R
IncubatorHeracell150
Grote Orbital ShakerRatekOM7
MicrogolfovenLGMS3840SR /00
Lab pH MeterMeterLabPHM220
Vloeistofafstotende glijmiddelDaido SangyoMini
DekglasThermo586
6 wel plaatCELLSTAR657160
12 wel plaatCELLSTAR665180

Referenties

  1. Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage. Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).
  2. Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).
  3. Aitken, R. J., et al. Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation. Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).
  4. Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa. The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).
  5. Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. The epididymis. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).
  6. Nixon, B., et al. Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes. Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).
  7. Cleland, K. The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis. Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).
  8. Belleannée, C., et al. Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis. Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).
  9. Turner, T. T. De Graaf's thread: the human epididymis. Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).
  10. Holland, M. K., Nixon, B. The specificity of epididymal secretory proteins. Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).
  11. Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. Epididymal markers in human infertility. Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).
  12. Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation. Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).
  13. Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis. Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).
  14. Lareyre, J. J., et al. A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice. Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).
  15. Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis. Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).
  16. Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation. Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).
  17. Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).
  18. Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38. Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).
  19. Jelinsky, S. A., et al. The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides. Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).
  20. Johnston, D. S., et al. The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1. Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).
  21. Zhou, W., et al. Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis. Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).
  22. Reilly, J. N., et al. Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome. Scientific reports. 6, (2016).
  23. Sullivan, R. Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage. Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).
  24. Reid, A. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation. The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).
  25. Danesh, A., et al. Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro. Blood. 123 (5), 687-696 (2014).
  26. Anderson, A. L., et al. Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing. Genomics data. 6, 208-211 (2015).
  27. Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. Methods in mammalian embryology. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).
  28. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).
  29. Elkjær, M. -L., et al. Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain. Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).
  30. Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis. Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).
  31. Isnard-Bagnis, C., et al. Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).
  32. Rojek, A. M., et al. Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).
  33. Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).
  34. Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification. Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).
  35. Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3. Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).
  36. Feugang, J. M., et al. Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46(2015).
  37. Gullberg, M., et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).
  38. Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis. Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).
  39. Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid. Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).
  40. Eickhoff, R., et al. Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation. Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).
  41. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).
  42. Hutcheon, K., et al. Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa. RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).
  43. Bennett, P. Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes. Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).
  44. Nixon, B., et al. Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells. PloS one. 10 (8), e0135605(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Immunofluorescentiemicroscopieisolatie van epididymosomenultracentrifugatiegradiëntmECap18-cellijnimmunofluorescentielabelinganalyse van proteïnesecretieSDS-PAGE-immunoblottingtrichloroazijnzuurprecipitatiedissectie van epididymal weefsel
Analyse van epididymaire eiwitsynthese en afscheiding
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.