Hier presenteren we een protocol om een nier cortex extracellulaire matrix afkomstige hydrogel te behouden van de inheemse nier extracellulaire matrix (ECM) structurele en biochemische samenstelling. Het fabricageprocédé en de toepassingen daarvan worden beschreven. Tot slot, een perspectief over het gebruik van deze hydrogel ter ondersteuning van de nier-specifieke cellulaire en weefsels regeneratie en bioengineering wordt besproken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fabriceren van een nier Cortex extracellulaire Matrix afkomstige Hydrogel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. Huidige synthetische hydrogels bieden robuuste mechanische ondersteuning voor in vitro cultuur van de cel, maar gebrek aan de nodige eiwitten en ligand samenstelling om te ontlokken fysiologische gedrag uit cellen. Dit manuscript wordt een fabricage methode voor een nier cortex ECM-afgeleide hydrogel beschreven met goede mechanische robuustheid en ondersteunende biochemische samenstelling. De hydrogel is vervaardigd door mechanisch homogenisatie en solubilizing decellularized menselijke nieren cortex ECM. De matrix behoudt inheemse nier cortex ECM eiwit ratio's, maar ook het inschakelen van gelering aan fysiologische mechanische stiffnesses. De hydrogel fungeert als een substraat op welke nier cortex-afgeleide cellen onder fysiologische omstandigheden kunnen worden gehandhaafd. Bovendien kan de hydrogel samenstelling worden gemanipuleerd om het model van een zieke omgeving waarmee de toekomstige studie van nierziekten.
Inleiding
Extracellulaire matrix (ECM) biedt belangrijke biofysische en biochemische signalen te handhaven van de weefsel homeostase. De complexe moleculaire samenstelling regelt zowel structurele en functionele eigenschappen van weefsel. Structurele proteïnen cellen voorzien van ruimtelijke bewustzijn en zorgen voor de hechting en migratie1. Afhankelijke liganden interactie met cel oppervlakte receptoren waarmee cel gedrag2. Nier ECM bevat een overvloed aan moleculen waarvan de samenstelling en structuur hangt af van de anatomische locatie, ontwikkelingsstadium en ziekte staat3,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijke nieren waren geïsoleerd door LifeCenter Northwest na ethische richtsnoeren die door de vereniging van orgel aanbestedingen organisaties. Dit protocol volgt dierlijke zorg en cel cultuur richtsnoeren door de Universiteit van Washington.
1. bereiding van menselijke nierweefsel
- Bereiding van de oplossing van de decellularization
- Steriliseren een 5000 mL-bekerglas en een roer-bar van 70 x 10 mm.
- Meng 1:1000 (gewicht: volume) natrium dodecyl sulfaat (SDS) in de gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water in het bekerglas. Laat de oplossing op een bord roer bij ongeveer 200 omwentelingen per minuut ge....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De kECM hydrogel biedt een matrix voor cultuur van de cel van de nier met dezelfde chemische samenstelling als de inheemse nier-communicatie. Om de hydrogel, is cortex nierweefsel mechanisch geïsoleerd uit een hele nier orgel en in blokjes gesneden (Figuur 1). Decellularization met een chemische schoonmaakmiddel (figuur 2A.1-A.3) gevolgd door spoelen met water om detergent deeltjes (figuur 2A.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Matrices bieden belangrijke mechanische en chemische signalen die cel gedrag. Synthetische hydrogels kunnen ondersteunen complexe 3-dimensionale patronen, maar niet aan de uiteenlopende extracellulaire aanwijzingen gevonden in fysiologische matrix microenvironments geven. Hydrogels afgeleid van inheemse ECM zijn ideale materialen voor zowel in vivo en in vitro studies. Eerdere studies hebben gebruikt decellularized ECM hydrogels jas synthetische biomaterialen om te voorkomen dat de host immunologische r.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs wil erkennen de Lynn en Mike Garvey Imaging laboratorium op het Instituut voor regeneratieve geneeskunde, stamcel en LifeCenter NorthWest. Zij wil ook de financiële steun van de National Institutes of Health subsidies, UH2/UH3 TR000504 (naar J.H.) en DP2DK102258 (voor Y.Z.), NIH T32 opleiding subsidie DK0007467 (R.J.N.) en een onbeperkte geschenk van de Northwest nier centra aan de Nier onderzoek instituut.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Voorbereiding van nierweefsel | |||
| 5000 mL Beker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Steriel H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Roerbar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuümfilter | VWR | 97066-202 | |
| Roerplaat | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Pincet | Sigma-Aldrich | F4642 | Elk soortgelijk pincet kan worden gebruikt |
| Hemostattang met schaargreep | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissectieschaart | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpelgreep, Nr. 4 | VWR | 25859-000 | Elke soortgelijke scalpelgreep kan worden gebruikt |
| Scalpelmes, Nr. 20 | VWR | 25860-020 | Elke soortgelijke scalpelmes kan worden gebruikt |
| Roerbar (38,1 x 9,5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbeerbare onderlegger | VWR | 82020-845 | |
| Petrischaal (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclaveerbare biogevarenzak | VWR | 14220-026 | |
| Steriel celzeefje (40 µm) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Water van celkweekkwaliteit | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Vrijstaande buis | VWR | 89012-778 | |
| Fabricage van ECM-gel | |||
| Weefselhomogenisator | Polytron | PCU-20110 | |
| Vriesdroger | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL glazen scintillatieviaal en dop | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Roerbar (15,9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsine uit varkensmaagslijmvlies | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0,01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Verdun tot 0,01 N HCl met cell cultuur water |
| Nier-ECM-gelatinisatie | |||
| 1 N NaOH (Steriel) | Sigma-Aldrich | 415413 | Verdun tot 1 N in celkweekkwaliteit water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conische buis | ThermoFisher | 339651 | |
| Celkweekmedium | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibioticum-antimycoticum 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Natriumpyruvaat oplossing (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Spuit | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatule | Sigma-Aldrich | Z193208 |
Referenties
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
