Methodenartikel

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

DOI:

10.3791/58332

⸱

12 oktober 2018

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) zijn een veelbelovende platform voor immuun modulatie vanwege hun krachtige vermogen te stimuleren van T-cellen. Acellulair substraten bieden belangrijke voordelen ten opzichte van cel-gebaseerde aAPC, met inbegrip van nauwkeurige controle van signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak van de aAPC om te differentiëren van de interacties met T-cellen. aAPC opgebouwd uit anisotrope deeltjes, met name ellipsvormige deeltjes, is gebleken dat effectiever dan hun sferische tegenhangers op stimulerende T cellen als gevolg van verhoogde bindende en grotere oppervlakte beschikbaar voor T cel contact, evenals opnemen verminderd als niet-specifieke opname- en verbeterde farmacokinetische eigenschappen. Ondanks de toegenomen belangstelling voor anisotropische deeltjes, zelfs geaccepteerd methoden voor het genereren van anisotrope deeltjes zoals dunne-film uitrekken kan lastig zijn te implementeren en te gebruiken reproducibly.

Te dien einde, we beschrijven een protocol voor de snelle en gestandaardiseerde fabrikatie van biologisch afbreekbare anisotrope deeltje gebaseerde aAPC met afstembare grootte, vorm, en signaal presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo, samen met methoden om te karakteriseren van hun grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud, en te beoordelen hun functionaliteit. Deze aanpak voor het fabriceren van anisotrope aAPC is schaalbaar en reproduceerbaar is, waardoor hij ideaal is voor het genereren van aAPC voor 'off-the-shelf' immuuntherapie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kunstmatige antigeen voorstellende cellen (aAPC) is gebleken belofte als immunomodulerende agenten omdat ze een robuuste antigeen-specifieke T cel-reactie kunnen genereren. Essentieel voor deze platforms zijn hun mogelijkheid om efficiënt cruciale signalen voor T-cel activatie. Acellulair aAPC zijn een aantrekkelijk alternatief voor cel-gebaseerde aAPC, omdat ze gemakkelijker en goedkoper te fabriceren, minder uitdagingen tijdens schaalvergroting en vertaling, en risico's van cel-gebaseerde therapieën te verlichten. Acellulair aAPC is ook voorzien van een hoge mate van controle over signaal presentatie parameters en fysieke eigenschappen van het oppervlak zal interfacecomponenten met T cellen1.

aAPC moet een minimum van twee signalen essentieel voor T-cel activatie recapituleren. Signaal 1 biedt antigeen erkenning en treedt op wanneer de T cel receptor (TCR) herkent en houdt zich bezig met een MHC klasse I of II, rekening houdend met zijn cognaat antigeen, culminerend in de signalering via de TCR complexe. Om te omzeilen het vereiste antigeen specificiteit, dragen aAPC systemen vaak een agonistic monoklonaal antilichaam tegen de CD3 receptor, dat nonspecifically de TCR-complex stimuleert. Recombinante vormen van MHC, met name MHC multimeren, hebben ook gebruikt op het oppervlak van aAPC antigeen specificiteit2,3. Signaal 2 is een costimulatory signaal dat T cel activiteit regisseert. Om de costimulatie die nodig zijn voor de T-cel activatie, wordt de CD28 receptor in het algemeen gestimuleerd met een agonistic antilichaam gepresenteerd op het oppervlak van de aAPC, hoewel andere costimulatory receptoren zoals 4-1BB met succes gerichte4 geweest. Signaal 1 en 2 eiwitten zijn meestal geïmmobiliseerd op het oppervlak van stijve deeltjes te synthetiseren van aAPC. Historisch gezien hebben aAPC is vervaardigd uit een verscheidenheid aan materialen, met inbegrip van polystyreen4,5 en ijzer dextran6. Nieuwere systemen gebruiken biologisch afbreekbare polymeren zoals poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) voor het genereren van aAPC die gemakkelijk kan worden gekoppeld om aan te geven van eiwitten, geschikt voor directe toediening in vivo, en kan vergemakkelijken de aanhoudende release van ingekapseld cytokines of oplosbare factoren om uit te breiden van T cel activatie7,8.

Naast de aanwezigheid van eiwitten van de nodige signaal is betrokkenheid van de receptor over een voldoende groot oppervlak tijdens de interactie die aAPC/T cel essentieel voor T-cel activatie. Fysieke parameters van de aAPC zoals grootte en vorm drastisch veranderen hun beschikbare contactpunten en dus invloed hebben op hun vermogen te stimuleren van T-cellen. Micron en middelgrote aAPC gebleken om meer effectief op stimulerende T-cellen dan hun nanoschaal tegenhangers9,10. Nano-aAPC kan echter superieur ook en betere afvoer naar de lymfeklieren die hun prestaties in vivo over micro-aAPC11 verbeteren kunnen. Vorm is een andere variabele van belang in aAPC deeltje gebaseerde systemen. Anisotrope aAPC hebben onlangs aangetoond dat effectiever dan isotrope deeltjes op stimulerende T-cellen, voornamelijk als gevolg van verbeterde interactie met de doelcellen in combinatie met verminderde aspecifieke cel opname. Cellen bij voorkeur binden aan de lange as van de ellipsvormige deeltjes, en de grotere straal van kromming en platter oppervlak zorgen voor meer contact tussen de aAPC en de T cel12. De lange as van de ellipsvormige deeltjes ook ontmoedigt fagocytose, wat resulteert in verhoogde omloop tijd in vergelijking met bolvormige deeltjes na in vivo administratie12,13. Vanwege deze voordelen bemiddelen ellipsvormige deeltjes grotere uitbreiding van antigeen-specifieke T cellen in vitro en in vivo in vergelijking met bolvormige deeltjes, een effect waargenomen bij zowel de micro- en nanoscales12, 13. Er zijn verschillende strategieën te fabriceren anisotrope deeltjes, maar dunne-film uitrekken zich is een eenvoudige, algemeen aanvaarde methode gebruikt voor het genereren van een aantal uiteenlopende particle vormen14. Na de synthese, zijn de deeltjes in films geworpen en uitgerekt in één of twee dimensies bij een temperatuur boven de temperatuur van de overgang glas van het deeltje materiaal. De film wordt dan opgelost om op te halen van de deeltjes. Ondanks de groeiende belangstelling voor anisotropische deeltjes, kunnen huidige benaderingen voor vervaardigen deeltje gebaseerde aAPC zijn meestal beperkt tot isotrope systemen en methoden voor het wijzigen van de particle shape moeilijk uit te voeren, onverenigbaar is met de synthese van bepaalde aAPC strategieën, en gebrek aan nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid15. Onze uitrekkende techniek van dunne-film kan handmatig worden uitgevoerd of op een geautomatiseerde wijze snel genereren anisotrope deeltjes uit een verscheidenheid van biologisch afbreekbare polymeren gesynthetiseerd, uitgerekt tot een gewenste hoogte-breedteverhouding in één of twee afmetingen15.

Op basis van onze eerdere werk, ontwikkeld we een biologisch afbreekbaar deeltje gebaseerde aanpak in combinatie met schaalbare dunne-film uitrekkende technologie om snel genereren aAPC met regelbare grootte en vorm op een gestandaardiseerde manier voor T cel expansie ex vivo of in vivo. Onze eiwit-vervoeging-strategie kan worden gebruikt voor elke expressie gebrachte eiwitten van belang aan carboxylgroepen op het oppervlak van de deeltjes op een gewenste dichtheid, een hoge mate van flexibiliteit te geven aan dit aAPC-systeem koppelen. Ook beschrijven we methoden voor het karakteriseren van de grootte, morfologie en oppervlakte-proteïne inhoud van aAPC, en hun functionaliteit in vitrote evalueren. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden aan immuuncellen ex vivo of in vivo voor allerlei immunotherapeutische toepassingen uit te breiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Johns Hopkins University.

1. fabricage van sferische PLGA deeltjes van afstembare grootte

  1. Voorbereiding van materialen voor deeltje synthese
    1. Bereid 5% w/w polyvinylalcohol (PVA) oplossing.
      1. 500 mL gedeïoniseerd water (DI) toevoegen aan een erlenmeyerkolf met een magnetische roer bar en plaats op de hete plaat roerder bij 500 rpm en monitor temperatuur met thermometer. Cover kolf met zilverpapier ter voorkoming van verdamping.
      2. Wanneer watertemperatuur ongeveer 70 ° C bereikt, 25 g totaal toevoegen van PVA in kleine batches na verloop van tijd wachten op PVA te ontbinden alvorens toe te voegen meer.
      3. Zodra alle PVA wordt ontbonden (meestal 30-60 min), laat oplossing koel en steriele filter. Bewaren bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
    2. Bereiden film gieten oplossing van 10% w/w PVA en 2% w/w glycerol.
      1. 500 mL DI water toevoegen aan een erlenmeyerkolf met een magnetische roer bar. 8 mL glycerol op kamertemperatuur en meng door verpulvering toevoegen.
      2. Plaats de kolf op de hete plaat roerder bij 500 rpm en monitor temperatuur met thermometer. Cover kolf met zilverpapier ter voorkoming van verdamping.
      3. Wanneer de temperatuur van de oplossing bereikt ongeveer 70 ° C, 50 g totaal toevoegen van PVA in kleine batches na verloop van tijd wachten op PVA te ontbinden alvorens toe te voegen meer.
      4. Zodra alle PVA wordt ontbonden (meestal 60 min), laat oplossing koel en steriele filter door middel van een fles-top vacuüm-filtersysteem met een poriegrootte van 0,22 μm. Bewaren bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik.
    3. Bereid een 50 mL 1% w/w PVA-oplossing. Voeg 40 mL DI water en 10 mL van 5% PVA-oplossing (gemaakt in 1.1.1) in een bekerglas van 100-150 mL.
    4. Bereid een 100 mL 0,5% w/w PVA-oplossing. Voeg 90 mL DI water en 10 mL van 5% PVA-oplossing toe aan een 150-250 mL-bekerglas.
    5. Een magnetische roer-bar aan de plaats in een chemische kap op een bord roer bij kamertemperatuur op 500 rpm en 0,5% PVA-oplossing toevoegen.
  2. Microparticle synthese
    1. Weeg 100 mg poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) in een Scintillatie flacon en los in 5 mL dichloormethaan (DCM). Vortex te ontbinden van de PLGA.
    2. Plaats homogenizer in de 50 mL 1% PVA oplossing zodat de homogenizer zo dicht mogelijk bij de bodem van het bekerglas mogelijk zonder aan te raken. Homogenizer inschakelen en aanpassen aan de gewenste snelheid — 3200 rpm voor 5 μm diameter deeltjes, 5000 rpm voor 3 μm, 15.000 rpm voor 1 μm (verhoging van de grootte van de deeltjes van dalingen van de snelheid van homogenisering). Eenmaal op de gewenste snelheid, de PLGA-oplossing toevoegen aan het bekerglas en meng gedurende 1 minuut.
    3. Na homogenisatie, giet de 1% PVA, PLGA microparticle oplossing in de 100 mL 0,5% PVA oplossing op een roer plaat toe en roer gedurende ten minste 4 uur voor verdampend oplosmiddel in een chemische kap.
    4. De deeltjes 3 keer in DI water wassen.
      1. Giet de oplossing deeltje in 50 mL conische buizen en centrifuge op 3000 x g gedurende 5 minuten. Uitstorten supernatant en ongeveer 20 mL DI water toe te voegen.
      2. Resuspendeer deeltjes door vortexing. Zodra geresuspendeerde, conische buizen tot 50 mL met DI water vullen.
      3. Wassen opnieuw de zelfde manier nog tweemaal.
  3. Nanoparticle synthese
    1. Weeg 200 mg PLGA in een flesje van scintillatie en los op in 5 mL van DCM. Vortex te ontbinden van de PLGA.
    2. Plaats een bekerglas met 50 mL 1% PVA in container gevuld met ijs. Breng de sonde ultrasoonapparaat in het bekerglas zo dicht mogelijk bij de bodem mogelijk zonder aan te raken. Beginnen ultrasoonapparaat en onmiddellijk toevoegen PLGA oplossing in het bekerglas. Bewerk ultrasone trillingen ten met een vermogen van 12 W gedurende 2 minuten voor het genereren van nanodeeltjes met een geschatte diameter van 200 nm.
    3. Na ultrasoonapparaat, giet de 1% PVA, PLGA nanoparticle oplossing in een 100 mL 0,5% PVA-oplossing op een roer plaat toe en roer gedurende ten minste 4 uur voor verdampend oplosmiddel in een chemische kap.
    4. Giet de oplossing deeltje in 50 mL conische buizen en centrifuge bij 3000 x g gedurende 5 minuten aan microdeeltjes verwijderen. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en giet in hoge snelheid centrifuge buizen.
    5. De deeltjes 3 keer met DI water wassen. Centrifugeer bij 40.000 x g gedurende 15 minuten. Uitstorten supernatant en resuspendeer in DI water door vortexing. Wassen opnieuw de zelfde manier nog tweemaal.

2. fabricage van polymere deeltjes van afstembare vorm

  1. Na het wassen van PLGA resuspendeer deeltjes driemaal, de deeltjes in ongeveer 1 mL DI water. Voeg de film gieten oplossing aan deeltjes voor definitieve deeltje concentratie van 2,5 mg/mL deeltjes.
  2. Pipetteer het deeltje suspensie in 10 mL aliquots in 75 x 50 mm rechthoekige petrischalen voor het uitrekken van de eendimensionale of in 15 mL aliquots in 100 x 100 mm vierkante petrischalen voor het uitrekken van de twee-dimensionale. Verwijder bubbles door ofwel pipet of duwen bubbels aan de kant en laat de droge overnachting films in een chemische kap.
  3. Zodra de films hebben gedroogd, films uit kunststof gerechten met een pincet te verwijderen en afgesneden randen van films met een schaar. Randen in een conische buis van 50 mL te worden gebruikt als bolvormige deeltjes opslaan.
    1. Het laden van een film op de geautomatiseerde dunne film stretching apparaat door het monteren van een film op aluminium blokken. Voor het uitrekken van de 1D, mount film op aluminium blokken van één as van de brancard (Figuur 2) door het plaatsen van twee korte zijden van de film tussen twee stukken van neopreen rubber. Met behulp van een inbussleutel, schroef de metalen handgrepen op de top van rubber om de film op zijn plaats houden. Mount voor het uitrekken van de 2D, alle vier randen op vier aluminium blokken te rekken op beide assen (Figuur 2).
    2. Meten en registreren van de lengte van de film tussen aluminium blokken op één as voor het uitrekken van 1 D of beide assen voor het uitrekken van 2D. Berekenen van de afstand moet rekken van de film in één of twee richtingen op basis van gewenste fold-stretch.
    3. Plaats van de film-geladen stretching apparaat in een oven bij 90 ° C en breng de film aan temperatuur meer dan 10 minuten. Plaats een groot bekerglas in de oven met een kleine hoeveelheid water.
    4. Rekfolie.
    5. Als stretching is voltooid, het stretching apparaat Verwijder uit oven en laat de film afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    6. Snijd voor het uitrekken van de 1D, de film uit de stretching apparaat aan de randen. Snijd voor het uitrekken van de 2D, ingevuld en opgeslagen het midden vierkant film die wordt gelijkmatig uitgerekt op beide assen. Plaats van films in de conische buisjes met 2 films per buis en negeren de rest van de film.
    7. Ongeveer 25 mL DI water aan elke conische buis en vortex toevoegen totdat de films zijn opgelost.
    8. Zodra de films opgeloste deeltjes 3 keer met DI water wassen zijn.
      1. Voor microdeeltjes, conische buizen naar 50 mL en centrifuge op 3000 x g opvullen voor 5 minuten, uitstorten supernatant, voeg ongeveer 20 mL DI water en vortex aan resuspendeer deeltjes.
      2. Voor nanodeeltjes, overdracht deeltjes tot hoge snelheid centrifuge buizen en centrifugeer bij 40.000 x g gedurende 15 minuten, uitstorten supernatant, voeg ongeveer 20 mL DI water en vortex aan resuspendeer deeltjes.
    9. Na de derde wash, resuspendeer deeltjes in ongeveer 1 mL DI water. Het gewicht van de microcentrifuge-buis en deeltjes toe te voegen aan de buis. Freeze deeltjes in een vriezer-80 ° C voor 1 uur of flash bevriezen in vloeibare stikstof. Zodra bevroren, lyophilize deeltjes 's nachts.
    10. Zodra gelyofiliseerde vorm, wegen van de deeltjes in de buis microcentrifuge en aftrekken opgenomen gewicht van de lege buis om het gewicht van gelyofiliseerd deeltjes te bepalen.

3. oppervlakte-proteïne vervoeging maken kunstmatige antigeen presentatie van cellen

  1. Bereiden 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer. Maak een oplossing van 0,1 M mes in water en breng de pH op 6.0 door titratie met 1M natriumhydroxide (NaOH).
  2. Resuspendeer gelyofiliseerd PLGA/PBAE micro/nanodeeltjes bij 20 μg/mL in MES buffer door vortexing. Vul een polypropyleen microcentrifuge buis met 900 μL van MES buffer en voeg 100 μl van het deeltje oplossing aan de buis.
  3. Bereid EDC/NHS-oplossing. Los 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) in 1 mL MES buffer.
  4. Voeg 100 μl EDC/NHS oplossing aan de deeltjes en vortex te mengen.
  5. Incubeer de buis op een omvormer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  6. Spin down deeltjes op de 5.000 x g voor 5 minuten, of nanodeeltjes op 17.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 1 mL PBS door vortexing (deeltjes) of de sonicating op 2-3 W gedurende 5 seconden (nanodeeltjes).
  7. Toevoegen voor microdeeltjes, 8 μg van het gewenste signaal 1 eiwit, en 10 μg-antimuis CD28 (kloon 37.51) aan de deeltjes. Toevoegen voor nanodeeltjes, 16 μg signaal 1 en 20 μg-antimuis CD28. Toevoegen om het volume in de buis tot 1.1 mL PBS.
  8. Incubeer de buis op een omvormer bij 4 ° C's nachts.
  9. De volgende dag was de deeltjes. Spin down deeltjes op de 5.000 x g voor 5 minuten, of nanodeeltjes op 17.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer deeltjes in 1 mL steriele PBS door vortexing (deeltjes) of ultrasoonapparaat op 2-3 W gedurende 5 seconden (nanodeeltjes). Herhaal dit twee keer.
  10. Resuspendeer de deeltjes op de gewenste concentratie in een kweekvloeistof voor onmiddellijk gebruik. Voor langdurige opslag, resuspendeer deeltjes op 10 mg/mL in een sacharoseoplossing 100 mM. Bevriezen, lyophilize en opslaan van de deeltjes bij-80 ° C.

4. karakterisering en evaluatie van aAPC

  1. Karakterisatie van aAPC grootte en vorm (Figuur 3)
    1. Karakteriseren microparticle grootte en vorm door imaging deeltjes met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM). SEM imaging, verspreid gelyofiliseerd deeltjes op koolstof tape maakt een aluminium overstag en sputter jas met goud-palladium.
    2. Analyseren van grootte en hoogte-breedteverhouding van deeltjes met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.
    3. Om te bepalen deeltjesgrootte, stel schaal met behulp van schaal bar en meten van de diameter van de particle. Herhaal voor ongeveer 100 deeltjes te bepalen van de gemiddelde deeltje-diameter en het genereren van een histogram van de deeltjesgrootte.
    4. Bepalen van de hoogte-breedteverhouding, meet de afstand over de lengteas en de korte as van deeltjes en verdelen lengteas door korte as. Herhaal voor ongeveer 50 deeltjes van elke vorm voor het bepalen van de gemiddelde deeltjesgrootte hoogte-breedteverhouding voor elke shape en genereren van histogrammen.
    5. Nanoparticle grootte en vorm wordt gekenmerkt door imaging deeltjes met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Grootte en hoogte-breedteverhouding van nanodeeltjes met de software van de analyse van de afbeelding zoals beschreven in 5.1.2 analyseren. U kunt ook meten sferische nanoparticle grootte met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS) of nanoparticle analyse (NTA) bijhouden.
  2. Eiwit-vervoeging efficiëntie
    1. Bereiden van aAPC volgens de methoden 1-3, maar in stap 3.7 fluorescently geëtiketteerde signaal 1 eiwit en anti-muis CD28 gebruiken. Na conjugatie en wassen, resuspendeer de aAPC in 1 mL PBS voor een definitieve concentratie van 2 mg/mL aAPC.
    2. Eiwit normen in een zwarte polystyreen 96-Wells-microplate voor te bereiden. 5 μg fluorescently geëtiketteerde signaal 1 eiwit toevoegen aan PBS in het eerste putje van de plaat en maak 10 1:2 verdunnen in PBS op de rij van de plaat. De laatste goed leeg laten. Herhaal deze stap voor het genereren van een andere set van normen met fluorescently geëtiketteerde anti-CD28.
    3. Pipetteer 100 μl van de aAPC oplossing in repliceren putjes van de zwarte polystyreen microplate in drievoud.
    4. Lees de fluorescentie op een afleesapparaat fluorescentie bij de juiste golflengten. Gebruik de fluorescentie lezingen uit de eiwit-normen voor het genereren van standaard curven voor elke fluorescerende antilichamen tegen. Met behulp van de standaard curve, berekenen van de concentraties van signaal 1 en anti-CD28 in elk putje van de steekproef, en vervolgens berekent het bedrag van de oppervlakte-proteïne en vervoeging efficiëntie (figuur 4A, figuur 5A).
  3. Evaluatie van aAPC voor in vitro stimulatie van CD8 + T cellen
    1. B' media voor te bereiden (RPMI medium aangevuld met L-glutamine, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuur oplossing, 1% natrium pyruvaat, 1% MEM vitamine-oplossing, 92 μM β-mercaptoethanol, 10 ng/mL ciprofloxacine en 30 U/mL IL-2.
    2. Offeren een zwart 6 muis via kooldioxide blootstelling.
    3. Oogst de milt van de muis volgens een eerder gangbaar protocol16. Verzamelen van de milt in een conische buis van 50 mL met 10 - 15 mL PBS. Met behulp van een stamper, Prak de milt door een 70 µm cel zeef in een conische buis van 50 mL. Wassen tijdens het Maischen, de zeef met 40 mL PBS.
    4. Draai de splenocytes bij 300 x g gedurende 5 minuten. Giet af het supernatant en resuspendeer de splenocytes in 4 mL Ack Lysing van Buffer lyse van de rode bloedcellen. Voorzien in de buis te zitten ongestoord 1 minuut, voeg dan PBS om het volume in de buis tot 20 mL.
    5. Draai de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten. Giet af het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
    6. Draai de cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer in de gewenste omvang van de scheiding van de cel buffer. Isoleren van CD8 + T cellen van de opschorting van de eencellige met behulp van een CD8 + negatieve selectie T cel isolatie kit, volgens protocol van de fabrikant.
    7. Naar aanleiding van magnetische scheiding, spin van CD8 + T cellen bij 300 x g gedurende vijf minuten en verwijder de scheiding van de cel buffer. Resuspendeer de cellen in 1 mL PBS en cellen tellen. Label cellen met carboxyfluorescein succinyl ester (CFSE) volgens protocol van de fabrikant.
    8. Incubeer 8,333 CD8 + T cellen en 0.0833 mg (of gewenste dosis) van aAPC in 150 μl B' media in ieder putje van een 96 goed U-Weefselkweek behandeld bodemplaat.
    9. Incubeer bij 37 ° C gedurende 7 dagen. Na 3-4 dagen, het kweekmedium te vernieuwen door 75 μL verse medium toe te voegen aan elk putje.
    10. Na 3 dagen incubatie, analyseren CFSE geëtiketteerd cellen op een stroom cytometer om te beoordelen van proliferatie. Elke piek in het histogram stroom cytometry CFSE vertegenwoordigt een generatie van cellen als gevolg van de CFSE-verdunning met elke opeenvolgende celdeling.
    11. Na 7 dagen, door een hemocytometer te gebruiken om te tellen van het aantal cellen in elk putje. Vlek vóór het tellen, dode cellen met een Trypan Blue-oplossing. Dode cellen uitsluiten door de graven van de laatste cel. Normaliseren van de concentratie van de laatste cel op de beginconcentratie voor het berekenen van de vouw-uitbreiding (Figuur 4 en Figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schema voor de geautomatiseerde 2D dunne film stretching apparaat wordt gegeven in Figuur 1. Een schema en een beschrijving voor een 1D-dunne film stretching apparaat wordt gegeven in Ho et al.17 de brancard is opgebouwd uit aluminium onderdelen met behulp van standaard frezen en verspanen van technieken. Vergelijkbaar met de 1D-brancard, de 2D brancard bestaat uit metalen handgrepen en geleidingen. Bidirectionele lood schroeven wo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol gegevens een veelzijdige methode voor de precieze generatie anisotrope polymere deeltjes. De dunne film techniek hier beschreven uitrekken is schaalbaar, zeer reproduceerbaar en goedkoop. Alternatieve technieken voor het genereren van anisotrope deeltjes lijden veel beperkingen, met inbegrip van de hoge kosten, lage doorvoersnelheid en beperkte deeltjesgrootte. De dunne film uitrekken aanpak is ook gunstig omdat de deeltjes zijn aangepast om anisotrope na synthese en, dientengevolge, is compatibel met een br...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ik dank de NSF Graduate Research Fellowship-programma voor steun EBA (DGE-1746891) en KRR (DGE-1232825). RAM bedankt de nationale onderzoek Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) en de Achievement beloningen voor College wetenschappers Fellowship voor steun. De auteurs bedanken de NIH (R01EB016721 en R01CA195503), het onderzoek te voorkomen blindheid James en Carole gratis katalysator Award, en de JHU Bloomberg-Kimmel Instituut voor kanker immunotherapie voor ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% gehydrolyseerdPolysciences, Inc.02975-500
GlycerolSigma-AldrichG9012
Digitale thermometerFlukeN/AModelnaam: Fluke 52 II
Onderdompeling temperatuur sondeFlukeN/AModelnaam: Fluke 80PK 22
Digitale hotplate & roerderBenchmark ScientificH3760-HS
MultipuntroerderThermo Fisher Scientific50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)Sigma-Aldrich719900
DichloormethaanSigma-AldrichD65100
HomogenisatorIKA 0003725001
SonicatorSonics & Materials, Inc.N/AModelnummer: VC 505
Sonicator geluid demping behuizingSonics & Materials, Inc.N/AOnderdeelnummer: 630-0427
Sonicator sondeSonics & Materials, Inc.N/AOnderdeelnummer: 630-0220
Sonicator microtipSonics & Materials, Inc.N/AOnderdeelnummer: 630-0423
HogesnelheidscentrifugeBeckman CoulterN/AModelnummer: J-20XP (uit productie), alternatief model: J-26XP
Hogesnelheidscentrifuge rotorBeckman Coulter369691Modelnummer: JA-17
Hogesnelheids polycarbonaat centrifuge buizenThermo Fisher Scientific3118-005050 mL, schroefdop
Rechthoekige wegwerp petrischaalVWR International25384-32275 x 50 x 10 mm
Vierkante wegwerp petrischaalVWR International10799-140100 mm x 100 mm
LEAF  Gezuiverd anti-muis CD3ε AntilichaamBiolegend100314
InVivoMab anti-muis CD28, clone 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE6383
N-Hydroxysulfosuccinimide natriumzoutSigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 anti-muis CD3 AntilichaamBiolegend100212
APC anti-muis CD28 AntilichaamBiolegend102109
Corning  96 Well Solid Polystyrene MicroplateSigma-AldrichCLS3915platte bodem, zwart polystyreen
Protein LoBind Tubes, 1.5 mLEppendorf22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11875093
Foetaal runderserumSigma-AldrichF4135Hitte geïnactiveerd, steriel gefilterd
CiprofloxacineSigma-Aldrich17850
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-vrij)Biolegend589102
Natriumpyrovaat (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Oplossing (100X)ThermoFisher Scientific11140050
MEM Vitamin Oplossing (100X)ThermoFisher Scientific11120052
CD8a+  T Cell Isolatiekit, muisMiltenyi Biotech130-104-075
CellTrace CFSE Cel ProliferatiekitThermoFisher ScientificC34554
LS KolommenMiltenyi Biotech130-042-401
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotech130-042-302
MACS MultistandMiltenyi Biotech130-042-303
Flow CytometerAccuri C6
Synergy 2 Multi-Detectie Microplaat ReaderBioTek
autoMACS LoopbufferMiltenyi BIotech130-091-221
Cel ZeefThermoFisher Scientific22363548Steriele, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing BufferThermoFisher ScientificA1049201
C57BL/6J (Black 6) MuisThe Jackson Laboratory000664Mannetje, minimaal 7 weken oud
U-Bodem Tissue Cultuur PlatenVWR353227Steriele, 96-wels weefselcultuur behandelde polystyreen platen
40 V DC VoedingProbotixLPSK-4010
PTFE Gecoate DraadMouser602-5858-100-01Dit is voor een 100 ft. spoel maar een gelijkwaardige draad werkt
Stepper Motor DriverProbotixMondoStep5.6
IDC Connector KitProbotixIDCM-10-12
MicrocontrollerProbotixPBX-RF
4A FusesRadio Shack2701026Gelijkewaardige fuses werken ook
DB25 Male naar Male KabelProbotixDB25-6
USB-A naar USB-B KabelStaples2094915Gelijkewaardige kabel werkt ook
8-Pin Amphenol Connectors Male en FemaleMouser654-97-3100A-20-7P en 654-97-3106A20-7S
Stepper MotorProbotixHT23-420-8
Rechterhands LeidingschroefRoton60722
Linkerhands LeidingschroefRoton60723
Schro

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Anisotrope polymere deeltjesPLGA deeltjessyntheserekken van dunne filmsfabricage van ellipso de deeltjesT celactivatie assaytransmissie elektronenmicroscopiescanning elektronenmicroscopieprote neconjugatie effici ntiekant en klare immunotherapie

Gerelateerde artikelen